2018, Vol. 42
文章信息
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- WEI Meng-ze, HAN Jiao-jiao, LU Chen-yang, ZHOU Jun, CHEN Jiong, QU Ling-yun, FAN Jing-feng, CHEN Gang, SU Xiu-rong. 2018.
- 水产品中荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)RT-LAMP可视化检测方法的建立及应用
- Establishment and application of RT-LAMP visual detection method for Pseudomonas fluorescens in aquatic products
- 海洋科学, 42(11): 91-98
- Marina Sciences, 42(11): 91-98.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180221001
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文章历史
- 收稿日期：2018-02-21
- 修回日期：2018-07-15
2. 自然资源部第一海洋研究所, 山东 青岛 266061;
3. 国家海洋环境监测中心, 辽宁 大连 116023;
4. 复旦大学, 上海 200433
2. First Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Qingdao 266061, China;
3. National Marine Environmental Monitoring Center, Dalian 116023, China;
4. Fudan University, Shanghai 200433, China
在水产养殖业中, 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一类常见的水生生物条件致病菌[1], 对鱼虾的危害尤其严重。荧光假单胞菌一旦进入对虾幼体体内, 会在其中大量繁殖, 使虾苗减少食量或不摄食, 加剧虾苗死亡[2]。大鲵感染荧光假单胞菌时, 出现全身肿胀, 布满红斑, 鳞片脱落, 引发赤皮病[3]。且荧光假单胞菌能够产生极其耐热的蛋白酶和脂肪酶, 这些酶在高温处理后仍有残留, 并在海产品储藏过程中继续分解其中的脂肪和蛋白质, 导致产品的风味和质地发生变化[4]。
目前已经建立了几种用于检测荧光假单胞菌的方法, 如RT-PCR、ELISA、分子杂交、免疫电镜等, 其中RT-PCR法需要昂贵的检测仪器和繁琐的电泳操作, 且灵敏度有待进一步的提高[5]; ELISA方法从样品的制备到检测结束大概要40~48 h才能完成, 且由于使用的多价血清存在不同程度的交叉反应, 容易产生假阳性[6]; 分子杂交和免疫电镜的方法操作繁琐, 耗时长, 且灵敏度低[7]。因此, 亟需开发一种快速检测水产品中荧光假单胞菌的方法, 对于保障我国食品安全具有重要意义。
环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal amplification, LAMP)是2000年左右发展起来的基因扩增技术[8]。它能够在1 h内完成等温条件下的核酸扩增, 并通过观察反应的浊度或是使用不同的染料颜色通过肉眼或借助仪器进行判断。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速、简便等特点, 目前已被用于检测细菌、病毒、寄生虫和真菌等多种病原体[9]。本研究在LAMP的基础上, 结合荧光染料SYBR-Green I[10], 通过单因素法优化反应条件, 建立一种快速的RT-LAMP检测技术[11], 为实现水产品中荧光假单胞菌的快速检测提供了新思路。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种本研究使用包括5种革兰氏阳性和3种革兰氏阴性细菌作为对照(表 1)来检测和验证RT-LAMP的灵敏度和特异性。
| 菌株编号 | 菌株名称 | 菌株来源 |
| GIM 1.225 | 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) | 广东省微生物菌种保藏中心 |
| GIM 1.209 | 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) | 广东省微生物菌种保藏中心 |
| GIM 1.305 | 腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens) | 广东省微生物菌种保藏中心 |
| GIM 1.283 | 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) | 广东省微生物菌种保藏中心 |
| GIM 1.185 | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) | 广东省微生物菌种保藏中心 |
