2018, Vol. 42
文章信息
- 刘伟, 赵超, 范嗣刚, 王鹏飞, 闫路路, 邱丽华. 2018.
- LIU Wei, ZHAO Chao, FAN Si-gang, WANG Peng-fei, YAN Lu-lu, QIU Li-hua. 2018.
- 斑节对虾GPx3a基因的分子克隆及表达分析
- Molecular cloning and expression analysis of glutathione peroxidase 3a gene from black tiger shrimp (Penaeus monodon)
- 海洋科学, 42(2): 141-149
- Marina Sciences, 42(2): 141-149.
- http://dx.doi.org/10.11759//hykx20170817002
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文章历史
- 收稿日期：2017-08-17
- 修回日期：2017-10-24
2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306
2. College of Aqua-life Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
活性氧分子(Reactive oxygen species, ROS)是一类在需氧细胞信号转导通路中行使重要生理学功能的生物分子, 但高浓度的ROS可通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡[1]。炎症、压力及呼吸作用均能引起机体的氧化应激, 导致主要细胞成分(脂类、蛋白或DNA)受到损害[2]。为清除过量的ROS过氧化物, 生物体会产生一些非酶类抗氧化剂(如α -生育酚、β-胡萝卜素、抗坏血酸和谷胱甘肽等)和一些抗氧化酶(如谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)等)[3]。
GPx不仅可以通过催化过氧化氢转化为水来调节细胞内信号的转导, 也可保护机体内细胞生物膜及其他重要成分[4]。目前, GPx在哺乳类、鱼类、昆虫类等多个物种中被克隆出来。GPx可分为两种类型: (1)含硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GPx), 可作用于无机过氧化物和有机过氧化物, 有由TGA编码的硒代半胱氨酸(Sec); (2)不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶, 其只作用于有机过氧化物[5]。生物体通过这两种类型的GPx, 以谷胱甘肽作为酶作用底物, 经氧化还原反应, 清除机体内过剩的ROS。在哺乳类中, Se-GPx有4种类型:细胞内型GPx(GPx1), 胃肠道型GPx(GPx2), 血浆型GPx(GPx3)和磷脂氢型GPx(GPx4)。GPx5和GPx6也被陆续从哺乳类中发现, 分析认为其为同源物。另外, 从哺乳类发现的GPx7, 其为不含硒代半胱氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶[6-8]。
在甲壳动物中, 刀额新对虾(Metapenaeus ensis)[9]、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)[10]、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)[11]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[12]、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)[13]等物种中的GPx被克隆出来并分析。研究表明, 当生物体遭遇病原体, 如哈维弧菌(Vibrio. harveyi)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、对虾白斑综合症病毒WSSV等入侵时, GPx表达量或活性大部分是上调的[3, 10, 14-15]。当生物体遭遇急性应激时, 其GPx的表达大多也是上调的[10, 12]。上调的GPx可以帮助机体清除多余的ROS[10]。
斑节对虾(Penaeus monodon)味道鲜美、营养丰富, 为东南亚海域及中国南海海域重要养殖经济水产种类[16-17]。近年来海洋环境污染日趋严重, 水体重金属及微生物等经常严重超标, 致使养殖对虾处于应激状态, 从而病害频发, 斑节对虾的养殖产业发展因此也受到严重影响[18-19]。因此, 本研究获得了斑节对虾PmGPx3a基因cDNA序列, 并对其在应激状态下的表达情况进行研究, 为深入了解斑节对虾的GPx家族基因整体特征及对其抗氧化作用奠定基础, 并为斑节对虾养殖的健康发展提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料实验用斑节对虾均来自于中国水产科学研究院南海水产研究所深圳实验基地, 体质量为(15±1)g, 水体温度控制在(25±1)℃。实验前在海水盐度为33水泥池中暂养3 d, 每天更换1/3海水, 投喂斑节对虾商业饲料(斑节对虾配合饲料, 广东双湖饲料有限公司)。实验前24 h停止喂食。取3尾斑节对虾解剖取肝胰腺、眼柄、胸神经、脑、血淋巴、鳃、胃、肠、心和肌肉等组织用于基因克隆和组织表达分析, 其余斑节对虾用于应激实验。
