近年来, 我国核电厂的建设速度逐步加快, 为了满足其对大量冷却水的需求, 核电厂一般建在河口或沿海地区^[1], 其温排水会导致近岸水域温度上升, 会对生态系统造成负面影响, 导致浮游植物的关键生境条件发生显著变化, 甚至增加水华爆发的风险^[2]。同时, 核电厂为防止冷凝器附着生物形成绝热层, 影响冷却效果甚至堵塞冷却系统, 需向循环冷却水中加入一定量的氯, 因此温排水中一般都含有一定浓度余氯^[3-4]。含有游离余氯的冷却水排入海域中可能影响海洋浮游植物的种类数、生物量和优势种群, 从而影响海洋生态系统。亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)是常见的海洋单细胞绿藻, 对温度、光照和盐度的适应范围较广, 生长繁殖迅速, 极易培养, 是鱼、虾、贝类等重要的饵料食物^[5-7]。本文以海洋饵料藻—亚心形扁藻为研究对象, 研究温升及游离余氯的单独作用以及联合作用对亚心形扁藻生长和光合作用的影响, 探讨温排水与亚心形扁藻增殖的关系, 以期为海滨核电厂对其附近水域浮游植物的生态风险评价提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用的亚心形扁藻藻种由温州医科大学提供, 培养温度为20℃, 光照强度约为2 500 lx, 光暗比设定为14 h︰10 h, 扩大培养后用于试验。安替福民(次氯酸钠水溶液, 分析纯)用于配制游离余氯溶液, 购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

配置F/2培养基, 混匀后, 在高温高压灭菌锅中灭菌50 min, 冷却后接种处于对数生长期的亚心形扁藻, 恒温适应5~7 d, 再用无菌F/2培养基稀释后分装到250 mL锥形瓶中进行试验。试验所用控温装置如下:在水族箱中使用DYMAX的一款迷你加温棒, 附带LED数显温控器, 使水温达到所需温度, 并使用小型潜水泵让水温均匀, 用温度计进行水温的实时监测。游离余氯只在试验开始前加入, 之后不再添加, 光照强度2 500 lx, 光暗比设定为14 h︰10 h, 每组设3个平行样, 每天人工摇动锥形瓶2~3次, 所有玻璃仪器使用前均经过高温灭菌处理。

1.2.1 温升试验

以21℃和28℃为对照组分别模拟春(秋)季和夏季, 试验组设置4℃的温升, 即25℃和32℃, 不加游离余氯, 试验周期为10 d。

1.2.2 游离余氯试验

设置温度条件为20℃, 次氯酸钠现用现配, 不加游离余氯的样品为空白对照组, 试验组分别加入0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L游离余氯, 试验周期为5 d。

1.2.3 温升和游离余氯耦合试验

设置试验温度为21、25、28℃。21℃作为对照组, 不添加游离余氯, 25℃和28℃作为试验组, 分别加入0.10、0.30 mg/L的游离余氯, 形成25℃ –0.1 mg/L、25℃ –0.3 mg/L、28℃ –0.1 mg/L和28℃ –0.3 mg/L的4个试验组, 试验周期为10 d。

1.3 分析测定与数据计算

游离余氯浓度:采用N, N-二乙基对苯二胺(DPD)分光光度法, 通过SYL-1B余氯仪(检测限为0.01 mg/L, 精度为0.01 mg/L)测定。

藻细胞密度:采用微生物血球计数板直接计数法, 在OLYMPUSCKX41倒置光学显微镜下进行细胞计数。

叶绿素a浓度与光系统Ⅱ最大光合潜力(F_v/F_m):用型号为PHYTO-PAM的浮游植物荧光仪(WAlZ, Germany)测定, 在室温下进行, F_v/F_m测定时暗适应时间不少于5 min。

相对细胞叶绿素a含量和生长抑制率分别用下式计算:

