海洋科学  2018, Vol. 42 Issue (4): 120-126   PDF    
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20170921001

文章信息

赵业, 杨红生, 李秉钧. 2018.
ZHAO Ye, YANG Hong-sheng, LI Bing-jun. 2018.
刺参真核翻译起始因子基因(eif2s1)的cDNA克隆及表达分析
Molecular cloning of sea cucumber eukaryotic translation initiation factor (eif2s1) gene and its expression analysis
海洋科学, 42(4): 120-126
Marina Sciences, 42(4): 120-126.
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20170921001

文章历史

收稿日期:2017-09-21
修回日期:2017-12-10
刺参真核翻译起始因子基因(eif2s1)的cDNA克隆及表达分析
赵业1, 杨红生2, 李秉钧1     
1. 烟台大学 海洋学院, 山东 烟台 264005;
2. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071
摘要:夏眠是刺参(Apostichopus japonicas)应对夏季高温低氧等不良环境的重要生存策略, 而抑制高耗能的蛋白合成则是夏眠期机体有效降低能耗的重要环节。真核翻译起始因子eIF2是启动蛋白翻译的关键因子, 在蛋白合成调控中发挥了重要作用。本研究克隆分析了刺参翻译起始因子eIF2α亚基(eif2s1基因)全长cDNA序列及结构特征, 并测定了其在夏眠期间的时空表达模式。结果表明:刺参eif2s1基因序列较保守, 与紫海胆该基因同源性最高。同时, 刺参eif2s1基因在深度夏眠期组织中出现了不同程度的表达抑制, 可能参与了刺参夏眠蛋白抑制调控。
关键词刺参    夏眠    eif2s1基因    基因克隆    实时定量PCR分析    
Molecular cloning of sea cucumber eukaryotic translation initiation factor (eif2s1) gene and its expression analysis
ZHAO Ye1, YANG Hong-sheng2, LI Bing-jun1     
1. Yantai University ocean school, Yantai 264005, China;
2. Institute of Oceanology of the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China
Abstract: Aestivation is an important survival strategy for sea cucumber to overcome adverse environmental conditions such as high temperature and hypoxia in summer. Depression of energy-consuming protein synthesis is the crucial link that effectively reduces the body energy consumption during aestivation. As an important molecule initiating protein translation, the eukaryotic translation initiation factor eIF2 plays a key role in regulating protein synthesis. In this study, the complete cDNA sequence of the eif2s1 gene was cloned from the sea cucumber Apostichopus japonicus, and its structural characteristics and temporal and spatial expression patterns were further detected and analyzed during aestivation. Results showed that the deduced amino acid sequences of the eif2s1 gene of A. japonicus are conservative and have the highest similarity to those of its echinoderm cousin Strongylocentrotus purpuratus. The expression of eif2s1 was found to be downregulated during aestivation, suggesting its role in the regulation of protein synthesis depression during aestivation.
Key words: Apostichopus japonicus    aestivation    eif2s1 gene    gene cloning    real-time PCR    

夏眠是动物应对夏季高温、干旱、低氧及食物匮乏等不良环境的重要生存策略, 广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中。动物进入夏眠, 随着摄食停止和呼吸速率大幅度下降, 体外能源获取和体内ATP生成量均显著下降, 机体面临严重的能源危机。研究表明, 动物在夏眠期间代谢率大幅下降, 仅为正常时期的10%~30%, 发生明显的代谢减退[1]。此外, 为了维持体内能量稳态平衡, 高耗能细胞活动在夏眠期间尤其受到强烈抑制。蛋白质合成作为胞内能量消耗的最主要事件, 每合成1分子肽键就需水解4分子ATP[2]。因此, 抑制蛋白合成对于长期休眠动物的生存意义重大。已有研究证实, 在龟类的低氧胁迫[3]、鳉鱼胚胎的滞育[4]、哺乳动物的冬眠[5]及蜗牛夏眠[6-7]等过程中均出现了不同程度的蛋白合成抑制。

真核细胞的蛋白翻译是一个多步骤的复杂反应, 其中翻译起始阶段是最关键的调控位点之一。真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factors, eIFs)是一类在真核细胞中蛋白质翻译所必需的, 帮助形成正确的mRNA-核糖体复合物的蛋白质, 其在蛋白翻译的起始过程中扮演了重要角色[8]。目前已报道的真核翻译起始因子已有20余种, 大多数以多亚基复合物的形式发挥功能。其中, 真核翻译起始因子2(eukaryotic translation initiation factor 2, eIF2)是蛋白翻译起始最重要的调控位点。eIF2因子是由3个亚基(α、β和γ)组成的复合物, 是典型的GTP结合蛋白, 可与GTP、Met-tRNAi结合形成Met-tRNAi-elF-2-GTP三元复合物, 该复合物与游离的40S核糖体小亚基结合后再与mRNA的5′端相结合[9], 形成了蛋白翻译必需的43S前体起始复合物(PIC)。研究表明, eIF-2的α亚基可通过可逆磷酸化调控PIC形成的速率, 是整个蛋白翻译起始过程的关键限速因子。因而, eIF-2因子很可能是阐明休眠期间蛋白翻译调控机制的重要线索。目前研究表明, eIF-2在蜗牛夏眠和红耳龟低氧胁迫中均受到不同程度抑制[7, 10], 而海洋无脊椎动物在夏眠过程的相关研究领域尚未见报道。

