2018, Vol. 42
文章信息
- 郑利兵, 洪越群, 洪宇建, 孙恺辉, 洪宇聪. 2018.
- ZHENG Li-bing, HONG Yue-qun, HONG Yu-jian, SUN Kai-hui, HONG Yu-cong. 2018.
- 大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化
- Molecular identification of cyclic GMP-AMP synthase-like (cGAS) isoform X1 of Larimichthys crocea and its expression change after the challenge with Cryptocaryon irritans
- 海洋科学, 42(12): 62-70
- Marine Sciences, 42(12): 62-70.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180509002
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文章历史
- 收稿日期：2018-05-09
- 修回日期：2018-09-22
TLR9(Toll-like receptor 9)介导MyD88(myeloid differentiation primary response gene88)依赖的信号通路是最早发现的可识别DNA片段的先天免疫信号通路[1]。Sun等[2]在哺乳动物细胞中发现的一种新型的DNA识别因子cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)对于胞内DNA识别信号通路是一个很好的补充, cGAS可识别细胞质中的双链DNA分子(dsDNA), 催化合成第二信使cGAMP(cyclic GMP-AMP), 进而通过STING(stimulator of interferon genes)依赖的信号通路诱导Ⅰ型干扰素(IFN)的产生。胞质内DNA的出现往往是一种危险信号, 这种异常的DNA可以是由病原生物感染导入的外源性DNA, 也可以是自身细胞核内或者线粒体中逸出的DNA[3]。
cGAS作为一个胞内DNA感受器, 在cGAS- STING通路中起到信号启动的作用。目前, 关于cGAS-STING信号通路在水生脊椎动物中的报道很少, 仅见到2篇相关的研究报道:经Poly(I: C)的刺激, 草鱼(Ctenopharyngodon idella)STING通过激活IFN来诱导有效的免疫反应[4]; STING介导的胞质DNA感知通路在斑马鱼(Danio rerio)中同样保守, 只是STING的信号激活并不是来自于cGAS的传递, 而是其他核酸感受器分子(zDHX9、zDDX41)[5]。然而, 有关鱼类cGAS的单独研究还未见报道。
大黄鱼(Larimichthys crocea)隶属于鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Larimichthys)。近年来由刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染导致的海水白点病的爆发对大黄鱼养殖业是一个巨大的威胁, 了解其感染后的免疫机制并努力提高其免疫能力是学者们亟需从事的一项重要工作。cGAS是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。目前, 大黄鱼的全基因组已经被测序, 并且拼接的数据不断在更新释放[6]。本研究在已公布的大黄鱼cGAS-like X1基因部分序列基础之上, 利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆验证了cGAS- like X1的cDNA全长序列, 并扩增了内含子序列; q-PCR检测Lc-cGAS(X1/X2两种剪切体)组织表达模式的同时, 初步探索了刺激隐核虫感染后, 大黄鱼头肾、肝脏中Lc-cGAS mRNA的表达变化, 为大黄鱼cGAS蛋白的进化、结构和功能多样化研究提供了基础数据。
1 材料与方法 1.1 材料来源与样品制备福建省宁德市富发水产有限公司的养殖网箱购买健康的大黄鱼(体质量: 85.5 g±15.1 g, 体长: 19.2 cm± 1.3 cm)100尾, 于26~27℃的曝气海水中暂养两周, 后用于刺激隐核虫感染实验。从自然感染刺激隐核虫的病鱼收集包囊, 孵化后的幼虫按照26 665个/尾的剂量于500 L海水中感染暂养的健康大黄鱼4 h, 后转移至含有正常水体的新鲜海水中, 具体感染过程参照Niu等[7]。从感染后0、6 h、1、2、3、4、5、6、7 d后的大黄鱼中随机选3个个体处死迅速解剖取出头肾和肝脏组织, 同时取0 h个体的鳃、肌肉、脑、胃、肠、脾、心共9种组织, 样品采集后立即保存于RNA fixer储存液中4℃过夜, 后转移到–20℃长期保存。
1.2 大黄鱼cGAS-like X1基因组序列的克隆验证 1.2.1 总RNA提取Trizol法提取总RNA。组织块置于Trizol中研磨破碎后, 与氯仿共同抽提去除蛋白, 预冷冰醋酸、75%无水乙醇分别沉淀、清洗核酸, DEPC水溶解后测定浓度、1.2%琼脂糖凝胶电泳检测完整性, 具体步骤参照文献[8]。