相对细胞叶绿素a含量=试验组细胞叶绿素a含量/对照组细胞叶绿素a含量

生长抑制率(%)=(对照组细胞密度–试验组细胞密度)/对照组细胞密度×100%

2 结果 2.1 温升对亚心形扁藻的影响

我国东海近岸水域春秋季平均水温约为21℃, 夏季平均水温约为28℃, 而根据我国《海水水质标准》(GB3097-1997)中的规定: “第三类、第四类海域认为造成的海水温升不超过当时当地4℃”, 故本实验分别以21℃和28℃为对照, 设置了4℃的温升, 模拟海滨电厂春秋季和夏季温排水对亚心形扁藻的影响。图 1为温升对亚心形扁藻细胞生长的影响。模拟春(秋)季(21℃)和夏季(28℃)条件下, 培养10 d后, 藻细胞密度分别增加了16.38倍和4.65倍。模拟春(秋)季温升4℃条件下, 亚心形扁藻仍然持续增殖, 但增殖趋势略缓, 培养10 d后, 藻细胞密度增加了13.37倍; 当温升达到7℃, 即28℃, 水温达到夏季温度水平, 藻细胞增殖趋势减缓更为明显。而在模拟夏季条件时, 仅温升4℃, 亚心形扁藻增殖则受到显著抑制(P < 0.05), 随着培养时间增加, 细胞密度趋于减少, 培养10 d后, 藻细胞密度仅为初始值的36.98%。结果表明高温不利于亚心形扁藻生长, 温升会导致亚心形扁藻增殖趋势减缓, 甚至会导致其逐渐消亡。图 1c进一步比较了温升对亚心形扁藻的抑制作用。结果显示, 模拟夏季条件下温升对亚心形扁藻的抑制作用显著高于春(秋)季条件, 夏季温升时抑制率持续增加直到培养第10天 > 90%, 这进一步说明亚心形扁藻对夏季温升更为敏感。

图 2为温升对亚心形扁藻光合作用的影响。实验结果显示, 模拟春(秋)季温升条件下亚心形扁藻F_v/F_m值在培养初期较对照组略有降低, 在培养中期降低趋势明显, 但是在培养结束时温升组F_v/F_m值反而超过了对照组; 模拟夏季温升条件下亚心形扁藻F_v/F_m值则显著下降, 反映了夏季温升将直接损伤亚心形扁藻的光合反应系统。相应地从单位细胞叶绿素a含量的变化趋势来看, 培养初期模拟春(秋)季温升对单位细胞叶绿素a含量无显著影响(P > 0.05), 而试验结束时温升组单位细胞叶绿素a含量反而更高, 而模拟夏季温升条件下, 单位细胞叶绿素a含量则显著上升, 这可能与存活的亚心形扁藻对温升的生态适应性有关。

2.2 游离余氯对亚心形扁藻的响应

图 3为不同游离余氯条件对亚心形扁藻细胞生长的影响。结果表明, 0.05 mg/L游离余氯浓度对亚心形扁藻细胞生长没有明显影响, 细胞可以持续增殖; 当游离余氯浓度超过0.1 mg/L时, 初期藻细胞生长都受到明显抑制, 且随着游离余氯浓度越高, 受抑制情况越明显; 但在2 d后藻细胞密度都有所恢复, 藻细胞重新趋于增殖状态。从抑制率情况来看(图 3b), 0.05 mg/L游离余氯处理时对藻细胞没有明显抑制作用, 随着游离余氯浓度增加, 抑制率上升明显; 但在0.2和0.3 mg/L时, 随着处理时间延长, 抑制作用下降; 而在0.4 mg/L处理时, 抑制率保持在50%左右。

图 4显示不同游离余氯浓度对亚心形扁藻光合作用的影响。实验结果显示, 初始游离余氯浓度为0.4 mg/L时, 第1天亚心形扁藻F_v/F_m值下降, 表明高游离余氯胁迫下短期内亚心形扁藻光合反应系统受到抑制或损伤, 但第2天之后F_v/F_m值都有所恢复; 而在游离余氯胁迫下, 单位细胞叶绿素a含量略有增加, 表明亚心形扁藻光合反应系统对游离余氯胁迫有一定适应性。

