2018, Vol. 42
文章信息
- 于秋寒, 平洪领, 闫允君, 史会来, 吕振明, 杨静文. 2018.
- YU Qiu-han, PING Hong-ling, YAN Yun-jun, SHI Hui-lai, LÜ Zhen-ming, YANG Jing-wen. 2018.
- 刺参GPR54-like受体基因克隆及特征分析
- Molecular cloning and characterization of GPR54-like receptor in the sea cucumber Apostichopus japonicas
- 海洋科学, 42(3): 92-100
- Marina Sciences, 42(3): 92-100.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20171220001
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文章历史
- 收稿日期：2017-12-02
- 修回日期：2018-01-14
2. 浙江省海洋水产研究所, 浙江 舟山 316022
2. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316022, China
GPR54(G-protein Coupled Receptor 54)是神经肽Kisspeptin的专一受体, 通过配体Kisspeptin激活后介导细胞信号转导进而行使一系列生理功能。Kisspeptin属于RF-酰胺肽家族, 其前体肽由145个氨基酸编码组成, 通过不同位点水解酶切, 可形成片段长度不同的酰胺化短肽, 常见活性肽为: Kisspeptin-54 (Kp54)、Kisspeptin-14(Kp14)、Kisspeptin-13 (Kp13)和Kisspeptin-10(Kp10)等。Lee等[1]1996年首次克隆鉴定了Kisspeptin编码基因KISS-1, 并认为Kisspeptin具有明显抑制肿瘤转移的生理功能; 为进一步研究其功能的调控机理, Lee等[2]开始关注其受体, 并从鼠脑中克隆得到受体GPR54;此后, 人们又鉴定了具有酰胺化末端的Kisspeptin神经肽是受体GPR54的内源性配体[3-5]。在后续的Kisspeptin/GPR54系统生理功能及临床医学研究中, 该系统在生殖发育调控及青春期启动发育等生理过程中的关键作用得到了进一步揭示[6]。
近年来, Kisspeptin/GPR54信号通路的生殖调控研究亦受到了人们的广泛关注并已经建立了完整的理论体系, 目前认为在哺乳动物中其主要作用过程主要有两条: (1)配体Kisspeptin通过激活下丘脑GnRH神经元表面GPR54受体, 介导一系列细胞信号转导, 刺激分泌释放GnRH, 进而通过HPG轴的调控生殖发育启动[7-9]; (2)刺激垂体GTH神经元, 介导细胞信号转导, 调控黄体生成素(LH)和促卵泡素(FSH)分泌, 进而影响生殖行为[10-11]。同时, 研究表明, 不同动物中GPR54所介导的信号转导通路相对保守, 主要通过与Gαq/11及Gαs蛋白偶联两条信号途径[12-13]。然而, 由于进化距离等原因, 有关Kisspeptin/GPR54系统的研究主要集中在脊椎动物中, 低等动物中仅有文昌鱼的Kisspeptin/GPR54系统有报道[14], 其他无脊椎动物中尚未证明该系统的存在, 更无相关生理调控功能的报道。
刺参(Apostichopus japonicus)属棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirotida)、刺参科(Stichopodidae)、仿刺参属(Apostichopus), 属于后口动物, 在无脊椎动物中进化地位高[15]。因此相比其他更为低等的无脊椎动物, 刺参中鉴定研究Kisspeptin/GPR54系统较为可行。中国的刺参主要分布于辽宁、山东、河北等北方沿海, 是中国重要的海水养殖经济动物[16]。由于刺参具有再生、夏眠、排脏、自溶等较为独特的生理现象, 其相关基础研究得到了人们的关注, 刺参全基因组测序的完成[17], 为进一步深入探究刺参生物学提供了理论基础。本文利用分子克隆、生物信息学分析、表达载体构建、体外表达等技术, 获得了刺参GPR54-like (Aj GPR54L)编码基因序列全长, 分析了GFP荧光蛋白融合表达AjGPR54L的亚细胞定位以及AjGPR54L在不同组织的转录表达差异, 初步探讨了GPR54受体结构与功能特征, 以期为深入揭示GPR54受体在刺参中的功能活性及调控机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料本文所用刺参于2016年4月取自山东青岛胶南刺参养殖场, 采捕刺参时池内水温为12.35℃, 体质量为79.7 g±4.7 g; 低温运至实验室, 暂养驯化一周, 池内水温控制在16℃±0.5℃, 盐度为31.0±0.5, 24 h不间断充气, 每天按时定量投喂人工配合饲料; 活体解剖获取刺参组织(呼吸树、消化道、体壁、肌肉、神经环、雌性性腺), 液氮冷冻保存。
1.2 总RNA提取将上述组织样品从液氮中取出, 液氮研磨后取30 mg样品, 参照Invitrogen TRIzol Reagent说明提取获得的总RNA样品用琼脂糖电泳检查RNA完整性, NanoDrop 2000超微量分光光度计检测RNA浓度, RNA置于-80℃冰箱保存备用。
