21世纪是海洋的世纪, 随着陆地资源紧缺、环境恶化等一系列严峻问题的出现, 海洋资源的开发和海洋科技的进步在社会经济的发展中居于日益重要的战略地位^[1]。目前糖尿病患病人数快速增长, 国际糖尿病联盟的最新资料显示, 截至2015年, 世界上约有4.15亿成年糖尿病患者, 据预测, 至2040年, 这个数字将增长至6.42亿。丰富的海洋资源富含大量的海洋中药, 为降糖药的开发或海洋保健食品的研制提供了新方向^[2]。本课题将海洋来源中药昆布和其他四味药食同源中药(桑叶、山药、枸杞、肉桂)进行科学组方为海昆桑, 利用链脲佐菌素2型糖尿病大鼠模型, 探讨海昆桑提取物的降血糖作用。昆布又名海带、纶布、裙带菜等, 是海带科植物海带Laminaria japonica Aresch.或翅藻科植物昆布Ecklonia kurome Okam.的干燥叶状体, 具有抗凝血、降血压、降血糖、免疫调节等多种生理活性^[3]。桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶; 山药为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎; 枸杞为茄科类枸杞属植物枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实; 肉桂是樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮, 此五种中药皆具有降血糖、降血脂、增强免疫力等作用^[3-8]。此研究的开展将为开发海洋降糖药物与制品提供科学理论依据。

1 材料 1.1 仪器

电子天平(LT5028, 常熟市天量仪器有限责任公司); 血糖仪(美国强生稳豪型)及其配套的血糖试纸(稳豪型); DFY-300型高速万能粉碎机(上海新诺仪器设备有限公司)。

1.2 药品和试剂

链脲佐菌素(Solarbio, S8050);二甲双胍(Sigma, BCBT7573);葡萄糖(青岛海智达生物科技有限公司); 羧甲基纤维素钠CMC-Na(青岛秀佰锐生物器材有限公司); 胆固醇(青岛至理生物技术有限公司); 柠檬酸及柠檬酸三钠(国产分析纯试剂); 红霉素软膏(青岛至理生物技术有限公司)。

昆布药材购自青岛医保城药品连锁有限公司, 经生药学鉴定是海带科植物海带Laminaria japonica Aresch.或翅藻科植物昆布Ecklonia kurome Okam.的干燥叶状体; 桑叶药材购自青岛医保城药品连锁有限公司, 经生药学鉴定是桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶; 山药药材购自青岛医保城药品连锁有限公司, 经生药学鉴定是薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎; 枸杞药材购自青岛医保城药品连锁有限公司, 经生药学鉴定是茄科类枸杞属植物枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实; 肉桂药材购自青岛医保城药品连锁有限公司, 经生药学鉴定是樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮。

1.3 动物

清洁级实验动物Wistar大鼠80只(为防止大鼠意外死亡, 故多准备实验大鼠), 体质量250~300 g, 雄性, 山东鲁抗医药股份有限公司提供, 许可证号: SCXK (鲁)2013-0001, 在青岛大学医学院实验中心饲养。

2 方法 2.1 供试品的制备过程

依据文献^[9-14]以及实验室前期在提取分离方面积累的经验, 称取昆布120 g并用剪刀剪成1 cm²左右的小块, 放入粉碎机中进行粉碎, 过20目筛。称取山药240 g、桑叶120 g、枸杞60 g、肉桂30 g并粉碎, 过20目筛, 与过筛后的昆布混合。将固体混合物水提3次, 每次加10倍量体积分数的水, 在80℃下提取4 h, 每次提取结束后用400目滤布过滤, 合并滤液, 减压真空干燥得到海昆桑水提取物粉末, 备用。

称取昆布120 g用剪刀剪成1 cm²左右的小块, 放入粉碎机中进行粉碎, 过20目筛。称取山药240 g、桑叶120 g、枸杞60 g、肉桂30 g并粉碎, 过20目筛, 与过筛后的昆布混合。将固体混合物用95%乙醇加热回流提取3次, 每次加10倍量体积分数的95%乙醇, 在70℃下提取4 h, 合并3次所得滤液, 干燥得到海昆桑乙醇提取物粉末, 备用。

2.2 糖尿病大鼠模型的制备

取健康的成年雄性Wistar大鼠80只, 饲养观察1周后, 随机取10只大鼠, 喂养基础饲料, 作为正常对照组。其他70只用添加有胆固醇的高脂饲料喂养, 通过腹腔注射链脲佐菌素STZ(40 mg/kg)建2型糖尿病大鼠模型, 注射STZ1星期后禁食不禁水12 h, 进行断尾取血, 即剪去大鼠尾巴尖上一段, 利用血糖仪测大鼠空腹血糖, 空腹血糖≥16.7 mmol/L的可判断为2型糖尿病大鼠模型^[15-16]。正常对照组大鼠同步注射等体质比的柠檬酸钠缓冲液。

