2018, Vol. 42
文章信息
- 鲁冰, 郑向南, 刘阳嘉, 谢莉萍, 张荣庆. 2018.
- LU Bing, ZHENG Xiang-nan, LIU Yang-jia, XIE Li-ping, ZHANG Rong-qing. 2018.
- 合浦珠母贝转录因子PF-CREB3L2基因的克隆和鉴定
- Cloning and mineralization-related functions of the PF-CREB3L2 gene in Pinctada fucata
- 海洋科学, 42(3): 77-83
- Marina Sciences, 42(3): 77-83.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20170424001
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文章历史
- 收稿日期：2017-04-24
- 修回日期：2017-06-20
2. 清华大学长三角研究院生物技术与医药研究所, 浙江 嘉兴 314006
2. Department of Biotechnology and Biomedicine, Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University, Jiaxing 314006, China
CREB(cAMP response element binding)蛋白全称cAMP应答元件结合蛋白, 该蛋白具有亮氨酸拉链的结构域, 可以与基因的启动子结合激活转录, 是一种转录增强因子[1]。Montrminy等[2]和Yamamoto等[3]分别通过亲和层析的方法, 从PCI2细胞系的核抽提物和大鼠的脑组织中, 分离纯化出了一种与cAMP应答元件结合的蛋白, 命名为cAMP应答元件结合蛋白。有关CREB蛋白的研究主要集中在CREB蛋白与记忆的相关研究中[4-5], 除此之外, CREB还与软骨的形成有着密切的关系。已有实验证明, 在转基因小鼠正在成长的软骨板中外源表达一种显性的CREB蛋白抑制剂(A-CREB), 会导致小鼠骨发育不良, 证明了CREB蛋白家族转录活化因子在软骨形成中具有重要作用[6]。
软骨形成是一个生物矿化的过程, 软体动物贝壳的形成过程也属于生物矿化[7]。贝壳主要有95%以上的碳酸钙以及不到5%的有机基质组成。而这不到5%的有机基质却对贝壳的形成过程具有重要的影响, 其过程也十分复杂[8]。这5%的有机基质主要包含蛋白质、糖蛋白、几丁质、酸性多糖等, 其中, 基质蛋白是参与生物矿化过程的一种重要蛋白。基质蛋白能够调控碳酸钙晶体的生长和排列方式, 在贝壳形成过程中具有重要的调控作用。基质蛋白鉴定和功能研究, 成为当下生物矿化研究领域的热点[9-11]。
合浦珠母贝(Pinctada fucata)是我国重要的珍珠贝, 目前已经发现多种合浦珠母贝生物矿化相关的基质蛋白, 其中, 如Prisilkin39, KRMP(lysine-rich matrix protein)等基质蛋白对贝壳的棱柱层形成会有影响, 还有一些基质蛋白如Nacrein等会影响贝壳珍珠层的形成[11-13]。基质蛋白在生物矿化的过程中, 会受到多种转录因子的调控。已经发现的转录因子包括PF-YY-1[15]、PF-AP-1[16]等。通过转录因子预测发现, 合浦珠母贝的Prisilkin39、Pearlin、KRMP、Nacrein等基质蛋白的启动子上可能存在与CREB结合的位点[15]。同时, 在NCBI的外套膜转录组数据库中可以找到CREB的unigene序列。
本研究对合浦珠母贝CREB的cDNA序列进行了克隆, 并命名为PF-CREB3L2, 通过对该蛋白在合浦珠母贝组织中的分布检测, 在贝壳损伤修复过程中的表达状况, 以及成体贝中该基因与基质蛋白表达的相关性分析, 探究了该蛋白在合浦珠母贝生物矿化过程中的功能, 以期为进一步丰富对合浦珠母贝生物矿化过程的认识, 以及探究合浦珠母贝贝壳形成的机制提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用合浦珠母贝购于广西壮族自治区北海市珍珠贝养殖场, 在实验室用人工海水培养, 培养温度约17~19℃。
1.2 总RNA的提取与cDNA的合成以TRIzol法提取合浦珠母贝外套膜的总RNA, 利用1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测所提总RNA的纯度和浓度。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)试剂盒对所提取的RNA进行反转录, 合成合浦珠母贝外套膜组织的cDNA。
1.3 RACE实验克隆cDNA序列使用1.2中的方法提取合浦珠母贝的总RNA, 使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit (TAKARA)试剂盒反转录得到RACE-PCR的模板, 根据合浦珠母贝外套膜组织转录组数据库中的CREB的unigene序列, 设计3’和5’RACE的引物(表 1)。用所设计的引物和通用引物进行3’RACE和5’RACE扩增, 使用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)高保真酶, 退火温度52℃, 30个循环。凝胶电泳检测PCR结果, 将PCR产物转化到大肠杆菌中, 挑取阳性克隆, 送华大基因公司测序。根据测序结果, 拼接得到完整的PF-CREB3L2基因序列, 再使用PF-CREB3L2-F与PF-CREB3L2-R进行confirm PCR, 对cDNA序列进行验证。
| 引物名称 | 引物序列 |
| 3′RACE1 | TTGTCCATGTACTCATCGGAACTCA |
| 3′RACE2 | ATGAGGTGGCTAGAATGATAGATGG |
| 5′RACE1 | ACCATCTATCATTCTAGCCACCTCA |
| 5′RACE2 | GAGTTCCGATGAGTACATGGACAAT |