| GIM 1.27 | 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) | 广东省微生物菌种保藏中心 |
| GIM 1.232 | 威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri) | 广东省微生物菌种保藏中心 |
| ATCC 21763 | 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) | 美国菌种保藏中心 |
Bst DNA聚合酶(New England Biolab公司); RNA提取试剂盒和cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司); Taq DNA聚合酶(TaKaRa); 其他常规试剂购于生工生物工程(上海)有限公司。
NanoDrop 2000 (赛默飞世尔科技(中国)有限公司), PCR仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司), 电泳仪(北京六一生物科技有限公司), 凝胶成像分析系统(上海复日科技有限公司), 恒温水浴(常州市万丰仪器制造有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 模板制备取100 mL处于指数生长期的8种细菌培养物(OD600 = 0.8), 4℃, 12 000 r/min离心10 min收集菌体, 按照RNA提取试剂盒的方法提取总RNA, 测定浓度后, 按照反转试剂盒的说明反转cDNA, -20℃保存备用。另将相同量的菌体121℃高压灭活20 min, 提取RNA并反转cDNA, 作为RT-LAMP分析的灭活对照。
1.2.2 引物设计根据NCBI数据库登录的荧光假单胞菌的基因序列, 使用专门的LAMP引物设计软件primer explorer 5.0 (http://primerexplorer.jp/e/index.html)设计引物[12], 得到针对6个区域的4组特异性引物序列(表 2)。
| 引物 | 序列(5′~3′) | 长度/nt |
| F3 | GCGCGAATACTTCAAGTCCA | 20 |
| B3 | GTACAGCTGCGAAGTCTGC | 19 |
| LB | TCAACCACGGGGAGCAT | 17 |
| FIP | AGGTGGGGTTGCTGCTGTAGAGGTCAACCTGCTGTATGTGA | 41 |
| BIP | TGCCCAAGACCATCCTTTCCAAACAGTTCGTTGGTGTCCG | 40 |
反应体系(12.5 μL)如下(表 3), 其中所标浓度为各成分初始浓度:
| 体系组成 | 使用量/μL |
| cDNA | 0.5 |
| 10×ThermoPol反应缓冲液 | 1.25 |
| MgCl2(25 mmol/L) | 1.0 |
| dNTP(10 mmol/L) | 1.0 |
| F-FIP/F-BIP(10 μmol/L) | 0.8 |
| F-F3/F-B3(5 μmol/L) | 0.4 |
| F-LB(10 μmol/L) | 0.4 |
| Bst DNA聚合酶(8 U/μL) | 0.5 |
| 超纯水 | 5.45 |
一定温度条件下恒温1 h, 80℃加热2 min后终止反应。通过1.5%琼脂糖电泳鉴定RT-LAMP产物, 同时使用SYBR green I (1000×, 5 μL)染料作为辅助检测工具。
1.2.3.2 反应温度优化为了确定合适的扩增温度, 选择65.0℃, 63.0℃, 61.0℃温度梯度, 按照表 3的反应体系进行LAMP扩增, 确定最优温度。
1.2.3.3 反应时间优化在上述选择的最佳扩增温度条件下, 分别取30 min, 45 min, 60 min和75 min, 按照表 3的反应体系进行LAMP扩增, 确定最优温度。
1.2.3.4 Mg2+浓度优化设计Mg2+浓度梯度LAMP反应程序, 反应体系中的Mg2+(25 mmol/L)的添加量依次为: 0 μL, 2.0 μL, 4.0 μL和6.0 μL, 在这几个梯度中优化出适宜Mg2+浓度。
1.2.4 RT-LAMP的特异性检测按照上述优化的反应条件, 选取荧光假单胞菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、威尔氏李斯特菌、腐败希瓦氏菌、嗜水气单胞菌等8种常见腐败菌用于LAMP特异性验证, 同时使用高压灭菌的样品用作灭活对照。
1.2.5 反应灵敏度的确定反转后的cDNA经Nandrop 2000进行浓度测试, 并将其10倍梯度稀释至10-1后作为模板, 分别同时用于RT-LAMP和PCR扩增, 比较两者灵敏度差异, 以能出现电泳条带的最低模板量作为最低检测极限。RT-LAMP反应在优化后的最佳扩增条件下进行。25 μL PCR反应体系包括12.3 μL ddH2O, 2 μL dNTP (2.5 mmol/L), 2.5 μL 10×缓冲液, 4 μL cDNA, 0.2 μL Taq DNA聚合酶, F3和B3引物各1.0 μL(和B3)和2 μL MgCl2 (25 mmol/L)。PCR反应程序如下: 95℃预变性3 min, 95℃变性15 s, 55℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 最后72℃维持10 min进行延伸, 重复上述反应35个循环。