1.2.2 Lc-cGAS-like X1全长cDNA克隆根据已公布的Lc-cGAS-like X1(XM_019270781)基因cDNA部分序列, 用Primer premier 5.0软件设计ORF框扩增引物F/R及3′-RACE和5′-RACE特异性引物(表 1), 利用SMART®RACE试剂盒(Clontech, 美国)进行3′-端和5′-端的扩增。一轮PCR反应的扩增体系及程序根据说明书进行。PCR产物稀释50倍后进行巢式扩增, 扩增反应体系及程序见文献[9]。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测、切胶回收, 回收产物分别与pMD19-T(TaKaRa, 日本)连接, 转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞, 并挑阳性克隆进行测序, 测序序列进行拼接获得Lc-cGAS-like X1全长cDNA序列。
1.2.3 Lc-cGAS-like X1内含子的克隆验证根据已克隆验证的Lc-cGAS-like X1的全长cDNA序列, Primer premier 5.0软件分段设计重叠引物IF/R(表 1)进行内含子扩增, 进而对基因组序列进行验证及补充。大黄鱼肌肉DNA提取利用EasyPure® Marine Animal Genomic DNA Kit(全式金, 北京)进行, 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测提取产物。内含子扩增体系与扩增程序参照文献[9], 退火温度根据不同引物进行设定, PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并送上海生工测序。
1.2.4 生物信息学分析用DNAStar软件对cDNA序列进行开放阅读框(ORF)搜索及编码氨基酸序列预测; ProtParamTool(http://web.expasy.org/protparam/)对蛋白分子质量(Mw)及等电点(pI)进行预测; SignalIP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找信号肽; SMART(http://www.expasy.ch/SMART)进行蛋白质结构域分析; NCBI的BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对进行同源序列检索, MEGA5.0软件基于获取的不同物种同源蛋白的氨基酸序列构建系统发育树。
1.2.5 Lc-cGAS基因两种isoform的组织表达分析根据已获得Lc-cGAS-like X1的cDNA序列, 用Primer premier 5.0软件设计荧光定量PCR(q-PCR)引物若干对, 包括在可变区的, 在可变区两端的, 但由于扩增特异性、引物二聚体、扩增效率不合适等原因, 未能通过特异性引物将X1/X2两个剪切体区分开来, 故只能利用Q-F/R同时检测X1/X2的表达(表 1), β-actin基因作为内参。q-PCR反应在ABI QuantStudio 6 Flex system利用SYBR Premix Dimer Eraser (TaKaRa, 日本)完成, 扩增的反应体系及程序按照说明书进行。实验设置3个平行组, 每组3个重复。
| 引物 | 序列(5′-3′) | 用途 |
| UPM Long | CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT | RACE通用引物 |
| UPM short | CTAATACGACTCACTATAGGGC | RACE通用引物 |
| NUP | AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT | RACE巢式通用引物 |
| F | TGCTCTAGAATGGAGAGAGAGGACAGAAGTG | ORF扩增 |
| R | CCGCTCGAGCTTACATACAAATATGACTAAAGC | ORF扩增 |
| C-3F | CCTCGGGGCTCTGGAGAACCACGCAT | 3′-端第一轮反应 |
| NC-3F | CTACAAACTCATCTTACTCAACGACG | 3′-端第二轮反应 |
| NC-3F-1 | GTAAGTGATAAGAAAAGATGAACAAC | 3′-端第三轮反应 |
| C-5R | TATGGGGCTCTGGCTCCGAGTGGGC | 5′-端第一轮反应 |
| NC-5R | TTGAGGTCTTTGGAGTTGAGTTTGA | 5′-端第二轮反应 |
| NC-5R-1 | GCTTTCCTTTGCTGTCGTCTTTAC | 5′-端第三轮反应 |
| NC-5R-2 | CCGTTGTTGCTGTTGGAAATGGA | 5′-端第四轮反应 |
| Q-F | GCAGAGGATGGAGGGCTT | 荧光定量PCR |
| Q-R | TCTCCTCCTCTCTAACTCA | 荧光定量PCR |
| β-actin-F | AAGCCAACAGGGAGAAGATGAC | 定量PCR内参引物 |
| β-actin-R | ACGACCAGAGGCATACA | 定量PCR内参引物 |
| IF-1 | CCTCGCCTCACACCAGCA | 内含子扩增 |
| IR-1 | TTCCCCAGCCAGTTGTCA | 内含子扩增 |
| IF-2 | GGAGGTGAACAGGAAGCG | 内含子扩增 |