| PF-CREB3L2-F | TCTTGCAAGATTGGGTGCGAGGAG |
| PF-CREB3L2-R | GACAGTAGATCTGTCTGTGGCATAG |
| Nacrein-F | GGCTTTGGCGACGAACCGGA |
| Nacrein-R | ACACGGGGGAGTGGTCAGGG |
| Pearlin-F | TACTCATACTGCTGGATA |
| Peralin-R | TATCATCATCGGTGTAAC |
| Prisilkin39-F | CTGGAATGAGAGGATATG |
| Prisilkin39-R | TGCTGCTGTAATAACTATA |
| KRMP-F | AAGAAATGTCACCCTTGGGATTGG |
| KRMP-R | AATCATCGCCACCATATCCATCG |
| RT PCR-F | CTCCAACAACTGCGTCCCTA |
| RT PCR-R | TGGTGCCCATTGAAATGAAA |
| β-actin-F | GATGGTGCCGAGTATGTGGTA |
| β-actin-R | CGTTGATTATCTTGGCGAGTG |
利用在线网站对合浦珠母贝PF-CREB3L2进行序列分析, 包括开放阅读框预测(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi), 蛋白的信号肽预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 蛋白的理论相对分子质量以及理论等电点的预测(http://web.expasy. org/compute_pi/), 蛋白的功能结构域预测(http://smart.embl-heidelberg.de/index2.cgi)等。
1.5 实时定量PCR用PrimeScript® RT Master Mix Perfect Real Time (Taraka)试剂盒将所提取的RNA反转录成cDNA, 使用SYBRH Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit(Taraka)试剂, 利用实时荧光定量PCR仪(MX3000P)进行Realtime PCR实验, 检测PF-CREB3L2基因和Prisikin39、Pearlin、KRMP、Nacrein 4种基质蛋白的表达情况, 以β-actin基因作为内参[17]。本实验使用的引物见表 1。
1.6 贝壳损伤修复实验取40只生长情况良好, 壳高5~7 cm的合浦珠母贝, 分成8组, 每组5只。将40只贝壳边缘的同一位置剪掉5 mm的缺口, 在0、6、12、24、36、48、72、96 h后按1.2中的方法分别提取各组合浦珠母贝外套膜组织的总RNA, 并以1.5中的方法通过Realtime PCR实验, 检测PF-CREB3L2基因在贝壳损伤后的表达情况。
1.7 成体合浦珠母贝中基因表达相关性分析随机取15只成体合浦珠母贝(壳高5~7 cm), 测定PF-CREB3L2与基质蛋白的表达量。使用excel软件对不同合浦珠母贝中两者的表达量进行线性回归分析, 并计算R值与P值。
2 结果与分析 2.1 合浦珠母贝PF-CREB3L2基因的cDNA全长获取及序列分析通过RACE-PCR的方法获取的合浦珠母贝PF-CREB3L2基因cDNA全长序列, 见图 1。该基因的cDNA全长1 983 bp, 5′非编码区长度为149 bp, 3′非编码区长度为106 bp, 其中开放阅读框长度为1 728 bp, 编码的蛋白含有575个氨基酸残基。经过1.4中网站在线预测, 得到PF-CREB3L2蛋白大约63.5 kD, 理论等电点5.47, 是一个弱酸性蛋白, 信号肽预测结果显示:该蛋白不具有信号肽结构, 属于非分泌蛋白。二级结构预测发现, PF-CREB3L2蛋白具有一个亮氨酸拉链的结构域, 这符合CREB蛋白家族的特征, 可能是蛋白与启动子结合的区域。同源序列比对分析发现, 该蛋白与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的CREB3L2蛋白具有高达86%的相似性, 与光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的CREB3L2蛋白具有84%的相似性, 与海蜗牛(Aplysia californica)的CREB3L2蛋白具有70%的相似性, 符合在进化上的亲缘关系。
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| 图 1 合浦珠母贝PF-CREB3L2基因的cDNA序列及序列分析 Fig. 1 Bioinformatics analysis of the PF-CREB3L2 gene in Pinctada fucata (a)PF-CREB3L2基因的cDNA序列, 全长1 983bp, 编码575个氨基酸残基, *代表终止密码子。(b)PF-CREB3L2基因的二级结构, 蓝色区域代表亮氨酸拉链区 (a) The cDNA sequence of the PF-CREB3L2 gene, with a total length of 1983 bp, encoding 575 amino acid residues, and * for the stop codon. (b) The secondary structure of the PF-CREB3L2 gene. Blue region, the leucine zipper region |
提取合浦珠母贝外套膜、内脏囊、足、鳃、生殖腺、闭壳肌6个组织中的RNA。使用1.5中的方法检测PF-CREB3L2基因在上述组织中的表达状况。结果显示, PF-CREB3L2基因在合浦珠母贝的各组织中均有表达(图 2)。在合浦珠母贝的内脏囊中表达量最高, 此外, 在外套膜和鳃的表达量也相对较高。