1.2 试验方法 1.2.1 总RNA提取和cDNA的合成用Trizol(Invitrogen, USA)方法提取上述所取的斑节对虾组织样品的总RNA, 溶于DEPC处理水中。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性, 使用NanoDrop 2000/2000c分光光度计测定浓度及纯度。根据SMARTTM RACE cDNA合成试剂盒(Clontech, USA)说明书操作, 以总1 μg RNA为模板, 逆转录合成cDNA和3′RACE cDNA, 用于基因全长的扩增及基因片段的验证。取1 μg总RNA, 用PrimeScriptRT Regent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)合成cDNA, 仅用于相对表达量检测。
1.2.2 PmGPx3a全长的扩增PmGPx3a相应的EST序列由作者实验室斑节对虾转录组测序结果(数据未发表)筛选取得, 采用降落PCR(touchdown PCR)技术, 以斑节对虾3′RACE cDNA为模板, 设计特异性引物(GPx3a-rF1: TCGCC GACTACAAGGGGAAGGT和GPx3a-rF2: AACCA GTTCGGGAAGCAAGAGCC), 扩增目的基因的3′末端, 并用headtotoe PCR (PmGPx3a-head: ATGTGGC GACCTACTGAG和PmGPx3a-toe: AAATTCCTGGC TCAGGAGGA)验证PmGPx3a开放阅读框ORF的正确性。
1.2.3 序列及系统发生分析利用NCBI数据库Blast在线软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析序列, 用SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白结构域和功能域的预测和分析, 利用ExPASY软件(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测氨基酸序列的理论等电点及分子量, 利用MEGA 6. 0 Neighbour-Joining方法构建系统进化树, 用texshade软件对不同物种同源序列进行多重序列比对。
1.2.4 PmGPx3a组织表达分析以得到的PmGPx3acDNA全长和内参基因EF-lα, 设计实时定量PCR引物(GPx3a-qF: AACCA GTTCGGGAAGCAAGAGCC和GPx3a-qR: CGTTC GCTGCTGGCTCTTGCTT、EF-lα -qF: TTCCGACTC CAAGAACGACC和EF-lα -qR: GAGCAGTGTGGC AATCAAGC), 对斑节对虾的不同组织(肝胰腺、胸神经、肌肉、眼柄、脑、鳃、心、胃、肠)中的表达量进行检测。反应总体系为12.5 μL, 6.25 μL的SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)、1 μL cDNA模板、0. 5 μL的上游引物qF和0. 5 μL的下游引物qR, 双蒸水补足至12.5 μL。反应条件为94℃预变性30 s; 94℃变性15 s, 60℃退火延伸30 s, 40个循环; 溶解温度从55℃升至97℃; 40℃冷却5 min, 使用Roche Light-Cycler 480Ⅱ实时定量PCR仪进行PCR。每个样品进行3个重复, 基因相对表达量用2–ΔΔCt法计算, 用“平均值±标准差”(X±SD)表示基因相对表达水平, 通过统计分析软件SPSS 21.0对实验结果进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析, 差异显著性结果表示为P < 0. 05。
1.2.5 斑节对虾盐度应激方法实验设置23和43(正常海水为33)2个盐度梯度, 使用淡水和海盐调整盐度, 并且每天用盐度计测定养殖水盐度并较准。实验组于4、8、16和32 h取3尾斑节对虾的肝胰腺和鳃, 于盐度33取3尾斑节对虾的肝胰腺和鳃作为0 h对照组, 并立即存于液氮中, 然后置于–80℃待用。
1.2.6 斑节对虾重金属胁迫方法重金属胁迫实验使用锌(Zn)、铜(Cu)、镉(Cd)3种重金属, 工作浓度据前人的研究[20-23]分别设为0.51、0.18和7.73 mg/L。用去离子水溶解3种重金属CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O和CdCl2·2.5H2O并配置成100倍的工作液。实验一共设为4组, 分别为对照组、Cu处理组、Cd处理组和Zn处理组, 实验组分别于处理的第6、12、24、48和96小时取3尾斑节对虾的鳃和肝胰腺, 对照组中加入等量的去离子水, 并取3尾斑节对虾的鳃和肝胰腺作为0 h对照。样品立即存于液氮中, 然后置于–80℃待用。
1.2.7 斑节对虾细菌刺激实验细菌刺激采用哈维弧菌和无乳链球菌, 因两者为革兰氏阴性菌和阳性菌, 互为对照, 可观测基因在这两种菌刺激下的表达变化情况。细菌刺激分为两个实验组和1个对照组, 实验组分别用哈维弧菌(V. harveyi), 和无乳链球菌(S. agalactiae)菌悬液注射刺激, 对照组注射PBS。哈维弧菌组每尾斑节对虾注射200 μL哈维氏弧菌悬液(1×107菌落形成单位/mL), 无乳链球菌组每尾虾注射200 μL无乳链球菌悬液(1×107菌落形成单位/mL), 对照组每尾虾注射200 μL PBS。并于注射后的0, 6, 24, 48, 72和96 h各取3尾斑节对虾的血淋巴, 离心后去上清留沉淀存于液氮中保存。
