随着现代工农业的飞速发展和矿产资源的大规模开发, 生态环境特别是水体中重金属污染越来越严重。海水中适量的重金属元素对海洋生物不存在有害影响, 有些重金属甚至作为藻类正常生长和新陈代谢所必须的微量营养元素, 但当其含量过高时就会给藻类造成危害并产生污染, 且随污染程度的不同对藻类的影响也不同^[1-6]。重金属作用于藻类的毒性研究已成为污染生态学的研究热点之一^[7]。Cu²⁺作为一种重要的毒性污染物, 其作用特点是具有明显累积性, 过量的Cu²⁺会对藻类生长产生毒害作用。不同学者对大型海藻材料在Cu²⁺胁迫处理后生长、光合及酶活性变化等生理响应进行了研究^[8-10]。朱喜锋^[11]对离体叶绿体的研究表明, 铜可以参与光合作用的电子传递, 光合磷酸化和非光合磷酸化以及多种叶绿素酶的合成过程, 抑制羧化酶等酶的活性等。Giill等^[12]研究表明过量的Cu²⁺会抑制植物光合作用和色素合成。

孔石莼(Ulva pertusa), 隶属于绿藻门石莼科, 俗称海白菜、海菠菜等, 常被用于造纸和饲料^[13]。鼠尾藻(Sargassum thunbergii), 属于褐藻门(Phaephyta), 营养价值高, 是海参的天然饵料^[14]。孔石莼及鼠尾藻均栖息于潮间带中潮带岩礁上或石沼内, 由于其特殊的地理位置, 海水重金属污染是其不可避免要应对的环境压力。然而迄今为止, 鲜见孔石莼及鼠尾藻对重金属Cu²⁺胁迫的生理代谢响应方面的研究报道。本文以孔石莼及鼠尾藻为试材, 对Cu²⁺胁迫下2种藻类的叶绿素含量、光合生理特性和ATP酶活性进行分析, 比较探讨了不同海藻对重金属的生理响应, 以期为了解海藻生理机能及代谢过程与环境条件之间的相互关系及研发海洋环境污染的监测途径提供一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料的采集和处理

孔石莼和鼠尾藻于2017年5月采自山东烟台月亮湾潮间带地区, 选择健康、大小和形态较一致的鲜活海藻, 迅速带回实验室, 用消毒海水反复冲洗, 去除可见的沉积物及附生物。孔石莼切成3 cm×3 cm藻片, 约30 g鲜质量作为一个处理, 置于直径为50 cm, 盛有2.0 L灭菌海水的玻璃缸中培养(温度为20~25℃; 自然光照, 光照周期为12L︰12D)。鼠尾藻选取生长状况一致的藻体, 同样置于玻璃缸中充气培养, 海水每日更换。

1.2 Cu²⁺胁迫处理

经过3 d的预培养后, 海藻材料接受Cu²⁺胁迫处理。将CuSO₄·5H₂O溶于灭菌海水中得到Cu²⁺处理梯度浓度。实验设置4个Cu²⁺浓度处理, 分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L, 不添加Cu²⁺的灭菌海水作为对照组。试验周期为6 d。实验所有处理均设置3次重复。

1.3 光合特征指标的测定

光合色素含量的测定采用Lichtenthaler的方法^[15], 通过紫外-可见分光光度计测量分析。

1.4 叶绿素荧光参数的测定

采用脉冲调制式叶绿素荧光仪(Junior-PAM)对各组藻类叶片的叶绿素荧光参数进行测定。

1.5 Na⁺K⁺-ATP酶(Na⁺K⁺-ATPase)和Ca²⁺ Mg²⁺-ATP酶(Ca²⁺Mg²⁺-ATPase)活性测定

使用南京建成生物工程研究所购买的ATP酶试剂盒测定。

1.6 数据分析

运用SPSS19.0统计软件对各数据值均值进行相关性分析及单因素方差分析。结果以“均值±标准差”表示。本文图表中的^*表示数值之间差异显著(P < 0.05), 图表中的^**表示差异极显著(P < 0.01)。

2 结果与分析 2.1 Cu²⁺对孔石莼和鼠尾藻光合色素含量的影响

研究结果表明, 随着Cu²⁺浓度的增加, 除了鼠尾藻叶绿素b(Chl b)含量没有明显变化外, 鼠尾藻和孔石莼的叶绿素a(Chl a)、类胡萝卜素(Car)以及孔石莼的Chl b含量均显著下降(图 1)。当处理最高浓度为2 mg/L时, 孔石莼的Chl a、Chl b及Car的含量分别降为对照组的50.0%、55.3%及46%, 鼠尾藻Chl a、Chl b、Car的含量依次降为对照组的59.3%、70.0%、58.0%;铜胁迫下孔石莼及鼠尾藻的光合色素含量均有不同程度的下降, 且孔石莼的3种光合色素含量在最高处理浓度下降低幅度均高于鼠尾藻。对于孔石莼, 最高Cu²⁺浓度处理下, 3种叶绿素含量与对照间差异达极显著水平(P < 0.01), 其Chl a、Car对照组与其他处理组均存在显著差异(P < 0.05);对于鼠尾藻, 其Chl a及Car对照组与其他处理组均存在显著差异(P < 0.05), Chl b对照组与其他处理组无显著性差异(P > 0.05)。