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| 图 2 合浦珠母贝PF-CREB3L2基因的组织分布 Fig. 2 The tissue distribution of the PF-CREB3L2 gene in Pinctada fucata 1.内脏囊, 2.外套膜, 3.生殖腺, 4.足, 5.闭壳肌, 6.鳃 1. Visceral mass, 2. Mantle, 3. Gonads, 4. Foot, 5. Adductor muscle, 6. Gills |
为了进一步探究PF-CREB3L2在生物矿化过程中的功能, 对合浦珠母贝的贝壳进行缺刻处理, 以检测贝类基因表达水平的变化[18]。实验结果如图 3所示, PF-CREB3L2基因在贝壳损伤修补过程中的表达量明显上升, 在贝壳损伤24 h时表达量达到最大值, 且在96 h时PF-CREB3L2基因的表达水平依然高于正常状态。这说明PF-CREB3L2基因对贝壳的损伤修复有应答且呈上调的趋势。此外, 检测了4种相关基质蛋白的表达状况, 结果如图 4所示, Prisikin39、Pearlin、KRMP、Nacrein 4种基质蛋白的表达量均有上升, 但它们的峰值均晚于PF-CREB3L2, 即出现在24 h以后。
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| 图 3 PF-CREB3L2基因在贝壳损伤修复过程中的表达情况 Fig. 3 The expression of the PF-CREB3L2 gene during the shell damage repair PF-CREB3L2的表达量在24h时达到最大值, 且96h时表达量仍高于正常水平 After the injury, the expression of the PF-CREB3LE gene increased rapidly, reaching the maximum at about 24 h and remained higher than the normal level after 96 h |
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| 图 4 合浦珠母贝基质蛋白在贝壳损伤修复过程中的表达情况 Fig. 4 The expression of matrix protein of Pinctada fucata in the shell damage repair process (a) PRISILKIN39的表达情况, (b) Pearlin的表达情况, (c) KRMP的表达情况, (d) Nacrein的表达情况 (a) The expression of PRISILKIN39, (b) Pearlin, (c) KRMP, and (d) Nacrein |
为了探究PF-CREB3L2与基质蛋白的关系, 检测了其与基质蛋白在成体合浦珠母贝中表达的相关性。随机挑选15只合浦珠母贝成体, 通过Realtime PCR对它们外套膜内PF-CREB3L2与Peralin、Prisilkin39、KRMP、Nacrein4种基质蛋白的表达量分别进行检测, 结果如图 5所示。Prisikin39与KRMP在成体合浦珠母贝体内与PF-CREB3L2呈显著正相关(P＜0.05), Pearlin和Nacrein与PF-CREB3L2不具有显著的相关性。
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| 图 5 PF-CREB3L2与基质蛋白在成体贝中表达的相关性 Fig. 5 The correlation between PF-CREB3L2 and matrix protein expression in adult Pinctada fucata (a) PF-CREB3L2与PRISILKIN39的相对表达量, (b)PF-CREB3L2与Pearlin的相对表达量, (c)PF-CREB3L2与KRMP的相对表达量, (d)PF-CREB3L2与Nacrein的相对表达量。当P＜0.05时表明两者具有显著相关性, 即Prisilkin39和KRMP的表达与PF-CREB3L2具有显著相关性 (a) The relative expression level of PF-CREB3L2 and Prisiklin39, (b) PF-CREB3L2 and Pearlin, (c) PF-CREB3L2 and KRMP, (d) PF-CREB3L2 and Nacrein. When P < 0.05, a significant correlation was observed between the two. The expression of Prisilkin39 and KRMP significantly correlated with PF-CREB3L2 |
真核生物的基因表达会受到多种方式的调控, 其中, 在转录的起始阶段, 作用于基因启动子的调控模式十分常见。CREB是动物体内一种十分重要的转录调控因子, 已有研究发现其对神经和软骨发育等具有重要的作用[6]。PF-CREB3L2蛋白也具有与其他CREB蛋白相似的亮氨酸拉链结构, 可以与所调控基因的启动子片段结合来调控转录[3]。
外套膜是软体动物双壳类中最重要的生物矿化组织, PF-CREB3L2在合浦珠母贝的外套膜中有着很高的表达量, 可以推测其可能参与了生物矿化的过程。当贝壳受到损伤时, 软体动物会启动贝壳的修复机制, 在这一过程中, 与生物矿化相关基因的表达量通常会有明显的变化。本文贝壳损伤修复实验中, PF-CREB3L2的表达量迅速上升, 这暗示着PF-CREB3L2可能与生物矿化过程存在某种关联。Prisilkin39、KRMP、Nacrein、Pearlin4种基质蛋白在这一过程中表达量也有所上调, 这与之前对于这4种基质蛋白的研究结果一致[19]。但他们表达量上调的高峰期迟于PF-CREB3L2的出现。生物矿化的过程中, 基质蛋白发挥着十分重要的作用, PF-CREB3L2作为一种转录因子, 其高峰先于基质蛋白出现, 很可能是通过调控基质蛋白的转录来参与生物矿化。在成体合浦珠母贝中, 发现基质蛋白Prisilkin39和KRMP的表达与PF-CREB3L2存在着显著的正相关的关系, 推测PF-CREB3L2可能对基质蛋白具有转录调控的作用, 但与此同时, 基质蛋白Nacrein和Pearlin与PF-CREB3L2不存在显著的相关性, 这暗示PF-CREB3L2在调控基质蛋白转录的过程中可能具有一定的特异性。