1.3 刺参GPR54L全长cDNA扩增以提取的RNA为模版, Oligo-dT为逆转录引物, 使用Clontech公司SMARTScribe Reverse Transcriptase 42℃ 1h合成cDNA第一链, 根据转录组基因库中获取的GPR54核心序列信息, 通过序列分析, 使用primer 5.0引物设计软件设计5′RACE引物和3′RACE引物, 与试剂盒中的引物结合通过巢式PCR扩增GPR54基因全长序列的5′端和3′端。扩增后的PCR产物经琼脂糖电泳后, 用DNA回收试剂盒(Axygen)纯化回收后连接到pMD18-T(TaKaRa)载体上, 转化至E.coli DH5α感受态细胞, 经蓝白斑筛选, 挑选阳性克隆, 于LB培养基37℃摇床培养8~12 h后提取质粒, 送生工生物工程(上海)有限公司进行双向测序。所用引物序列见表 1。
| 引物 | 序列(5′-3′) | 功能 |
| 5′-outer | TGATAGTGGCCAAGTATCGTTC | AjGPR54L-5′ RACE |
| 5′-inner | GTCAGGTCCGAACACGCCAA | |
| 3′-outer | TACCGTCGTTCCACTAGTATTT | AjGPR54L-3′ RACE |
| 3′-inner | CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG | |
| AjGPR54L-vec-F | CCCAAGCTTATGGCTGACAACCTG | AjGPR54L-EGFP 载体构建 |
| AjGPR54L-vec-R | CGGGATCCTACAACTGAGAGCTAAGT | |
| AjGPR54L-q-F | TACAGAGGTATTTAGCGGATTGACG | AjGPR54L-qRT-PCR |
| AjGPR54L-q-R | GGTCTTCATCTTCCTACTGCCATT | |
| ACTB-F | AAGGTTATGCTCTTCCTCACGC | 内参基因 |
| ACTB-R | GATGTCACGGACGATTTCACG | |
| TUBB-F | CACCACGTGGACTCAAAATG | 内参基因 |
| TUBB-R | GAAAGCCTTACGACGGAACA |
为了更准确地了解刺参相关受体的序列特征和系统进化关系, 笔者对基因序列以及氨基酸序列进行了分析(表 2), 并将获得的数据进行整理比对。
| 分析内容功能与作用 | 网络平台或软件名称 |
| 预测等电点和相对分子质量 | Compute pI/Mw (http://web.expasy.org/compute_pi/) |
| 查找糖基化位点(N-X-S/T) | NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) |
| 查找磷酸化位点 | NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) |
| 预测二硫键位置 | ScanProsite tool (http://prosite.expasy.org/scanprosite/) |
| 寻找信号肽 | SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) |
| 序列同源性比对分析 | NCBI进行Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) |
| 预测蛋白跨膜结构域 | TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) |
| 预测蛋白功能结构域 | InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html) |
| 预测蛋白三级结构 | SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) |
| 序列多重比较 | BioEdit软件 |
| 构建系统进化树 | MEGA5.0软件 |
| 预测氨基酸序列 | DNAMAN8.0 |
基于AjGPR54L基因序列特征和表达载体特征, 使用primer5.0在线软件设计正向引物(AjGPR54L- vec-F)和反向引物(AjGPR54L-vec-R)扩增AjGPR54L CDS。使用限制性内切酶HindШ和BamHI双酶切扩增产物及空白质粒后, 将PCR扩增产物连接到pEGFP-N1表达载体上, 经转化扩增提取质粒、双酶切电泳检测为阳性后, 测序验证载体准确性, 并将构建的载体命名为AjGPR54L-EGFP。
1.6 转染及共聚焦显微镜观察HEK293细胞采用DMEM高糖完全培养基培养(DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗)。细胞培养在37℃、5% CO2、湿度衡定的恒温培养箱中。使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent (Roche)按其说明将AjGPR54L-EGFP转染至HEK293细胞, 12~16 h后, 将瞬时转染AjGPR54L-EGFP的HEK293细胞经胰蛋白酶处理后接种于载玻片上。24 h后, 膜荧光探针DiI染膜, 细胞核染料DAPI染核, 多聚甲醛固定后封片, 置于激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP5II)下检测荧光信号分布情况。