按照前述方法提取盐度应激、重金属胁迫及细菌注射刺激实验的组织总RNA, 按照上述方法逆转录合成cDNA, 取稀释后的cDNA为模板, EF-lα为内参进行定量表达分析, 反应体系、反应程序、数据处理方法同1.2.4。
2 结果 2.1 PmGPx3a的cDNA序列特征通过克隆得到的PmGPx3a cDNA全长1 135 bp, 经进化树分析, 命名为PmGPx3a(GenBank: KY204031)。开放阅读框(ORF)为651 bp, 5′非编码区(UTR)为100 bp, 3′UTR 384bp(图 1)。预测Pm GPx3a基因编码216个氨基酸, 理论分子量约24.7 kDa, 理论等电点是6.33。SMART分析表明, PmGPx3a氨基酸序列含有一个谷胱甘肽过氧化物酶活性位点序列(59~ 74aa)和一个典型的谷胱甘肽过氧化物酶结构域(93~ 100), 第71位氨基酸U为硒代半胱氨酸。
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| 图 1 PmGPx3a的核酸和氨基酸序列 Fig. 1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of PmGPx3a 两边每行标注的序号指核苷酸和氨基酸的位置:起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)用方框标出; poly(A)尾巴用斜体字标出; 单下划线标注为谷胱甘肽过氧化物酶活性位点序列; 双下划线标注为谷胱甘肽过氧化物酶结构域2序列; 波浪线标注为硒代半胱甘酸位点 The initiation code (ATG) and the termination code (TAA) are boxed. The glutathione peroxidase signature 2 is double underlined, and the glutathione peroxidase active site is underlined. The wavy line indicates selenocysteine |
用texshade软件对不同物种的GPx进行多重序列比对(图 2), 斑节对虾GPx氨基酸序列与其他物种中的GPx氨基酸序列高度保守。其中, PmGPx3a与刀额新对虾相似度最高(57%), 与斑节对虾GPx3同一亚型的GPx同源性为44%。与其他动物的同源性为:疣荔枝螺(Reishia clavigera)47%, 栉孔扇贝(Chlamys farreri)43%, 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)44%, 中华鳖(Pelodiscus sinensis)45%, 黄鳝(Monopterus albus)47%, 青鳉(Oryzias latipes) 45%, 普式野马(Equus caballus)47%。
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| 图 2 PmGPx3a的氨基酸序列与其他物种GPx的氨基酸多重序列比对 Fig. 2 Multiple alignments of the deduced amino acid sequences of GPx3a from Penaeus monodon and other species |
系统进化树分析显示(图 3), PmGPx3a与刀额新对虾GPx聚为一支, 再与斑节对虾GPx3a同一亚型的GPx3聚为一支。
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| 图 3 基于PmGPx3a氨基酸序列的NJ系统进化树 Fig. 3 NJ phylogenetic tree based on PmGPx3a amino acid sequences 编码GPx基因的GenBank号分别为:斑节对虾(P. monodon, KY204031);刀额新对虾(M.ensis, ACB42236.1);疣荔枝螺(Reishia clavigera, AET43964.1);中华鳖(Pelodiscus sinensis, NP_001303974.1);皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai, ADD71075.1);黄鳝(Monopterus albus, XP_020449011.1);栉孔扇贝(Chlamys farreri, ACF25901.1);菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum, ACU83220.1);青鳉(Oryzias latipes, XP_011478651.2);普式野马(Equus caballus, NP_001159955.1);斑节对虾GPx3(ALM09356.1) GenBank accession numbers encoded GPx1 are listed as follows: P.monodon (KY204031); M.ensis(ACB42236.1); Reishia clavigera (AET43964.1); Pelodiscus sinensis (NP_001303974.1); Haliotis discus hannai (ADD71075.1); Monopterus albus (XP_020449011.1); Chlamys farreri (ACF25901.1); Ruditapes philippinarum (ACU83220.1); Oryzias latipes (XP_011478651.2); Equus caballus (NP_001159955.1); P. monodon GPx3 (ALM09356.1) |