1.2.6 通过RT-LAMP反应检测受污染的海产品为了评估RT-LAMP反应在海产品检测中的可行性, 通过将10 mL水中的1 g大黄鱼样品均质化, 培养匀浆中的荧光假单胞菌。使匀浆中的细菌浓度分别保持在5000、500、50 CFU/mL, 同时以污染荧光假单胞菌的鱼样作为阳性对照。
2 结果与分析 2.1 RT-LAMP检测荧光假单胞菌条件的优化 2.1.1 适宜温度选择由图 1可知, 温度在61℃, 63℃, 65℃时, 泳道皆出现了大小不同的区带组成的阶梯式图谱, 而空白对照泳道4未见LAMP特征条带, 与预期的试验结果一致。其中, 61℃和63℃时条带亮, 且63℃扩增的条带最亮, 反应效果好; 而65℃时, 未见条带, 最终选择63℃为LAMP反应温度。
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| 图 1 温度条件对RT-LAMP反应的影响 Fig. 1 Effect of temperature conditions on the RT-LAMP reaction 注: a:通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-LAMP产物; b:通过可视化检测手段检测RT-LAMP产物。M: DL2000标记, 泳道1: 65℃; 泳道2: 63℃; 泳道3: 61℃; 泳道4:无菌水 |
图 2显示, 除了泳道1以外, 泳道2, 3, 4都呈现不同程度亮度的条带, 其中泳道3亮度最为明显, 与之相对应的SYBR-green I呈现同样的变化, 2, 3, 4管结果呈阳性, 且肉眼观察到3管的荧光绿色更明显, 从而确定最佳反应时间为60 min。
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| 图 2 时间对RT-LAMP反应的影响 Fig. 2 Effect of time on the RT-LAMP reaction 注: a:通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-LAMP产物; b:通过可视化检测手段检测RT-LAMP产物。M: DL2000标记, 泳道1: 30 min; 泳道2: 45 min; 泳道3: 60 min; 泳道4: 75 min |
Mg2+是酶开始反应的启动因子, 本试验对Mg2+试验浓度进行了优化, 结果如图 3所示, 在Mg2+ (2.5 mmol/L)的添加量依次为0、2.0 μL时, 均出现LAMP特征条带, 而在Mg2+的添加量为4.0和6.0 μL时未出现特征条带。此外, Mg2+的添加量0, 2.0, 4.0和6.0 μL, 无菌水对照均未出现特征条带。考虑泳道4条带较亮, 最终选择Mg2+的添加量2.0 μL为LAMP反应Mg2+添加量。
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| 图 3 Mg2+浓度对RT-LAMP反应的影响。 Fig. 3 Effect of Mg2+ concentration on the RT-LAMP reaction 注: a:通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-LAMP产物; b:通过可视化检测手段检测RT-LAMP产物。M: DL2000标记; 各泳道镁离子体积, 泳道1, 2: 0 μL; 泳道3, 4: 2 μL; 泳道5, 6: 4 μL; 泳道7, 8: 6 μL; 泳道1, 3, 5, 7:无菌水; 泳道2, 4, 6, 8为荧光假单胞菌 |
图 4显示了RT-LAMP技术的检测灵敏度, 每个反应超过5.4 copies就能够通过RT-LAMP方法被检测到。而对于PCR而言, 只有细菌浓度增加到每个反应1.08×103 copies, 才可以检测到阳性信号。这表明RT-LAMP的灵敏度比标准PCR方法高200倍, 可以检测用标准PCR难以检测的菌株浓度。
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| 图 4 RT-LAMP灵敏度测定 Fig. 4 Test of the sensitivity of RT-LAMP 注: a:通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-LAMP产物; b:通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物; c:通过可视化检测手段检测RT-LAMP产物。M: DL2000标记; 泳道1:阴性对照; 泳道2~8, 4: cDNA of 3.47×105 copies/μL, cDNA of 3.47×104 copies/μL, cDNA of 3.47×103 copies/μL, cDNA of 3.47×102 copies/μL, cDNA of 3.47×101 copies/μL, cDNA of 3.47 copies/μL, cDNA of 3.47×10-1 copies/μL respectively |
