海洋科学  2018, Vol. 42 Issue (2): 88-93   PDF    
http://dx.doi.org/10.11759//hykx20170723001

文章信息

石祥, 肖容, 邱立国, 周海龙. 2018.
SHI Xiang, XIAO Rong, QIU Li-guo, ZHOU Hai-long. 2018.
凡纳滨对虾幼体不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性研究
Comparative study on sensitivity of ammonia nitrogen at different life stages of Litopenaeus vannamei
海洋科学, 42(2): 88-93
Marine Sciences, 42(2): 88-93.
http://dx.doi.org/10.11759//hykx20170723001

文章历史

收稿日期：2017-07-23
修回日期：2017-09-16
引用本文
石祥, 肖容, 邱立国, 周海龙. 2018. 凡纳滨对虾幼体不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性研究[J]. 海洋科学, 42(2): 88-93.
SHI Xiang, XIAO Rong, QIU Li-guo, ZHOU Hai-long. 2018. Comparative study on sensitivity of ammonia nitrogen at different life stages of Litopenaeus vannamei[J]. Marine Sciences, 42(2): 88-93.
凡纳滨对虾幼体不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性研究
石祥, 肖容, 邱立国, 周海龙     
海南大学 热带农林学院, 海南 海口 570228
收稿日期：2017-07-23；修回日期：2017-09-16
基金项目：海南省自然科学基金项目(20164159);国家自然科学基金项目(41161077)
作者简介：石祥(1993-), 男, 山东人, 硕士研究生, 主要从事海洋动物逆境生物学研究, 手机: 18789079886, E-mail: 576828603@qq.com.
通信作者：周海龙, 通信作者, E-mail: zhouhl@hainu.edu.cn.
摘要：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界上最重要的对虾养殖品种之一。为比较凡纳滨对虾不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性差异, 作者对其不同生长发育时期24 h半数致死浓度(LC50)进行测定, 并分析其胁迫效应。结果表明, 24 hLC50值在虾的不同生长发育时期差异显著(P < 0.05), 不同时期凡纳滨对虾的LC90与LC50变化趋势相同。在溞状幼体Ⅱ期(Z2)LC50值最低, 为17.811 mg/L, 在仔虾第Ⅴ期(P5)时, LC50值最高, 为44.808 mg/L。根据LC50和LC90的变化趋势可以看出, 仔虾比幼体期的耐受性强。本试验结果不仅为凡纳滨对虾不同生长发育时期的苗种培育提供了重要的基础数据, 而且为凡纳滨对虾耐氨氮品系选育提供了重要指导。
关键词：凡纳滨对虾    氨氮胁迫    不同生长发育时期    敏感性    
Comparative study on sensitivity of ammonia nitrogen at different life stages of Litopenaeus vannamei
SHI Xiang, XIAO Rong, QIU Li-guo, ZHOU Hai-long     
Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China
Received: Jul. 23, 2017
Foundation: The Natural Science Foundation of Hainan Province, No. 20164159; The National Natural Science Foundation of China, No. 41161077
Abstract: Litopenaeus vannamei is one of the world's most commercially valuable shrimps. In this study, we conducted an ammonia nitrogen stress test on L. vannamei to estimate the 24-h half-lethal concentration (24 h LC50) values at different larvae stages. The results showed that the 24 h LC50 values were significantly different at different developmental stages of the shrimp (P < 0.05). Ammonia nitrogen stress had the same trend as LC90 and LC50 in L. vannamei at different developmental stages. LC50 had the least value at Zoea Ⅱ (17.811 mg/L) and the maximum value at Postlarvae Ⅴ (44.808 mg/L). According to the trends of LC50 and LC90, we can conclude that the latter stage has higher tolerance than the earlier stage. These results can provide basic information for shrimp farming and nursery and can also guide selection breeding for the tolerance of L. vannamei. This study will play an important role in health development of shrimp in the shrimp industry.
Key words: Litopenaeus vannamei    ammonia nitrogen stress    different life stages    sensitivity    