合浦珠母贝的生物矿化调控是一个十分复杂的过程, 在早期的研究中, 已经发现PF-AP-1[15]、PF-YY-1[16]、PF-ALR-1[20]等调控因子, 它们都通过TGFβ信号通路完成调控的过程。已证实他们均可以通过与TGFβ信号通路中的一种重要蛋白smad家族结合来完成调控过程[21]。在后续的实验中, 可以通过探究PF-CREB3L2与PF-smad家族的结合来进一步了解PF-CREB3L2的功能。
除此以外, PF-CREB3L2在合浦珠母贝内脏团和鳃中表达量也较高, 这说明转录因子PF-CREB3L2还可能参与合浦珠母贝体内的其他生理过程。在哺乳动物中, CREB蛋白除了参与软骨发育外, 还参与着很多神经调控的过程[22]。因此, PF-CREB3L2还可能在合浦珠母贝的内脏团中参与着与神经调节相关的功能。
综上所述, 本研究获取了合浦珠母贝PF-CREB3L2转录因子的cDNA序列, 并对其参与合浦珠母贝生物矿化过程中的功能进行了初步研究。PF-CREB3L2转录因子可能正向调控合浦珠母贝中某些基质蛋白的表达, 以此调控生物矿化的过程。然而, 基质蛋白的表达调控是一个十分复杂的过程, 有多种转录因子的参与。PF-CREB3L2如何与其他转录因子共同作用调控生物矿化的过程, 还有待进一步研究。
| [1] |
Montminy M R, Sevarino K A, Wagner J A, et al. Identification of a cyclic-AMP-responsive element within the rat somatostatin gene[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986, 83(18): 6682-6686. DOI:10.1073/pnas.83.18.6682 |
| [2] |
Montminy M R, Bilezikjian L M. Binding of a nuclear protein to the cyclic-AMP response element of the somatostatin gene[J]. Nature, 1987, 328(6126): 175-178. DOI:10.1038/328175a0 |
| [3] |
Yamamoto K K, Gonzalez G A, Biggs W R, et al. Phosphorylation-induced binding and transcriptional efficacy of nuclear factor CREB[J]. Nature, 1988, 334(6182): 494-498. DOI:10.1038/334494a0 |
| [4] |
Gonzalez G A, Yamamoto K K, Fischer W H, et al. A cluster of phosphorylation sites on the cyclic AMP-regulated nuclear factor CREB predicted by its sequence[J]. Nature, 1989, 337(6209): 749-752. DOI:10.1038/337749a0 |
| [5] |
Schmid R S, Graff R D, Schaller M D, et al. NCAM stimulates the Ras-MAPK pathway and CREB phosphorylation in neuronal cells[J]. J Neurobiol, 1999, 38(4): 542-558. DOI:10.1002/(ISSN)1097-4695 |
| [6] |
White D M, Walker S, Brenneman D E, et al. CREB contributes to the increased neurite outgrowth of sensory neurons induced by vasoactive intestinal polypeptide and activity-dependent neurotrophic factor[J]. Brain Res, 2000, 868(1): 31-38. DOI:10.1016/S0006-8993(00)02259-9 |
| [7] |
Lowenstam H A. Minerals formed by organisms[J]. Science, 1981, 211(4487): 1126-1131. DOI:10.1126/science.7008198 |
| [8] |
Sudo S, Fujikawa T, Nagakura T, et al. Structures of mollusc shell framework proteins[J]. Nature, 1997, 387(6633): 563-564. |
| [9] |
Shen X, Belcher A M, Hansma P K, et al. Molecular cloning and characterization of lustrin A, a matrix protein from shell and pearl nacre of Haliotis rufescens[J]. J Biol Chem, 1997, 272(51): 32472-32481. DOI:10.1074/jbc.272.51.32472 |
| [10] |