2.3 糖尿病大鼠分组及降血糖试验

从造模的70只大鼠中(造模所测空腹血糖≥16.7 mmol/L)随机选取60只作为2型糖尿病大鼠模型, 并随机分为6组:模型组、阳性对照组(二甲双胍)、海昆桑水提物高剂量治疗组、海昆桑乙醇提取物低、中、高剂量治疗组, 本实验连同正常对照组一共7组。正常组为空白对照, 不做任何治疗; 模型组给予0.5% CMC-Na溶液; 阳性对照组给予对应的阳性药物, 即二甲双胍, 剂量为0.08 mg/kg; 海昆桑水提物高剂量治疗组灌胃剂量为0.8 g/kg, 海昆桑乙醇提取物高、中、低三组分别以0.8、0.4、0.2 g/kg的剂量灌胃。连续灌胃4周后, 每组大鼠皆禁食不禁水, 测定空腹血糖。

2.4 葡萄糖耐量试验

在饲养第4周末, 各组大鼠禁食12 h后, 断尾测血糖, 此时血糖定为0 h血糖; 单次给大鼠灌胃给药, 正常组(空白对照组)灌胃给予0.5% CMC-Na溶液。给药20 min后, 每组大鼠注射葡萄糖溶液2.5 g/kg, 断尾取血测试并记录给予葡萄糖溶液0.5、1、2 h后各组大鼠的血糖。

2.5 统计学方法

实验中所测数据通过spss 19.0进行统计, 经过双样本t检验和单因素方差分析, 数据用x±s表示。P < 0.05表示有统计学意义。

3 结果 3.1 给药后(链脲佐菌素)大鼠的一般变化情况分析

正常对照组:正常大鼠饮水量、进食量均表现正常, 毛色光亮毛发柔顺, 精神状态较好, 动作反应快且灵敏;

模型对照组:显示出“三多一少”的糖尿病临床症状, 即大鼠毛色失去光泽, 部分出出皮毛粘连情况, 身体明显瘦弱, 精神状态不佳, 表现为精神倦怠、活动量减少, 饮水量相较于正常对照组均明显增加, 糖尿病模型组大鼠摄食量和正常组相比也明显增加(表 1), 根据垫料情况可知尿量也显著增加。正常组大鼠体重随时间推移明显增加; 与正常组相比, 模型对照组大鼠体重明显降低; 与模型组相比, 在给药第3周、第4周末, 海昆桑乙醇提取物高、中、低以及海昆桑水提物高剂量组大鼠体重明显增加, 精神状态有所恢复(表 2)。造模成功率为88%。

3.2 海昆桑提取物对糖尿病大鼠血糖的影响

和正常组相比, 造模成功的各组大鼠空腹血糖含量明显升高, 有极为显著差异; 与模型组相比, 连续给药两周后, 海昆桑乙醇提取物中剂量组、水提物高剂量组空腹血糖含量明显下降, 有显著差异(P < 0.05), 而海昆桑乙醇提取物高剂量组空腹血糖含量降低, 表现出极为显著差异(P < 0.01)。结果表明, 海昆桑提取物具有降低血糖的作用, 且乙醇提取物高剂量组降血糖作用为最佳(表 3)。

3.3 海昆桑提取物对正常大鼠糖耐量的影响

与模型组相比, 海昆桑乙醇提取物中、高剂量组以及海昆桑水提物高剂量组在0.5、1、2 h的血糖值均低于模型对照组(表 4)。

4 讨论

本研究通过建立2型糖尿病大鼠模型, 灌胃给予海昆桑醇提物、水提物, 观察大鼠的一般情况(毛色、体质量、饮水量、摄食量、排尿量、精神状态、活动量等), 试验发现海昆桑提取物具有改善2型糖尿病大鼠一般状况的作用。

在本次利用2型糖尿病大鼠模型, 探讨通过灌胃给药, 给予海昆桑乙醇提取物、水提物对糖尿病大鼠空腹血糖的影响的实验中, 结果显示, 海昆桑乙醇提取物中、高剂量组以及水提物高剂量组对由链脲佐菌素构建的糖尿病大鼠模型有不同程度的降血糖作用, 其中海昆桑乙醇提取物高剂量组降低空腹血糖效果较好。

对葡萄糖耐量结果进行分析, 海昆桑乙醇提取物中、高剂量以及水提物高剂量组和模型组相比, 在0.5 h就达到了血糖峰值, 并在0.5 h后海昆桑乙醇提取物中、高剂量以及水提物高剂量组都降低了糖负荷后的血糖值, 试验表明海昆桑提取物具有改善2型糖尿病大鼠糖耐量异常的作用。

海洋生物资源是海洋药物研发或海洋保健食品研制的重要来源, 具有廉价的提取成本、无毒、对环境污染小等优势, 是研发降糖药物或海洋保健品的理想材料。本次对于海昆桑提取物降血糖作用的研究, 为进一步研发海洋来源治疗糖尿病的新型药物或保健品开辟了新途径, 提供了实验依据。