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾、白虾等, 其对盐度及温度的适应性较强, 而且肉质鲜美, 现已成为世界对虾养殖三大品种中产量最高的一种[1-2]。近年来, 随着工业的发展及人类活动的增加(例如工业废水和生活污水的排放以及化肥的使用), 氨氮的环境排放量越来越大[3]。另外, 凡纳滨对虾养殖过程中剩余饵料的分解及其自身排泄物的积累也会导致其养殖水体中产生大量的氨氮[4]。据报道, 氨氮胁迫会严重影响凡纳滨对虾的正常生长发育, 已严重制约对虾养殖业的健康发展[5]。

当养殖水体NH4+超过质量浓度5 mg/L, NH3超过0.2 mg/L时, 会影响鱼类等水生生物的生理代谢调节, 因而养殖水体的分子氨NH3含量最高值不宜超过0.1 mg/L[6]。相对NH3, NH4+无论是在水中的含量还是危害都占主导地位[7]。氨氮(NH3-Nt)在水体中通常主要以NH4+状态存在, 同时还包括一部分未电离的氨水合物(NH3·H2O)。水生动物长期生活在含分子氨量较高的水体中时, 由于体内氨氮废物的排泄受阻, 若分子氨再从水体渗入组织液内, 进入生物体内的NH3会氧化血液中血红蛋白分子的Fe2+, 造成血液载氧能力的大幅下降[8]。同时, 血细胞对于对虾的免疫有重要作用, 而氨氮胁迫会显著影响甲壳动物的血细胞数量, 导致机体对病原菌的抗性减弱[9]。

氨氮是虾类养殖环境中的一种重要的环境因子[10], 对甲壳动物机体的系统免疫、生长发育及渗透压的调节等都有重要影响[11]。正常情况下, 甲壳动物体内氮的主要代谢产物是氨态氮(NH4+), 体内超过60%的氮是以氨态氮的形式由鳃排出体外[12]。当甲壳动物受到氨氮胁迫时, 其体内的氨氮解毒代谢途径发挥作用, 主要包括:减少体内蛋白质和氨基酸的分解; 合成谷氨酸、谷氨酰胺等对机体无毒害作用的氨基酸; 降低鳃组织对分子氨的通透性, 增加NH4+的排出率; 加强尿素循环, 增加尿素氮的排泄[13]。

目前, 氨氮对海洋动物的胁迫效应已开展了大量研究, 包括对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)[14]、花鲈鱼(Lateolabrax maculatus)[15]、刺参(Apostichopus japonicus)[16]、文蛤(Meretrix meretrix)[17]、日本囊对虾(Penaeus japonicus)[18]等; 另外不同种类的虾类, 即使同种虾类在不同生长发育时期对氨氮的敏感性也有差异[19]。有关氨氮对甲壳动物的毒性效应已开展了大量研究。据报道, 氨水作为水生系统的主要毒物, 可能引起虾的免疫抑制, 增加对WSSV的敏感性[20-22]。抗氧化酶是应对活性氧(ROS)的重要工具, 超氧化物歧化酶(SOD)是应对氧化应激的重要抗氧化酶之一[23-24]。高氨氮可造成肝胰腺中SOD活性降低从而导致ROS含量升高[25]。过量的ROS可能会破坏细胞膜, 形成脂质过氧化物和氧化蛋白[26]。作为衡量水质好坏的重要标准, 有研究表明养殖水环境中氨氮含量变化对对虾的免疫力及生理机能和环境耐受力方面有显著的影响, 甚至可导致对虾非病原感染性死亡。如Chen等[27]通过对不同浓度NH4Cl胁迫下斑节对虾(Penaeus monodon)体内的氨基酸含量的研究发现, 不同组织中氨基酸的含量存在差异。张克俭[28]指出, 当环境中氮质量浓度高于10.44 mg/L时, 中国明对虾(Penaeus chinensis)肝胰腺中肝小管管壁内的吸收细胞减少, 分泌细胞增多, 产生大量分泌小泡, 而且因分泌细胞的破裂解体导致部分肝小管损伤或破坏。

为了更好地指导凡纳滨对虾的苗种培育和健康养殖, 比较其不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性显得尤为重要。目前, 大多仅仅对其某个或几个生长发育时期应答氨氮胁迫开展了研究[29-30], 而对其不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性尚无相关报道。因此, 本研究拟通过测定凡纳滨对虾不同生长发育时期不同致死比例来比较其对氨氮胁迫的敏感性, 以期为凡纳滨对虾的健康养殖以及耐氨氮新品系选育提供基础数据及理论指导。