2.2 Cu²⁺对孔石莼和鼠尾藻叶绿素荧光参数的影响

对孔石莼及鼠尾藻各叶绿素荧光参数变化的分析可知(图 2), 2种藻类的叶绿素荧光参数alpha、rETRm、IK、F_v/F_m在Cu²⁺胁迫下总体呈现下降趋势。2 mg/L Cu²⁺处理时, 孔石莼的叶绿素荧光参数值alpha、rETRm、IK、F_v/F_m分别降为对照组的73.9%、42.2%、56.9%及83.8%, 与对照组相比具有极显著差异(P < 0.01);鼠尾藻在最高Cu²⁺浓度胁迫条件下, 各处理组的叶绿素荧光参数值与对照间差异达显著水平(P < 0.05), alpha、IK、F_v/F_m 3组叶绿素荧光参数分别降为对照的81.4%、73.8%及88.2%, 与对照间的差异均达到极显著水平(P < 0.01)。显然随着Cu²⁺浓度的增加, 2种藻类的各荧光参数值显著降低, 且孔石莼在最高离子浓度下表现的受抑程度更加严重。

2.3 Cu²⁺对孔石莼和鼠尾藻Na⁺K⁺-ATP酶、Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶活性的影响

孔石莼及鼠尾藻在不同浓度Cu²⁺处理后, 体内Na⁺K⁺-ATP酶活性变化如图 3所示。由图 3可知, 铜胁迫后与对照相比, Na⁺K⁺-ATP酶活性总体上呈现降低趋势, 各处理的酶活性与对照间差异达显著水平; 而当Cu²⁺质量浓度进一步增大为2 mg/L时, 孔石莼的Na⁺K⁺-ATPase活性降至对照组的43.2%, 二者差异达到极显著水平(P < 0.01);鼠尾藻各处理中酶活性均处于较低水平, 与对照间均达到极显著差异(P < 0.01)。

由孔石莼及鼠尾藻Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶活性对不同质量浓度Cu²⁺处理的响应变化可知, 孔石莼比鼠尾藻具有较高的Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶基础活性。与Na⁺K⁺-ATP酶活性变化趋势相似, 孔石莼及鼠尾藻Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶活性均在Cu²⁺处理后显著下降, 但孔石莼在胁迫条件下其Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶活性降低则更为显著, 与对照差异均达到极显著水平(P < 0.01)。

2.4 Cu²⁺胁迫下对孔石莼和鼠尾藻生理指标间的相关性分析

对2种海藻的生理指标分别进行相关性分析(表 1, 表 2), 结果表明Cu²⁺浓度与孔石莼alpha及鼠尾藻rETRm相关性不显著, 与鼠尾藻Chl b、alpha、IK表现为显著负相关(P < 0.05), 与2种海藻的Chl a、Car、F_v/F_m、Na⁺K⁺-ATPase、Ca²⁺Mg²⁺-ATPase呈极显著负相关(P < 0.01), 其中F_v/F_m与光合色素含量呈显著或极显著正相关, 且与胁迫程度的相关性极高(R=-0.935; R=-0.973), 可以作为孔石莼及鼠尾藻在Cu²⁺胁迫下光合作用变化的有效评价指标。

3 讨论

叶绿素是植物进行光合作用的基础物质, 植物受到逆境胁迫时, 各种生理过程都会受到影响, 从而直接或间接影响其含量, 测定叶绿素含量是表征植物生长状况的重要标志^[16]。Cu²⁺兼具营养和毒害作用, 是植物生长的必需微量元素, 适当的Cu²⁺有助于叶绿素的形成与稳定, 但其浓度过高会使细胞代谢发生紊乱对植物产生严重的毒害作用^[17]。Brown等^[18]研究认为, 重金属对藻类光合色素含量的影响表现为低浓度能够促进色素含量水平的上升, 而高浓度则抑制叶绿素的合成, 导致其含量降低, 并抑制光合作用。吕利云^[19]用不同浓度Cu²⁺处理孔石莼及鼠尾藻, 发现在高浓度Cu²⁺处理下2种藻类的鲜重、相对生长率、叶绿素含量以及可溶性蛋白含量均显著降低, 且孔石莼的鲜重及相对生长率降低速率大于鼠尾藻。李今等^[20]研究发现, Cu²⁺与叶绿素形成配位化合物, 高浓度Cu²⁺会伤害叶绿素, 降低其含量, 因此过量的Cu²⁺不利于叶绿素的形成和稳定。本研究的测定数据与前人研究结果类似, 孔石莼和鼠尾藻的光合色素含量随着Cu²⁺处理浓度的增加均有明显降低。由此可见, 海藻在重金属胁迫下, 随着重金属浓度的升高, 藻类的叶绿素结构受到破坏, 光合色素含量下降, 进而使正常光合作用受到显著影响。而二者相比而言, 鼠尾藻在胁迫条件下光合色素含量降低较少, 是在一定程度上能够维持基本光合作用的内在生理原因。