| IR-2 | GGACGAAGAAGTGAGGGA | 内含子扩增 |
| IF-3 | CCTCCACACCCTTTCCATCA | 内含子扩增 |
| IR-3 | ATCTCGGTGGAGGCGTCT | 内含子扩增 |
| IF-4 | GCAGAGGATGGAGGGCTT | 内含子扩增 |
| IR-4 | TCTCCTCCTCTCTAACTCA | 内含子扩增 |
| M13F | CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC | 克隆通用引物 |
| M13R | AGCGGATAACAATTTCACACAGGA | 克隆通用引物 |
利用QuanStudioTM Real Time PCR software软件获得每个反应的CT值, 采用2–ΔΔCT法[10]进行相对定量分析。根据每个样品的3个平行实验所得的数据计算相对表达量平均值和标准差。
1.2.6 Lc-cGAS基因X1/X2两个剪切体在刺激隐核虫感染后的时空表达变化q-PCR分别检测刺激隐核虫感染大黄鱼后头肾、肝脏组织在感染后0、6 h、1、2、3、4、5、6、7 d不同时间点Lc-cGAS(X1/X2两个剪切体)的表达变化情况, 具体操作与分析如上所述。
2 结果 2.1 Lc-cGAS-like X1基因组序列分析3′-RACE和5′-RACE扩增产物分别测序后与扩增的已知序列进行拼接, 获得大黄鱼cGAS-like X1的全长cDNA序列。Lc-cGAS-like X1基因cDNA全长1 925 bp, 包含1个231 bp的5′-端非编码区(5′-UTR), 1 488 bp的ORF, 和1个207 bp的3′-UTR, 其Poly(A)序列上游有规则的加尾信号AATAAA, 可见该cDNA具有完整的蛋白质编码区(图 1)。
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| 图 1 Lc-cGAS-like X1基因组序列及编码氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Lc-cGAS-like X1 genome 注:起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)均用方框标示; 多聚腺苷酸信号位点(AATAAA)用双下划线标示; poly(A)尾用下划线标示; 外显子-内含子边界(GT……AG)用斜体加重标示; Mab-21结构域用阴影标示; 跨膜结构域用虚线标示; 预测的潜在糖基化位点(N)用加重放大字体标示 The start cordon (ATG) and the stop codon (TAG) are boxed; The polyadenylation signal sequence (ATTAAA) is marked with double underline, and the poly (A) tail is underlined; The boundaries of intron and exon are indicated by bold italic; The Mab-21 domain is shaded; The transmembrane domain is marked with dot line; The potential glycosylation sites are big bold |
经扩增、测序、拼接后得到Lc-cGAS-like X1的基因组全长(GenBank登录号为KY649436), 共3 153 bp, 包含8个外显子和7个内含子, 内含子长度分别为258、277、121、113、182、137、139 bp, 所有外显子-内含子的边界都符合GT-AG剪切规则(图 1)。
氨基酸序列分析知, Lc-cGAS-like X1基因编码一个含有495个氨基酸残基的多肽, 预测的分子量Mw大小为56.57 kDa, 理论等电点pI为9.45。蛋白结构特征分析得知: Lc-cGAS-like X1蛋白无信号肽; 有3个潜在的糖基化位点, 分别为第286位(NLSE)、第320位(NATK)和第464位(NPST)的天冬酰胺; 有2个功能域, 分别为第115~431位氨基酸序列的Mab-21 (male abnormal 21)功能域和第470~492位氨基酸序列的跨膜结构域(transmembrane region, TM)(图 1)。相比于Lc-cGAS-like X2(XP_010743987), Lc-cGAS-like X1蛋白在第43~44位之间缺少了GKAA 4个氨基酸残基。
2.2 Lc-cGAS-like X1蛋白同源性分析BLASTp同源性在线检索结果显示: Lc-cGAS- like X1与大黄鱼cGAS-like X2(XP_019126326)相似性最高, 为99%;与其他鱼类的同源蛋白具有较高的相似性, 如与南极鳕(Notothenia coriiceps, XP_010779127)、深裂眶锯雀鲷(Stegastes partitus, XP_008291104)、罗非鱼(Oreochromis niloticus, XP_005478474)cGAS的相似性分别为74%、70%、66%;而与一些高等脊椎动物的cGAS相似性较低, 如与人(Homo sapiens, NP_612450)的相似性为38%, 小鼠(Mus musculus, NP_775562)为40%, 与黑猩猩(Pan troglodytes, AKG51736)为40%。