1 材料与方法 1.1 凡纳滨对虾发育形态学的观察研究

实验用凡纳滨对虾采自海南广泰海洋育种有限公司。在海水盐度为31, pH为8.1±0.2, 温度为30.88℃± 0.73℃的环境下, 在4×OLYMPUS光学显微镜[型号CX 21)下观察凡纳滨对虾发育过程。对各时期形态进行拍照, 利用Adobe Photoshop对所观察结果进行描边处理, 最终得到各时期胚胎发育图。

1.2 氨氮胁迫下凡纳滨对虾不同发育时期敏感性的确定 1.2.1 材料

实验用凡纳滨对虾采自海南广泰海洋育种有限公司。

各取样时间对应的环境温度, pH及盐度条件详见表 1。从表 1可以看出, 发育过程中虾苗的体长呈现线性增长。温度维持在30℃左右, pH呈现碱性。

表 1 测定氨氮胁迫对不同时期凡纳滨对虾胁迫作用时的试验条件 Tab. 1 Experimental conditions to determine the stress levels for ammonia–N pollution of the white shrimp Litopenaeus vannamei
发育时期 平均总长度/cm 温度/℃ pH 盐度
N 0.035±0.005 31.5 ± 0.1 7.98 ± 0.02 30 ± 0.173
Z Ⅰ 0.084±0.005 29.1 ± 0.115 7.96 ± 0.01 30 ± 0.265
Z Ⅱ 0.133±0.012 31.4 ± 0.173 7.98 ± 0.017 31 ± 0.2
Z Ⅲ 0.2±0.01 31.2 ± 0.265 7.95 ± 0.01 31 ± 0.1
M Ⅰ 0.278±0.011 31.5 ± 0.2 7.96 ± 0.01 30 ± 0.2
M Ⅱ 0.337±0.015 31.6 ± 0.2 7.91 ± 0.017 30 ± 0.173
M Ⅲ 0.387±0.116 31.5 ± 0.173 7.91 ± 0.017 30 ± 0.265
P Ⅰ 0.48±0.026 30.6 ± 0.265 7.93 ± 0.01 30 ± 0.265
P Ⅱ 0.527±0.025 30.5 ± 0.173 7.89 ± 0.02 30 ± 0.346
P Ⅲ 0.577±0.025 30.5 ± 0.1 7.92 ± 0.02 30 ± 0.4
P Ⅳ 0.63±0.026 30.7 ± 0.265 7.88 ± 0.03 30 ± 0.173
P Ⅴ 0.677±0.025 30.4 ± 0.1 7.88 ± 0.026 30 ± 0.436
  注: N为无节幼体; Z Ⅰ为溞状幼体Ⅰ期; Z Ⅱ为溞状幼体Ⅱ期; Z Ⅲ为溞状幼体Ⅲ期; MⅠ为糠虾幼体Ⅰ期; M Ⅱ为糠虾幼体Ⅱ期; M Ⅲ为糠虾幼体Ⅲ期; PⅠ为仔虾1期; P Ⅱ为仔虾2期; P Ⅲ为仔虾3期; P Ⅳ为仔虾4期; P Ⅴ为仔虾5期
表选项
1.2.2 主要试剂和仪器

主要仪器为胶头吸管、烧杯、NH4CL(分析纯)、电子天平(OHAUS)、HI96733型氨氮测试仪(HANNA)。母液由NH4CL(分析纯)与海水配制而成。

1.2.3 方法

在显微镜下观察胚胎发育过程, 并用胶头吸管吸取各时期的幼体进行暴露实验。根据不同时期设置不同的氨氮浓度梯度:无节幼体到糠虾Ⅲ期设置氨氮暴露质量浓度分别为0、10、20、25、30、35、40 mg/L; 实际测量氨氮质量浓度为3.1、14.5、25.0、30.5、36.5、40.1、46.5 mg/L。仔虾期设置氨氮质量浓度梯度为0、30、40、50、60、80 mg/L。每个浓度设置3个平行, 每个平行随机挑选健康的幼体50尾, 分别进行急性胁迫试验。每个浓度设置3个平行, 每个平行50尾虾, 分别暴露于50 L装有海水的玻璃烧杯内。用氨氮测定仪(HI96733, HANNA)测定氨氮浓度。暴露24 h用胶头滴管吸取虾苗于显微镜下观察, 记录死亡数与存活数量。