1.7 实时荧光定量PCR基于AjGPR54L ORF序列设计特异性引物(表 1)。以1.3中制备的cDNA为模板, 选择刺参β-actin (ACTB)和β-tubulin(TUBB)作为内参基因[18], 使用SYBR PrimeScriptTM逆转录试剂盒在ABI 7500 Real Time PCR仪上进行定量扩增, 实验重复3次。标准曲线和Ct值等由ABI7500 Real Time PCR仪自带的ABI7500 Real time PCR System Detection软件自动完成。使用2-△△Ct方法测定不同组织GPR54基因的表达量水平[19-20]。用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one way ANOVA), Duncan法多重比较检验组间差异的显著性, P < 0.05为差异显著。使用软件Origin 8.1绘制柱形图。
2 结果 2.1 AjGPR54L cDNA全长及预测氨基酸序列克隆获得的AjGPR54L序列全长为1454 bp, 包含993 bp的ORF(编码330个氨基酸)、191 bp的5′UTR和270 bp的3′UTR。预测蛋白质的相对分子质量为37.83 ku、等电点(pI)为9.81。通过预测发现AjGPR54L的氨基酸序列包含: 1个N-连接糖基化位点, 5个ASN-XAA-Ser/Thr序列, 1个细胞外的N端结构域(N9), 34个磷酸化位点, 包括13个丝氨酸(S27、S29、S98、S123、S 227、S230、S263、S268、S272、S294、S307、S322、S328)、16个苏氨酸(T4、T18、T33、T58、T65、T89、T94、T126、T137、T176、T182、T211、T222、T234、T271、T304)和5个酪氨酸(Y7、Y125、Y167、Y301、Y303)位点, 典型的7次跨膜结构, 3个胞外环(EC)和3个胞内环(IC)见图 1和图 2。另外, AjGPR54L具有GPCR视紫红质蛋白家族的典型特征, 在IC3区有1个保守的半胱氨酸, 1个典型的7tm_1结构域, 因此可判断AjGPR54L属于GPCR视紫红质蛋白家族成员。
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| 图 1 刺参AjGPR54L编码基因cDNA全长及预测氨基酸序列 Fig. 1 AjGPR54L cDNA sequence and deduced amino acid sequence 起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG), 终止密码子用*标出; ▲表示糖基化位点; □表示磷酸化位点; 灰色表示Asn-Xaa-Ser/Thr序列子; 下划线表示跨膜区; 左边的数字表示核苷酸和氨基酸的位置 The initiation codon (ATG) and the termination codon (TGA) are marked with *; the N-glycosylation sites are highlighted in ▲, the phosphorylation sites are labeled in □; Asn-Xaa-Ser/Thr-sequences are highlighted in grey; the seven transmembrane domains (TM1-TM7) are indicated by the black underline; the numbers on the left refer to the position of the nucleotides and the amino acids |
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| 图 2 AjGPR54L与多物种GPR54氨基酸序列比对 Fig. 2 Alignment of the deduced AjGPR54L amino acid sequence with other species 左侧物种名称及相应的登录号分别为: Branchiostoma floridae-文昌鱼(XP002611682.1)、Danio rerio-斑马鱼(NP001099149.2)、Mus musculus-小鼠(NP444474.1)、Homo sapiens -人(NP115940.2)。TM1-7分别表示7个跨膜结构区, IC1-3及EC1~3分别表示3个胞内环和3个胞外环。图中右侧23.5%, 30.0%, 19.5%, 18.6%分别代表AjGPR54L与文昌鱼、斑马鱼、小鼠、人GPR54的序列相似性 Species are listed on the left side of the figure and mentioned here with their Genbank accession numbers as follows: Branchiostoma floridae (XP002611682.1), Danio rerio (NP-001099149.2), Mus musculus (NP444474.1), and Homo sapiens (NP115940.2). The seven transmembrane domains (TM1-TM7) are marked with a black horizontal line above the sequence alignment. The three extracellular (EC) and the three intracellular (IC) rings are shown above the sequence alignment. The values 23.5%, 30%, 19.5%, and 18.6% listed on the right side of the figure represent the sequence similarity of AjGPR54Lwith B. floridae, D. rerio, M. musculus, and H. sapiens, respectively |