从GenBank选取一些代表物种的cGAS同源蛋白序列利用Mega5.0构建了NJ系统发育树(图 2), 结果表明:整个发育树中鱼类cGAS聚在一起, 其中大黄鱼cGAS-like单独聚在一起, 再与其他鱼类聚成一支; 青鱂(Oryzias latipes)cGAS与高等脊椎动物的聚成姐妹支, 说明二者cGAS的进化低位较近。整个发育树呈现出来的系统进化关系基本与传统的分类相一致。
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| 图 2 cGAS蛋白的NJ系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree of cGAS proteins 代表物种的GenBank登录号为:南极鳕(XP_010779127)、深裂眶锯雀鲷(XP_008291104)、罗非鱼(XP_005478474)、秀美花鱂(Poeciliaformosa)(XP_007560077)、海水青鱂(XP_024153558)、青鱂cGAS变型X1(XP_024153558)、青鱂cGAS变型X2(XP_020565002)、大黄鱼cGAS isoform X2(XP_010743987)、红丽鱼(Pundamilia nyererei)(XP_005739883)、大西洋鲑(Salmo salar)变型X2(XP_013997397)、大西洋鲑变型X1(XP_013997396)、大鳞大马哈鱼变型X5(XP_024251804), 大鳞大马哈鱼变型X4(XP_024251803)、大鳞大马哈鱼变型X3(XP_024251802)、大鳞大马哈鱼变型X2(XP_024251801)、大鳞大马哈鱼变型X1(XP_024251800)、人(NP_612450)、小鼠(NP_775562)、克罗斯河大猩猩(AKH04269)、与黑猩猩(AKG51736) The GenBank accession numbers of these representative species were N.coriiceps(XP_010779127), S.partitus (XP_008291104), O.niloticus (XP_005478474), P.formosa(XP_007560077), Oryzias melastigma (XP_024153558), Oryzias latipes variant X1(XP_004077273), O.latipes variant X2 (XP_020565002), Xiphophorus maculatus(XP_005811273), L.coreca isoform X2 (XP_010743987), Pundamilia nyererei(XP_005739883), Salmo salar variant X2 (XP_013997397), S.salar variant X1 (XP_013997396), Oncorhynchus tshawytscha variant X5 (XP_024251804), O.tshawytscha variant X4 (XP_024251803), O.tshawytscha variant X3 (XP_024251802), O.tshawytscha variant X2 (XP_024251801), O.tshawytscha variant X1 (XP_024251800), H.sapiens(NP_612450), M.musculus(NP_775562), Gorilla gorilla (AKH04269), P.troglodytes(AKG51736) |
q-PCR检测的Lc-cGAS基因的组织分布结果(图 3)表明: Lc-cGAS基因在所检测的9种组织中均有表达, 相比于脾, 鳃中的相对表达量最高, 为脾的3.52倍(P < 0.01), 其次为肝、肌肉等。
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| 图 3 Lc-cGAS的组织分布 Fig. 3 The tissue expression of Lc-cGAS gene 注:相同字母标示组间差异不显著, 不同小写字母标示组间差异显著(P < 0.05), 大写字母标示组间差异极显著(P < 0.01) The same letters indicate no difference; the different lowercase letters indicate difference between each other (P < 0.05); the capital letter indicates extremely different (P < 0.01) |
刺激隐核虫的感染过程除了有寄生导致的生理损害外还伴有细菌的二次感染。刺激隐核虫感染大黄鱼后, q-PCR检测的头肾和肝脏中Lc-cGAS mRNA的表达变化如图 4所示:在头肾中, 幼虫感染后1 d, Lc-cGAS的表达出现显著上调(P < 0.05), 在感染后2 d下调到初始水平, 并且于感染后3 d上调出现表达高峰, 为对照组的2.56倍(P < 0.01), 随后表达量逐渐开始下调, 在感染后第5天恢复到初始表达水平。在肝脏中, 刺激隐核虫幼虫感染的前3 d, Lc-cGAS的表达未发生较大变化, 在第4天时才出现显著上调, 为对照组的1.80倍(P < 0.01), 继而表达量下调到初始水平; 在感染后第7天, 其表达量出现表达高峰, 为对照组的1.88倍(P < 0.01)。结果显示, 不同组织的Lc-cGAS都不同程度的参与到了刺激隐核虫感染的免疫防御过程中。