自然条件下, 腐败的形成大都由多种细菌共同作用的结果[13], 本文选择了短小芽孢杆菌、荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、威尔氏李斯特菌和嗜水气单胞菌8种常见腐败细菌来验证LAMP的特异性。结果表明只有荧光假单胞菌扩增阳性, 其他菌为阴性反应。无菌水作为阴性对照也无扩增。显然, 该技术能特异性检测荧光假单胞菌。
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| 图 5 RT-LAMP特异性的测定 Fig. 5 Test of the specificity of RT-LAMP 注: a:通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-LAMP产物; b:通过可视化检测手段检测RT-LAMP产物。M: DL2000标记; 泳道1:无菌水; 泳道2:荧光假单胞菌; 泳道3:短小芽孢杆菌; 泳道4:腐败希瓦氏菌; 泳道5:地衣芽孢杆菌; 泳道6:枯草芽孢杆菌; 泳道7:苏云金芽孢杆菌; 泳道8:威尔氏李斯特菌; 泳道9:嗜水气单胞菌 |
如图 6所示, 本文用高压灭菌后的荧光假单胞菌、荧光假单胞菌、无菌水三组进行对比。结果显示, RT-LAMP产物信号只能在荧光假单胞菌中观察到。电泳图显示泳道2有明显条带, 而在其它泳道无条带, SYBR-green I结果显示, 在高压灭菌的细菌样品和阴性对照组中未发现信号, 荧光假单胞菌呈阳性。
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| 图 6 利用RT-LAMP技术检测活细菌 Fig. 6 Detection of live bacteria using RT-LAMP technology 注: a:通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-LAMP产物; b:通过可视化检测手段检测RT-LAMP产物。M: DL2000标记; 泳道1:来自高压灭菌处理后的荧光假单胞菌; 泳道2:来自荧光假单胞菌活体; 泳道3:阴性对照 |
如图 7所示, 电泳图泳道3, 5, 6出现明显条带, SYBR-green I结果与之一致, 结果证实RT-LAMP不仅可以通过剂量依赖法从人工污染的鱼类样本中识别荧光假单胞菌, 而且可以从自然腐败的样本中识别荧光假单胞菌。
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| 图 7 RT-LAMP检测鱼样中的荧光假单胞菌 Fig. 7 RT-LAMP detection of P. fluorescens in fish sample 注: a:通过琼脂糖凝胶电泳检测RT-LAMP产物; b:通过可视化检测手段检测RT-LAMP产物。M: DL2000标记; 泳道1:蒸馏水; 泳道2:鱼均质化上清液, 无荧光假单胞菌; 泳道3:鱼均质液中5000个拷贝数荧光假单胞菌; 泳道4:鱼均质液中高压灭菌的荧光假单胞菌; 泳道5:鱼均质液中500个拷贝数的荧光假单胞菌; 泳道6:鱼均质液中50个拷贝数的荧光假单胞菌 |
本研究通过优化RT-LAMP反应的温度, 时间和Mg2+的添加量, 建立了一种快速高效灵敏的检测手段。传统的LAMP技术是基于DNA对细菌进行的检测研究[14], 但由于死细菌DNA是稳定的核酸分子, 降解速度较慢, 存在平台效应。因此采用DNA进行扩增仍然可能扩增出死细菌的相关产物, 不能判断细菌的“死”与“活”[15]。而原核生物的RNA分子, 半衰期很短, 仅存在于活的、有代谢活性的菌体中, 因而许多人以mRNA作为活菌检测的标志[16]。本文建立了一种快速高效的检测荧光假单胞菌的方法, 同时可以高特异性地鉴定活的荧光假单胞菌。
与传统的电泳技术相比, 本试验采用的SYBR- green I染料能够使反应结果更加直观、简单, 我们可以通过SYBR-green I染料的颜色变化, 判别出是否扩增, 淡橙色表示阴性, 绿色表示阳性[17]。但是LAMP方法具有极高的灵敏度, 在开盖检测产物的过程中可能散布到环境中, 形成气溶胶, 残留在设备上, 通过气溶胶和用具的污染可以引起假阳性的发生[18], 因此, 在之后的研究中, 选择可在反应前添加的染料, 避免反应后的开盖污染, 结果同样简便直观[19]。
通过单因素优化确定RT-LAMP的反应时间为60 min, 反应温度为63℃, MgCl2的体积为2 μL (25 mmol/L)。优化后, RT-LAMP反应可以在较低的细菌浓度下实现检测, 灵敏度低至5.4 copies/反应。而PCR的检测灵敏度为1.08×103 copies/反应, LAMP反应灵敏度比传统的PCR高200倍, 远远超过之前研究显示的100倍[20]。
4 结论通过单因素优化确定RT-LAMP的反应时间为60 min, 温度为63℃, MgCl2的添加量为2 μL (25 mmol/L), 在此条件下可以达到快速, 特异, 高效地检测荧光假单胞菌, 灵敏度比普通的PCR高200倍。此外RT-LAMP反应系统与荧光染料SYBR green I相结合, 比传统的凝胶电泳更有效, 更直观, 为荧光假单胞菌的快速检测开辟了新途径。
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