利用实时定量PCR技术对PmGPx3a在斑节对虾9种组织中的转录表达水平进行检测, 结果表明PmGPx3a在各个组织中均有表达, 在斑节对虾眼柄组织中表达量最高, 其次是胃、鳃, 在肝胰腺组织的表达量最低(图 4)。
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| 图 4 PmGPx3a在各组织表达情况 Fig. 4 Expression of PmGPx3a in different tissues HE.肝胰腺; TG.胸神经; M.肌肉; E.眼柄; B.脑; G.鳃; H.心脏; S.胃; I.肠; 图中数值为“平均值±标准差”(X±SD), 小写字母不同表示差异显著性(P < 0.05), 图 5~图 7同 HE. hepatopancreas; TG. thoracic ganglia; M, muscle; E. eye; B. brain; G. gill; H. heart; S. stomach; I. intestines; Each bar represents the mean ± SD (n=3). Different letters indicate statistically significant differences (P < 0.05), the same as Fig. 5–Fig. 7 |
通过荧光定量PCR检测, 在高盐度43和低盐度23胁迫过程中, PmGPx3a在肝胰腺的表达水平变化如图 5。结果显示, 在高盐度胁迫下, PmGPx3a相对表达量在第8小时上升到最大值, 是对照组的4.5倍, 显著高于对照组(P < 0.05)。在低盐度胁迫过程中, PmGPx3a相对表达量在32 h达到最高值, 是对照组的3倍, 显著高于对照组(P < 0.05)。
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| 图 5 斑节对虾肝胰腺和鳃中PmGPx3a在高低盐胁迫过程中表达变化情况 Fig. 5 Relative expression levels of PmGPx3a in the gills and hepatopancreas of shrimps under osmotic stress |
在高盐度43和低盐度23胁迫过程中, PmGPx3a在鳃的表达水平变化如图 5, 结果显示, 在高盐度胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体呈现下降趋势, 在16 h下降至最低, 显著低于对照组(P < 0.05)。
在低盐度胁迫过程中, PmGPx3a相对表达量总体呈先下降后上升的趋势, 在第8小时达到最低的相对表达量, 显著低于对照组(P < 0.05), 在32 h上升到最大值, 约为对照组的1.2倍, 显著高于对照组(P < 0.05)。
2.4 PmGPx3a在重金属胁迫下表达分析在铜、锌、铬胁迫过程中, PmGPx3a在鳃的表达水平变化如图 6a, 结果显示, 在铜胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体呈下降的趋势, 并在12 h达到最低值, 显著低于对照组(P < 0.05)。在铬胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体趋势为先上升后下降, 最高表达量在第24小时, 为对照组的1.4倍, 显著高于对照组(P < 0.05), 在第48小时达到最低相对表达量, 显著低于对照组(P < 0.05)。在锌胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体呈下降趋势, 在第24小时达到最低相对表达量, 显著低于对照组(P < 0.05)。
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| 图 6 斑节对虾鳃(a)和肝胰腺(b)中PmGPx3a在重金属胁迫过程中表达变化情况 Fig. 6 Relative expression levels of PmGPx3a in the gills and hepatopancreas of shrimps under heavy metal exposure |
在铜、锌、铬胁迫过程中, PmGPx3a在肝胰腺的表达水平变化如图 6b, 结果显示, 在铜胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体趋势为先上升后下降, 在第6小时达到最高水平, 约为对照组的7.8倍, 显著高于对照组(P < 0.05)。在铬胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体趋势为先上升后下降, 在第48小时达到最大值, 显著高于对照组4.8倍(P < 0.05)。在锌胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体呈现上升趋势, 在第24小时达到最大值, 显著高于对照组3.3倍(P < 0.05)。