1.3 数据统计

数据统计及差异显著性分析采用SPSS18.0处理。结果用Mean ± SD表示, 采用最小差异显著法(Least- Significant Different, LSD)进行显著性比较(P < 0.05)。

2 结果 2.1 凡纳滨对虾发育形态学的观察研究

凡纳滨对虾不同发时期形态如图 1所示。

图 1 凡纳滨对虾胚胎发育全过程 Fig. 1 The process of the embryonic development of the white shrimp Litopenaeus vannamei Z1期为蚤状幼体Ⅰ期; Z2期为蚤状幼体Ⅱ期; Z3期为蚤状幼体Ⅲ期; M1期为糠虾幼体Ⅰ期; M2期为糠虾幼体Ⅱ期; M3期为糠虾幼体Ⅲ期; P1期为仔虾Ⅰ期 Z1: Zoea Ⅰ; Z2: Zoea Ⅱ; Z3: Zoea Ⅲ; M1: Mysis Ⅰ; M2: Mysis Ⅱ; M3: Mysis Ⅲ; P1: Postlarvae Ⅰ
图选项

总观各时期凡纳滨对虾发育图可以发现, 无节幼体与蚤状幼体Ⅰ期的区别在于腹部是否有分节现象(图 1B), 同时, 蚤状幼体Ⅰ期尾部经常伴随线状食物排泄物, 在水中水平游动; 蚤状幼体Ⅰ期与Ⅱ期的区别在于头部前端有无额角, 从图 1C可以看出蚤状幼体Ⅱ期的幼虾头部出现显著对称生长的额角; 蚤状幼体Ⅱ期与Ⅲ期的区别为Ⅲ期幼虾腹部第六节明显加长; 对于蚤虾与糠虾的区别, 由图 1D与图 1E对比可以发现, 糠虾Ⅰ期(图 1E)尾部构造出现游泳型尾, 此外, 从糠虾Ⅰ期开始, 幼虾躯体呈现弯曲状, 游泳时头部朝下在水中做弧线状运动; 糠虾Ⅱ期步足则出现螯状结构(图 1F), 躯体相比Ⅰ期略显平整; 当对虾发育至M3期, 游泳足发育完全, 同时其躯体再次呈现显著性弯曲现象, 在水中跳跃式运动。当对虾发育至仔虾期, 其形态与成虾一致。

2.2 氨氮胁迫下凡纳滨对虾不同发育时期敏感性的确定

氨氮暴露24 h时的半数致死浓度(LC50), 90%的致死浓度(LC90)和10%的致死浓度(LC10)值详见表 2。方差分析的结果表明, 发育时期对氨氮的24 h LC50影响显著(P < 0.05), 其中在蚤状幼体Ⅱ期(Z2) LC50最小为17.811 mg/L, 而在仔虾第5期(P5)时, LC50值最高, 为44.808 mg/L。而且LC10和LC90变化趋势与LC50变化趋势一致。