通过AjGPR54L氨基酸序列与文昌鱼、斑马鱼、小鼠、人等已鉴定活性功能的GPR54氨基酸序列的多序列比对分析发现, AjGPR54L与斑马鱼GPR54a同源性最高, 为30.0%, 而且与胞外N端和C端相比, 7次跨膜结构域相对比较保守(图 2)。利用Predict Protein网络平台预测了AjGPR54L的二级结构及其蛋白结合位点, 同时用SWISS-MODEL结构预测软件, 以Protein Data Bank中的5gli.1.A片段为模板, 加入人工矫正, 预测获得AjGPR54L的三维结构图(图 3)。
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| 图 3 预测的AjGPR54L的结构和各结构域 Fig. 3 Predicted AjGPR54L protein structure and the respective domains A.预测的AjGPR54L蛋白3D结构和7次跨膜区, 3个胞内环, 3个胞外环; B. AjGPR54L蛋白结合位点和跨膜区 A. Predicted 3D structure of the AjGPR54Lprotein. Seven transmembrane domains (TM1-TM7), three extracellular (EC) rings, and three intracellular (IC) rings are marked. B. AjGPR54L protein binding domain and transmembrane region |
为了探究AjGPR54L和其他物种GPR54之间的进化关系, 本研究从Genbank数据库中选取21条不同物种的GPR54氨基酸序列(包括预测信息), 用MEGA 5.0软件以最大似然法构建系统进化树(图 4)。通过BLAST同源搜索, 发现根据cDNA序列预测的刺参AjGPR54L首先与预测的紫球海胆GPR54聚为一支, 再与文昌鱼GPR54L-1聚为一支, 并与脊椎动物GPR54s相距较远。
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| 图 4 刺参GPR54和其他物种GPR54氨基酸序列系统进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of the GPR54 amino acid sequences between Apostichopus japonicus and other species GPR54s氨基酸序列登录号为: Apostichopus japonicus GPR54-like: MG199220; Strongylocentrotus purpuratus GPR54: XP_784787.2; Homo sapiens Kiss1r: NP_115940.2; Branchiostoma floridae GPR54L-1: XP_002611682.1; Danio rerio GPR54a: NP_001099149.2; Danio rerio GPR54b: NP_001104001.1; Sus scrofa Kiss1r: NP_001038089.1; Petromyzon marinus Kissr: ALF99945.1; Mus musculus Kiss1r: NP_444474.1; Macaca fascicularis Kiss1r: AEM36046.1; Carassius auratus GPR54a: ACK77792.1; Carassius auratus GPR54b: ACK77793.1; Anguilla anguilla Kiss1r: CCH26286.1; Anguilla anguilla Kissr2: CBV36798.1; Anguilla anguilla Kissr3: CCH26287.1; Chelonia mydas GPR54: EMP23809.1; Xenopus tropicalis Kiss1r: NP_001163985.1; Xenopus tropicalis GPR54-1b: NP_001165295.1; Xenopus tropicalis GPR54-1a: NP_001165296.1; Pelophylax esculentus GPR54: AGE31953.1; Rana catesbeiana GPR54: ACD44939.1; Ophiophagus hannah GPR54: ETE67150 |