2.3 温升和游离余氯联合作用对亚心形扁藻的影响

由于单独温升实验已显示夏季温升条件下亚心形扁藻生长趋于停滞, 而游离余氯同样不利于其生长, 因此本试验部分仅研究春(秋)季温升与游离余氯联合作用。图 5为夏季温升和游离余氯联合作用时对亚心形扁藻细胞生长的影响。结果显示, 春(秋)季温升和游离余氯的联合作用不利于亚心形扁藻生长, 当游离余氯为0.1 mg/L, 温升为4℃和7℃时, 亚心形扁藻都仍处于生长趋势, 但较对照组增殖速度降低, 且温升7℃较4℃增殖趋势弱; 当游离余氯为0.3 mg/L, 温升为4℃和7℃时, 亚心形扁藻的生长受到明显抑制, 藻细胞密度趋于减少。从抑制率结果看, 同样显示游离余氯为0.3 mg/L, 温升4℃和7℃时, 对于亚心形扁藻生长具有显著抑制作用, 抑制率持续上升, 后期接近100%;相比单独游离余氯0.3 mg/L作用时, 抑制率仅为40%~20%, 且有生态适应的表现, 这说明对于亚心形扁藻而言, 温升和游离余氯联合作用可能增加对其生长的抑制余氯交互作用对亚心形扁藻光合作用的影响。结果显示, 0.3 mg/L游离余氯与温升交互作用时, F_v/F_m显著降低(P < 0.05), 且响应很快, 在第1天即降低到0.05以下, 之后虽然有所上升, 实验结束时仍然低于0.1, 而0.3 mg/L游离余氯和4℃温升单独作用时, F_v/F_m始终分别维持在0.48和0.55以上。0.1 mg/L游离余氯与温升交互作用时, F_v/F_m在第1天同样显著降低(P < 0.05), 但仅降低到约0.35, 之后逐渐恢复, 与对照组没有显著差异(P > 0.05)。表明尽管在单独作用时亚心形扁藻对游离余氯和温升胁迫有一定适应性, 当高游离余氯与温升交互作用时, 会对亚心形扁藻光合系统造成不可逆的破坏。从单位细胞叶绿素a含量看, 游离余氯与温升交互作用导致其显著降低(P < 0.05), 但低游离余氯组叶绿素a含量有所恢复, 试验结束时甚至高于对照组。

进一步地, 相同游离余氯条件下高温升组和低温升组细胞密度(除低游离余氯作用6 d后)、F_v/F_m和单位细胞叶绿素a含量均没有显著差异(P > 0.05), 但高游离余氯组细胞密度、F_v/F_m和单位细胞叶绿素a含量均显著低于低游离余氯组(F_v/F_m, P < 0.05)。

3 讨论

亚心形扁藻是常见的海洋单细胞绿藻, 对温度的适应范围较广, 在7~30℃范围以内都能生长繁殖, 最适温度约为20~28℃, 温度上升到33℃以上生长繁殖受到较大的抑制, 出现黄萎状态, 温度接近35℃时即大量死亡。陈晓娟等^[8]发现亚心形扁藻生长的最适温度为28℃, 在本实验中, 亚心形扁藻在21~28℃均能生长, 但随温度的升高细胞生物量降低, 当温度为32℃时, 细胞密度显著减少。电厂温排水排口温升可达7~12℃, 而4℃温升区域可达2~3 km^2[9]。在春(秋)季, 自然水体温度较低时, 虽然4℃的温升会导致亚心形扁藻的增殖减缓, 但并不显著, 温升达到7℃, 藻细胞的增殖将明显简化, 而在夏季, 自然水温较高, 已不利于亚心形扁藻的生长繁殖, 此时仅4℃的温升即对其造成较大的影响, 细胞密度和F_v/F_m都显著下降。夏季温升对浮游植物的伤害较大, 仅4℃的温升加剧了温度对其生长的抑制, 甚至出现大量死亡的现象^[10]。