表 2 不同发育时期凡纳滨对虾24 h不同死亡比例的氨氮致死浓度及半致死浓度的95%置信区间 Tab. 2 The proportion of ammonia to death at different death rates and 95% confidence interval for the lethal concentration at different mortality rates of L. vannamei
生长时期 LC50/(mg/L) 95%置信区间 LC90/(mg/L) LC10/(mg/L)
无节幼体 22.661 ± 1.755 b 20.929~24.291 28.352 ± 4.972 ab 15.350 ± 1.765 c
溞状幼体Ⅰ期 25.275 ± 2.699 c 22.451~27.856 39.906 ± 6.905 c 11.358 ± 2.918 b
溞状幼体Ⅱ期 17.896 ± 1.767 a 15.999~17.811 26.178 ± 1.021 a 9.255 ± 2.073 ab
溞状幼体Ⅲ期 20.387 ± 0.874 b 18.925~20.386 33.314 ± 0.773 b 8.365 ± 0.660 a
糠虾幼体Ⅰ期 32.997 ± 0.905 d 31.891~33.947 39.422 ± 2.367 c 23.935 ± 0.843 e
糠虾幼体Ⅱ期 34.399 ± 0.279 d 32.651~36.130 44.370 ± 0.326 cd 21.617 ± 0.206 de
糠虾幼体Ⅲ期 38.127±0.449 e 37.099~39.035 45.794 ± 0.485 d 27.347 ± 0.884 f
仔虾Ⅰ期 38.560 ± 0.702 e 36.161~40.961 54.705 ± 3.028 e 20.547 ± 2.221 d
仔虾Ⅱ期 39.116 ± 0.606 e 36.843~39.103 55.641 ± 1.605 ef 20.692 ± 1.856 d
仔虾Ⅲ期 39.389 ± 1.566 e 38.016~42.135 56.109 ± 2.100 ef 20.755 ± 1.698 d
仔虾Ⅳ期 41.832 ± 2.097 f 36.234~45.551 60.549 ± 3.111 f 21.383 ± 1.155 de
仔虾Ⅴ期 44.805 ± 1.044 g 34.953~75.112 58.343 ± 2.621 ef 27.802 ± 1.705 f
  注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)
表选项
3 讨论

总氨氮和非离子氨氮对不同种类对虾或同一种虾不同发育时期的LC50不同。由于氨氮胁迫实验在多种实验环境下进行, 不同时间研究对应的实验条件存在差异, 所以难以准确地仅仅利用LC50比较不同虾类的氨氮耐受性。如就幼虾而言, 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的氨氮耐受性较高, 研究报道其24 h的LC50可达150 mg/L以上, 而对于斑节对虾等其他种类该发育时间点的LC50处于在10~70 mg/L[31]。李永等[32]发现在温度为30℃, pH为8, 盐度为34.5条件下氨氮对斑节对虾24 h的LC50为52.63 mg/L, 且其LC50随氨氮胁迫时间的延长呈现下降趋势。梁俊平等[33]研究了在水温24℃、盐度31、pH8.1条件下, 氨氮对脊尾白虾幼虾和成虾的毒性; 试验结果表明, 脊尾白虾成虾(4.3 cm)各时间对氨氮的抗性显著高于幼虾(1.2 cm), 其对应24 h的LC50分别为178.80与155.81 mg/L。

一般而言, 各种类对虾对氨氮的耐受性随发育时期呈现上升趋势。如在对斑节对虾不同时期的氨氮耐受性比较的研究结果显示, 随着幼体时期的增长, 氨氮的耐受力也逐渐增强, 即耐受力依次为:后期仔虾 > 糠虾幼体 > 溞状幼体 > 无节幼体[34]。李建等[29]发现不同时期日本囊对虾对氨氮的耐受性顺序依次为:仔虾 > 糠虾幼体 > 无节幼体 > 溞状幼体, 对应24 h的LC50依次为50.12、35.48、23.44、15.85 mg/L; 而其48 h的氨氮耐受性依次为仔虾 > 糠虾幼体 > 溞状幼体 > 无节幼体, 对应48 h的LC50分别为24.55、17.38、13.18、10.72 mg/L。而姚庆祯等[30]通过观察不同发育时间凡纳滨对虾对氨氮的敏感性实验中发现, 其耐受性呈现为:溞状幼体(Z1)与糠虾(M1)24h的LC50近似相等(约为20.00 mg/L), 而仔虾P6的LC50较小, 仅为11.35 mg/L。而不同时较高虾日龄的虾类其氨氮耐受力增强[35]。本实验研究对虾的苗种培育、健康养殖、揭示氨氮胁迫机制打下了一定的基础。更深入的工作(如其应答氨氮胁迫机制)可以利用现代分子生物学以及组学技术进一步深入研究, 将为凡纳滨对虾产业的可持续发展提供重要支撑。

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凡纳滨对虾幼体不同生长发育时期应答氨氮胁迫的敏感性研究
石祥, 肖容, 邱立国, 周海龙