为分析AjGPR54L亚细胞定位, 本文将构建的AjGPR54L-EGFP的融合表达质粒瞬时转染至HEK293细胞, 24 h后, DiI染膜, DAPI染核, 多聚甲醛固定后封片, 置于激光共聚焦扫描显微镜观察。观察结果显示:细胞成功转染AjGPR54L-EGFP, 可见明显的绿色荧光信号, 且分布在细胞膜上, 与DiI红色荧光重叠(图 5)。这一结果表明HEK293细胞中表达的AjGPR54L受体蛋白定位于细胞膜, AjGPR54L- EGFP蛋白中C-末端EGFP标记不影响AjGPR54L表达。
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| 图 5 融合表达蛋白AjGPR54L-EGFP在HEK293细胞中的亚细胞定位 Fig. 5 Confocal microscopy of HEK293 cells expressing the AjGPR54L-EGFP 细胞膜和细胞核分别用DiI(红色)和DAPI(蓝色)染色 Cells were stained with a membrane plasma probe (DiI) and a nuclei probe (DAPI) |
用实时荧光定量PCR方法, 以刺参ACTB和TUBB为内参基因, 对基因表达量进行校正, 检测成体刺参GPR54基因在刺参呼吸树、消化道、体壁、肌肉、神经环、雌性性腺中的定量表达, 结果(图 6)表明: AjGPR54L在刺参不同组织中均有表达但表达量存在差异, 在神经环中表达量显著高于其他组织; 在呼吸树、消化道、体壁、肌肉及雌性性腺中表达量差异不显著。
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| 图 6 GPR54在刺参不同组织中的相对表达量 Fig. 6 The relative expression of GPR54 in different tissues in Apostichopus japonicus 采用实时定量PCR定量检测, 表达量经多内参基因ACTB及TUBB几何平均值进行均一化处理。肩标不同字母表示差异显著(P < 0.05), 数值为均值±标准误, 样品量为6 The mRNA expression levels relative to geometric averaging of ACTB and TUBB mRNA levels were measured using real-time PCR. Values with different superscript letters indicate significant difference (P < 0.5). Values indicate the mean ± SD (n = 6) |
本文克隆得到的刺参GPR54 cDNA序列编码一个330个氨基酸的成熟蛋白。对所编码的氨基酸结构域进行分析表明, AjGPR54L具有7个典型的GPCR家族跨膜结构, 属于视紫红质蛋白家族成员。另外, 预测其含有1个潜在的N-连接糖基化位点、5个Asn-Xaa-Ser/Thr序列子和34个磷酸化位点, 这些位点可能参与调节蛋白质运输、定位、功能及信号转导等[21]。进一步的多序列比对分析表明:与其他物种的GPR54蛋白序列相比, AjGPR54L蛋白序列具有一定保守性, 尤其是在跨膜区。但与不同物种GPR54的N端和C端区域相似性较低, 可能与不同物种中对不同内源配体的结合特性不同及胞内信号转导相关因子结构差异相关。
GPCRs是众多生物调控及基础医学研究的重要研究对象, 目前研究已建立了许多GPCR超家族受体蛋白的三维结构、配体结合过程以及胞内信号转导的介导过程等研究模型[22-23]。GPR54属于GPCR超家族受体蛋白, 通过结合激动剂kisspeptin, 进一步激活胞内偶联的G蛋白并介导信号转导[12]。本研究利用生物信息学方法建立了AjGPR54L三维结构模型并分析了它的二级结构, 预测了其蛋白结合位点, 这些结合位点可能对GPR54与Kisspeptin配体结合及胞内信号因子相互作用相关。
G蛋白偶联受体位于细胞膜上, 具有7次跨膜结构, 通过感受细胞外的分子以激活胞内的信号转导通路。AjGPR54L的细胞膜定位对其功能活动至关重要, 本文发现其主要在细胞膜表达, 这表明所表达的AjGPR54L-EGFP细胞膜定位特性与7次跨膜的蛋白质三维结构特征一致, 且证明其C-末端融合表达的EGFP不影响AjGPR54L的表达及亚细胞定位。从而为进一步查明该受体与其配体之间的相互作用、以及阐明信号转导与调控机制提供了基础。
在脊椎动物中, Kisspeptin/GPR54系统主要行使生殖调控等生理功能[6, 24-25]。人体的青春发育启动直接受到Kisspeptin/GPR54系统的HPG轴的调控影响[26], 而GPR54受体基因表达主要分布于多个神经组织, 以接受Kisspeptin神经元分泌调控。但研究亦发现GPR54受体基因在胰脏等外周组织中亦有较高的表达分布[3], 说明Kisspeptin/GPR54系统亦可能参与了其他生理功能的调控, 这种GPR54受体基因的表达分布模式在鼠等其他哺乳动物中亦有类似发现[27-28]。本文通过qRT-PCR分析, 表明AjGPR54L在刺参多组织中广泛表达并存在明显差异, 神经环中表达显著高于其他组织。神经环是刺参的重要神经器官, AjGPR54L在神经环中的高水平表达, 与已报道的脊椎动物中GPR54的表达有相似之处, 但该基因是否参与某些神经元调控并通过神经内分泌系统调节某些生理过程, 尚有待进一步研究。
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