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| 图 4 刺激隐核虫感染后, Lc-cGAS在大黄鱼头肾跟肝脏组织中的表达变化 Fig. 4 The expression change of the Lc-cGAS gene in the head kidney and liver, respectively, after the challenge with C. irritans 注:与0 h相比, *标示组间差异显著(P < 0.05), **标示组间差异极显著(P < 0.01) Compared with the control group, ** indicate highly significant difference (P < 0.01), and * indicates significant difference (P < 0.05) |
cGAS-STING通路是至今发现的为数不多几条能够完整描绘诱导产生Ⅰ型IFN过程的通路[11], 有关该通路中cGAS的研究认知目前基本局限于高级哺乳动物的胞内DNA的识别机制及抗病毒感染过程[12]; STING的相关报道除了与抗病毒的识别启动外[2, 9], 还可以作为一个直接的免疫识别器识别细菌的一些信号分子[13, 14]。作者基于大黄鱼cGAS基因序列的研究分析表明其与鱼类cGAS的相似度较高, 说明cGAS在不同鱼类间较为保守; 进一步系统进化分析显示鱼类cGAS共同聚为一支, 与高等脊椎动物明显分开, 表明借助cGAS的氨基酸序列对物种进行的分子进化研究与传统的生物学分类基本吻合。与Lc-cGAS-like X2的氨基酸序列相比, Lc-cGAS-like X1第43~44位之间缺少了4个氨基酸; 作者前期克隆获得的大黄鱼STING变型2(Lc-STING2)cDNA全长序列, 相比于Lc-STING1的氨基酸序列, Lc-STING2的氨基酸序列在第359~360之间缺少了4个氨基酸[15], 推测大黄鱼的cGAS与STING两个信号分子之间可能存在着暂时还未知的某种复杂的直接或间接的联系, 同时与cGAS与STING同时出现、同时缺失的进化报道相符[16]。其次, 研究报道斑马鱼的cGAS并不是作为STING介导IFN分泌的启动信号而存在, 推测很可能在某些鱼类中具有其他特异型功能[5], 因此, 鱼类的该信号通路可能跟哺乳动物所拥有的功能特征存在不同。基因组测序分析结果指出cGAS基因在大黄鱼基因组中发生扩张, 其他抗病毒相关基因如TRIM25(tripartite motif containing 25)、DDX41、NLRC3(NOD-like receptor family CARD domain containing 3)也都出现类似的扩张现象; 同时识别细胞质中病毒来源RNA来启动抗病毒信号通路的RIG-I(retinoic acid-inducible gene-1)在大黄鱼中可能被LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)基因替代[17-25], 大黄鱼基因组中这些抗病毒相关基因的扩张揭示了他们的作用在抗病毒免疫过程增强, 同时也从遗传学角度解释了大黄鱼为什么具有较强的抗病毒感染能力。
本研究利用q-PCR技术检测了Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)的组织分布, 结果显示在所有检测的9种组织中都有表达, 且在鳃中的表达量相对较高, 其组织表达模式与对鱼类STING的研究相一致[26]。鳃组织是鱼类接触水中病原生物最多的一种组织, 对于抵御病原的入侵起到非常重要的防线作用, 有报道称鱼类鳃参与介导病原的免疫反应[27]。鳃组织中Lc-cGAS的基础表达水平较高, 可能发挥抗病毒防线关键作用。
基于刺激隐核虫的感染特点本研究也是初次在基因水平尝试大黄鱼cGAS在抗刺激隐核虫感染的表达变化, 为其后续功能活性研究拓宽思路。刺激隐核虫感染大黄鱼后, Lc-cGAS在头肾中的极显著变化主要出现在幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段, 也即大黄鱼头肾cGAS主要参与到刺激隐核虫的感染寄生阶段, 主要在感染周期的前期; 在肝脏中其上调变化主要出现滋养体脱落阶段和二次细菌感染阶段, 也即大黄鱼肝脏cGAS主要参与到刺激隐核虫感染周期的的后期阶段。头肾、肝脏分别是鱼类的免疫、解毒器官, cGAS的显著上调暗示其可能作为免疫网络的成员参与的抗刺激隐核虫的感染, 抑或可能cGAS具有多样的功能, 识别胞质dsDNA只是其中一个已被鉴定的很重要的功能特征。不同组织中的表达变化差别较大, 参与的抗感染阶段不同, 可能与组织器官的功能差异有关[28]。迄今, 有关cGAS的调查都基本集中于抗病毒感染, 本研究是首次从基因水平初步探讨其抗寄生虫感染的参与, 也是对Lc-cGAS在刺激隐核虫感染后参与免疫对抗的一个初步探索, 同时也是对鱼类cGAS基因的功能特征多样化的一个参考。然而, 究其是直接还是间接参与免疫应答仍需要更深入的探讨、验证。
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