叶绿素荧光分析技术是一种以光合作用理论为基础、利用体内叶绿素作为天然探针、研究和探测植物光合生理状况及各种外界因子对其细微影响的新型植物活体测定和诊断技术, 具有快速、灵敏、对细胞无损伤的优点, 是研究植物光合作用与环境关系的良好探针^[21]。叶绿素荧光参数和光合作用紧密相关, 逆境对植物光合作用的影响都可以通过叶绿素荧光参数得到真实的体现^[22]。梁英等^[23]研究表明, 在重金属Cu²⁺胁迫下, 离子的浓度与纤细角毛藻(Chaetocerosgracilis)各荧光参数均呈现显著负相关关系, 且随着离子浓度增大及胁迫时间延长, 下降幅度逐渐增大。然而, 本研究结果表明, 不同浓度Cu²⁺处理后, 与对照相比, 孔石莼和鼠尾藻的叶绿素荧光参数alpha、rETRm、IK在总体上呈下降的趋势, 但降低程度呈波动性变化, 即各参数与Cu²⁺处理浓度间的相关关系并未达到显著或极显著水平。而F_v/F_m值变化规律与此不同, F_v/F_m值变化表示PSII的最大光能转化效率, 常被用来作为环境胁迫程度的指标和探针^[24-28]。在正常生理状态下, F_v/F_m值比较稳定, 高等植物的该值一般在0.8以上, 藻类植物在0.65~0.7左右^{[3, 29]}。当藻类受到铜离子胁迫时, 随铜离子浓度的升高, F_v/F_m逐渐降低, 说明重金属胁迫对于藻类光合作用具有抑制作用, 使部分功能PSII反应中心转化为无光化学活性的非功能PSII。本研究中, 孔石莼及鼠尾藻正常对照的F_v/F_m值均在0.7~0.8之间, 且随Cu²⁺胁迫浓度的增加而相应地稳步降低, 相关性分析均达到极显著水平(R=-0.935; R=-0.973)。鉴于F_v/F_m值的灵敏及稳定的双重特性, 为将其作为不同海藻生长及生理对重金属适应性的最佳检测及评价指标提供了直接佐证。本研究结果亦显示, 孔石莼的F_v/F_m比鼠尾藻F_v/F_m在处理条件下降低趋势更为显著, 表明鼠尾藻可能对重金属Cu²⁺胁迫具更强的耐受性。

Na⁺K⁺-ATP酶和Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶是广泛分布在机体内的生物膜酶系统, 对维持细胞正常生理功能起着重要的作用。Na⁺K⁺-ATPase作为细胞中首位重要的离子泵, 主要负责Na⁺、K⁺的转运, 以维持细胞两侧的膜电位, 调节细胞渗透压^[30]。Ca²⁺Mg²⁺-ATPase在金属离子吸收中发挥重要作用, 负责植物矿物元素的吸收和释放^[9]。作为藻类光合作用和呼吸作用中多种酶的辅助因子, Cu²⁺对维持生命体的生长、代谢和酶活性等起着非常重要的作用, 高浓度的Cu²⁺则可能影响质膜的透性, 抑制部分酶的活性, 阻碍藻类光合作用以及ATP的合成, 从而抑制藻类的生长^[31-32]。本研究结果亦显示, 孔石莼和鼠尾藻的Na⁺K⁺-ATPase、Ca²⁺Mg²⁺-ATPase活性都随着Cu²⁺浓度的增加而下降, 在一定程度上无法维持正常细胞代谢。

综上所述, 铜胁迫后孔石莼和鼠尾藻的光合色素含量降低, 光合作用受阻后叶绿素荧光参数alpha、rETRm、IK及F_v/F_m发生变化, 其中孔石莼的F_v/F_m值随Cu²⁺处理浓度降低尤为显著, 且F_v/F_m值与Cu²⁺处理梯度浓度呈极显著负相关。孔石莼和鼠尾藻的Na⁺K⁺-ATP及Ca²⁺Mg²⁺-ATP酶活性随铜离子浓度的升高亦呈现下降趋势, 而鼠尾藻Ca²⁺Mg²⁺- ATP酶活性能保持较低的降低幅度, 表明鼠尾藻能维持较稳定的代谢酶活性, 相比孔石莼对铜胁迫具更强的适应性及耐受力。