2.5 PmGPx3a在细菌刺激下的表达分析在哈维弧菌和无乳链球菌刺激过程中, PmGPx3a在血淋巴的表达水平变化如图 7, 结果显示, 在哈维弧菌刺激下, PmGPx3a的相对表达量总体呈现上升趋势, 在24 h达到最大表达量, 显著高于对照组2.2倍(P < 0.05)。在无乳链球菌刺激下, PmGPx3a的相对表达量在第6小时达到最低相对表达量, 显著低于对照组(P < 0.05)。
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| 图 7 斑节对虾血淋巴中PmGPx3a在哈维弧菌和无乳链球菌刺激过程中表达变化情况 Fig. 7 Expression profiles of PmGPx3a mRNA in the blood of shrimps after V. harveyi and S. agalactiae infection |
在甲壳动物中, GPx可以通过催化过氧化氢转化为水来行使重要细胞内信号的转导作用[10, 24]。本研究成功克隆了PmGPx3a。通过BLAST对比, 证实GPx3a属于GPx家族, 具有硒代半胱氨酸位点, 含有一个典型的谷胱甘肽过氧化物酶活性位点序列(59~74aa), 含有一个典型的谷胱甘肽过氧化物酶结构域2(93~100), 可通过催化作用, 促进体内ROS转化成水而保护机体不被过度氧化。多重序列比对与系统进化树结果显示, PmGPx3a比较保守, 与刀额新对虾的一致性有57%。不同物种的GPx序列在进化上高度保守, 说明其在生物体中具有重要作用。
实时定量PCR结果表明, PmGPx3a在斑节对虾各个组织中均有表达。在眼柄中表达量最高, 其次是胃、鳃, 且表达水平有显著差异(P < 0.05), 在肝胰腺组织的表达量最低。不同的组织表达量代表PmGPx3a存在组织表达差异。
盐度胁迫是最常见的水生生物环境胁迫因子[25]。本研究通过改变斑节对虾所处的海水盐度, 检测PmGPx3a在不同盐度下的表达水平。实验结果显示, PmGPx3a在鳃中的相对表达量在两种盐度胁迫下基本为下降的, 而在肝胰腺中的相对表达量都为上升的, 推测原因是:斑节对虾经高低盐胁迫, 生物体产生一系列ROS, 而后生物体一些抗氧化酶活性升高, 以消除过量的ROS, 但由于鳃直接暴露于胁迫环境中, 首先直接受到高低盐环境的破害, 其血细胞颗粒细胞和小颗粒细胞产生一定的损伤, 故鳃中的PmGPx3a表达量为下调的。
一定浓度的重金属能影响斑节对虾蜕皮频率和生长率[26], 以往的研究也表明, 斑节对虾暴露于过量的重金属环境下, ROS活性显著增加, 造成机体生成过量的自由基, 从而对机体造成损伤[26-27]。GPx等抗氧化酶能通过氧化还原反应, 清除过量的自由基, 从而保护机体免受ROS的损伤。在本次重金属胁迫实验中, PmGPx3a在鳃中的相对表达量总体呈现下降的趋势, 在肝胰腺中的相对表达量总体呈现上升的趋势。在铜胁迫下, PmGPx3a在6 h达到最大值, 约为对照组的7.8倍, 显著高于对照组(P < 0.05);在铬胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体趋势为先上升后下降, 在第48小时达到最大值, 显著高于对照组4.8倍(P < 0.05);在锌胁迫下, PmGPx3a的相对表达量总体呈现上升趋势, 在第24小时达到最大值, 显著高于对照组3.3倍(P < 0.05)。这表明PmGPx3a在重金属胁迫的表达模式与高低盐应激的情况相同。斑节对虾暴露于过量的重金属环境, 一定程度上破坏了鳃细胞, 致使鳃中PmGPx3a表达量下降, 而肝胰腺因为重金属胁迫, 呼吸暴发活性显著增加, 造成过量自由基, PmGPx3a的相对表达量升高表明, PmGPx3a能够快速地参与到清除体内自由基的过程中, 保护机体免受重金属的损伤。
在甲壳动物免疫中, 吞噬作用可以产生多种活性氧, 在此过程中, 细胞膜结合复合物NADPH与外来颗粒结合, 并将氧分子还原成超氧化物离子, 随后导致生成过氧化氢、羟基自由基及许多其他反应性化合物[28-29]。研究表明, 海水养殖对虾中, 对虾细菌性疾病致病菌大多数为弧菌和气单胞菌, 即为革兰氏阴性菌[30], 但为研究PmGPx3a在细菌注射条件下的表达模式, 作者注射了两种菌:一种为革兰氏阴性菌, 即哈维弧菌, 一种为革兰氏阳性菌, 即无乳链球菌, 取血淋巴进行定量分析。结果表明:在哈维弧菌刺激下, PmGPx3a的相对表达量总体呈现上升趋势, 在24 h达到最大表达量, 显著高于对照组2.2倍(P < 0.05)。在无乳链球菌刺激下, PmGPx3a的相对表达量在6、24 h是下调的, 推测可能是生物体的GPx家族在受到不同的菌刺激时, 不同亚型的GPx面对不同的菌刺激, 产生的应答不同。生物体可能通过降低GPx3a的表达来应援GPx基因家族其他成员的高表达, 所以作者猜测, 机体应对无乳链球菌刺激时, 产生主要作用的GPx可能是GPx家族的其他成员。此现象表明, PmGPx3a在细菌刺激下, 对哈维弧菌的刺激更敏感。
综上所述, 本研究克隆获得了PmGPx3a cDNA全长, 分析了其氨基酸序列特征, 构建了不同物种Gpx的NJ系统进化树, 探讨了PmGPx3a在不同环境理化因子刺激下的表达变化, 结果表明了PmGPx3a参与斑节对虾应对环境胁迫的应激反应, 为深入探讨甲壳动物抗氧化基因家族的结构及功能提供了基础材料。
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