Suzuki M, Murayama E, Inoue H, et al. Characterization of Prismalin-14, a novel matrix protein from the prismatic layer of the Japanese pearl oyster (Pinctada fucata)[J]. Biochem J, 2004, 382(Pt 1): 205-213. |
| [11] |
Zhang Y, Meng Q, Jiang T, et al. A novel ferritin subunit involved in shell formation from the pearl oyster (Pinctada fucata)[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2003, 135(1): 43-54. DOI:10.1016/S1096-4959(03)00050-2 |
| [12] |
Weiner S. Aspartic acid-rich proteins:major components of the soluble organic matrix of mollusk shells[J]. Calcif Tissue Int, 1979, 29(2): 163-167. |
| [13] |
Miyamoto H, Miyashita T, Okushima M, et al. A carbonic anhydrase from the nacreous layer in oyster pearls[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(18): 9657-9660. DOI:10.1073/pnas.93.18.9657 |
| [14] |
Suzuki M, Saruwatari K, Kogure T, et al. An acidic matrix protein, Pif, is a key macromolecule for nacre formation[J]. Science, 2009, 325(5946): 1388-1390. DOI:10.1126/science.1173793 |
| [15] |
Zheng X, Cheng M, Xiang L, et al. Cloning and identification of a YY-1 homolog as a potential transcription factor from Pinctada fucata[J]. Gene, 2015, 572(1): 108-115. DOI:10.1016/j.gene.2015.07.003 |
| [16] |
Zheng X, Cheng M, Xiang L, et al. The AP-1 transcription factor homolog Pf-AP-1 activates transcription of multiple biomineral proteins and potentially participates in Pinctada fucata biomineralization[J]. Sci Rep, 2015, 5: 14408. DOI:10.1038/srep14408 |
| [17] |
Jia G C, Liang J, Xie J, et al. cfMSP-1, an extremely acidic matrix protein involved in shell formation of the scallop Chlamys farreri[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 185: 34-41. DOI:10.1016/j.cbpb.2015.03.004 |
| [18] |
Mount A S, Wheeler A P, Paradkar R P, et al. Hemocyte-mediated shell mineralization in the eastern oyster[J]. Science, 2004, 304(5668): 297-300. DOI:10.1126/science.1090506 |
| [19] |
Carlezon W J, Duman R S, Nestler E J. The many faces of CREB[J]. Trends Neurosci, 2005, 28(8): 436-445. DOI:10.1016/j.tins.2005.06.005 |
| [20] |
Zhou Y, He Z, Huang J, et al. Cloning and characterization of the activin like receptor 1 homolog (Pf-ALR1) in the pearl oyster, Pinctada fucata[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2010, 156(3): 158-167. DOI:10.1016/j.cbpb.2010.02.012 |
| [21] |
Zhou Y, He Z, Li Q, et al. Cloning and expression pattern of a Smad3 homolog from the pearl oyster, Pinctada fucata[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2008, 40(3): 244-252. DOI:10.1111/j.1745-7270.2008.00399.x |
| [22] |
Carlezon W J, Duman R S, Nestler E J. The many faces of CREB[J]. Trends Neurosci, 2005, 28(8): 436-445. DOI:10.1016/j.tins.2005.06.005 |