温排水中游离余氯是影响海洋浮游植物生长繁殖的重要因素, 0.001 mg/L的游离余氯短时间内也可能会抑制其细胞的生长^[11], 0.2 mg/L的游离余氯可以直接杀死冷却水60%~80%的藻类^[12]。本实验中, 当游离余氯浓度为0.05 mg/L时, 亚心形扁藻细胞密度几乎不受影响, 细胞持续增殖; 当游离余氯浓度超过0.1 mg/L时, 亚心形扁藻的生长在短时期内受到抑制, 且随着游离余氯浓度的升高, 抑制作用越强, 但是随时间的增加, 细胞重新趋于增殖, 这与曾江宁等^[13]的研究结果基本一致。

光合活性与藻类的生长是密切相关的, F_v/F_m是反映藻类光合作用能力的指标, 可直接代表藻类的光合作用^[13]。结果表明, 温升和游离余氯对亚心形扁藻F_v/F_m均有影响。温度是影响藻类光合作用的因素之一, 温度过高或短期高温都会破坏叶绿素, 影响光合作用效率^[14], 春秋季, 4℃的温升单独作用时, 试验组亚心形扁藻的F_v/F_m在培养末期超过了对照组, 说明低温时亚心形扁藻对温升有一定的生态适应性; 夏季, 试验组亚心形扁藻的F_v/F_m始终低于试验组, 而且随培养时间的增加而显著降低, 这表明,高温时温升可直接损伤藻类光合反应系统。温排水中的游离余氯也是影响浮游植物光合作用的重要因素, 游离余氯的浓度超过藻类承受范围会破坏其光合系统, 光合作用能力下降^[13], 在本实验中, 当游离余氯浓度超过0.1 mg/L时, 亚心形扁藻F_v/F_m短时间内下降, 游离余氯越高受抑制越显著, 表明高游离余氯胁迫下短期内亚心形扁藻光合反应系统受到抑制或损伤, 但是随着培养时间的增加, F_v/F_m都有不同程度的恢复, 说明亚心形扁藻光合反应系统对游离余氯胁迫有一定适应性。

我国电厂大多是直流冷却方式的电厂, 温升一般在2~12℃^{[1, 15-17]}, 其加氯的方法主要有连续加氯、定时不连续加氯和间歇短时加氯三种方式, 一般电厂在加氯2.0 mg/L处理后, 冷凝器前余氯浓度达到1 mg/L, 出水口余氯浓度约为0.15~0.25 mg/L^[4], 电厂排水口附近水域温升和余氯浓度均较高, 而离排水口较远的水域, 温升和余氯浓度较低。从本研究的结果来看, 温升和余氯均不利于亚心形扁藻的生长, 余氯的影响更显著, 而温升会加剧余氯的毒性, 因此, 即使在离排口较远的水域(4℃温升区), 温排水仍然会导致亚心形扁藻数量减少, 而亚心形扁藻作为重要的饵料藻和初级生产者, 其数量减少会对海洋食物链造成负面影响; 同时核电厂周边若存在养殖区, 则也可能因为饵料藻活性及产率下降而受到影响。进一步的, 由于不同藻种对温排水的敏感性不同, 藻类种群结构可能受到影响, 生物多样性降低, 有害种或赤潮种增加^[18-19]。

4 结论

(1) 不同季节温升对亚心形扁藻生长的影响不同, 春(秋)季温升(21℃+4℃)条件下, 亚心形扁藻均可以持续增殖, 但温升条件下增殖趋势比对照减缓, 但单位细胞叶绿素a含量略有升高; 夏季温升(28℃+ 4℃)条件下, 亚心形扁藻的增殖则受到明显抑制; 亚心形扁藻对游离余氯非常敏感, 游离余氯浓度仅为0.1 mg/L时, 亚心形扁藻的增殖即受到抑制。

(2) 温升和游离余氯的联合作用不利于亚心形扁藻生长, 当游离余氯为0.1mg/L, 温升4℃和7℃时, 亚心形扁藻增殖速度降低, 且温升7℃较4℃增殖趋势弱; 当游离余氯为0.3 mg/L, 温升4℃和7℃时, 亚心形扁藻的生长受到明显抑制, 相比单独游离余氯0.3 mg/L作用时, 温升和游离余氯联合作用可能增加对其生长的抑制作用, 并且可能对其光合反应系统造成不可逆的破坏影响。