刺参位列“海八珍”之首, 具有较高的营养和药用价值, 是我国海水养殖产业中的重要经济物种[11]。作为典型的温带物种, 刺参在夏季海水温度升高到一定范围后会迁移到较深、较安静的海底环境不动不食, 进入夏眠[12]。刺参夏眠长约100天, 期间完全停止摄食和运动, 并出现大规模代谢减退及消化道萎缩退化[13-15]。夏眠导致刺参养殖周期延长, 疾病易发, 抗逆性差, 养殖成本增加, 因此开展刺参夏眠研究具有迫切的产业需求。本研究利用RACE技术获得刺参翻译起始因子eif2s1基因全长cDNA序列并分析其结构; 利用qRT-PCR技术分析了刺参eif2s1基因在3个关键夏眠时期(非夏眠期、深度夏眠期和解除夏眠期)的4种组织中(肠道、呼吸树、肌肉和体壁组织)的基因表达模式, 旨在探究EIF2S1在刺参夏眠蛋白翻译调控中的作用, 为进一步揭示刺参夏眠内在分子机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 实验样品的获取

实验所用刺参(Apostichopus japonicas)取自烟台蓬莱养殖场, 分别于2016年5月(水温17℃)采集非夏眠组、2016年8月(水温28℃)采集深度夏眠组及2016年10月(水温18℃)采集解除夏眠组刺参。每阶段采集健康刺参30头, 体质量80~120 g, 现场解剖并快速获得肠道组织、呼吸树组织、肌肉组织和体壁组织, 冻存于液氮中备用。

1.2 总RNA提取与cDNA全长克隆

采用Trizol试剂提取3个夏眠阶段4种刺参组织的总RNA, 利用琼脂糖电泳检测总RNA完整性。根据前期刺参转录组数据库eif2s1基因部分序列设计特异性引物(表 1)[16], 利用SMART RACE cDNA末端扩增试剂盒(Clontech, USA)对eif2s1基因分别进行3′cDNA和5′cDNA全长克隆PCR, 按照试剂盒说明书进行PCR扩增反应。利用OMEGA公司的胶回收试剂盒回收获得胶块中的DNA, 连接至载体pMD19-T vector上, 并将连接产物转化到商品化感受态细胞JM109(Takara, Japan)中, 复苏1 h后涂在预先制备好的含氨苄的LB平板上过夜培养。挑取阳性克隆于SOC液体培养基中培养12~16 h。菌液PCR验证所获DNA条带大小后, 送华大基因测序公司进行DNA序列测序。

表 1 引物序列 Tab. 1 Primer sequences
引物名称 引物序列(5′-3′) 产物长度/bp
GSP EIF2S1F GACATCTGACGGAGCTCGAGAAACA
GSP EIF2S1R GGAAAAATGGTCGCCCTGGCTAT
UPM Long CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’Short
CTAATACGACTCACTATAGGGC
RT-EIF2S1F ACGTCGTATCCGATCCATAAAC 210
RT-EIF2S1R GATTCATATCCCAGCAGCTCTC
RT-TBF GAAAGCCTTACGACGGAACA
CACCACGTGGACTAAAATG
113
RT-TBR
1.3 基因序列分析及系统进化分析

敏利用DNAStar软件对所获得的序列进行拼接, 获得完整eif2s1 cDNA全长序列, 并分析基因的开放阅读框ORF(Open Reading Frame)和氨基酸组成。利用NCBI网站上的BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对所获取的eif2s1 cDNA序列和推导的氨基酸序列进行同源比对分析。利用SMART version 4.0工具(http://www.smart.embl-heidelberg.de/)预测氨基酸序列的功能结构域, 并用SWISS-MODEL (http:swissmodel.expasy.org/)预测蛋白质空间三维结构。利用Clustal W程序和MEGA 5.0程序进行eif2s1基因的多序列比对和系统进化树构建。

1.4 qRT-PCR分析eif2s1基因时空表达特征

利用qRT-PCR技术分析eif2s1基因在夏眠关键时期(正常生长期、深度夏眠期和解除夏眠期)各组织中(肠道、呼吸树、肌肉和体壁)的表达水平。以刺参组织RNA为材料(RNA提取方法同上), 利用PrimeScript® RT Master Mix Perfect Real Time (Takara, Japan)试剂盒反转录出第一链cDNA, 经适当稀释后作为qRT-PCR反应的模板。qRT-PCR反应以β-tubulin基因作为内参基因, eif2s1所用引物是在基因开放阅读框(open reading frame)序列基础上设计(表 1)。利用SYBRGreen® real-time PCR assay试剂盒(Takara, Japan)进行反应, 具体反应条件如下:反应条件为: (1)95℃预变性5 s; (2)95℃变性10 s, 60℃复性20 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环; (3)添加溶解曲线, 以检测扩增产物是否单一。每个反应设置3次重复, 利用2–ΔΔCT算法计算基因的相对表达量。每组样本量为5头, 利用SPSS18.0软件进行单因素方差分析组间的差异显著性, 视P<0.05为显著差异。

2 实验结果与分析 2.1 刺参eif2s1基因的cDNA克隆及序列分析

刺参eif2s1基因cDNA全长为2 239 bp, 其中包含135 bp的5′UTR区域和1 168 bp的3′UTR区域。该基因的开放阅读框(ORF)长度为936 bp, 共编码311个氨基酸。根据软件预测其蛋白质分子量为35.422 39 kDa, 等电点为4.80(图 1)。利用SMART在线工具分析刺参eif2s1基因的功能结构域, 结果表明该基因序列包括一个S1结构域(AA positions 14-87), 为核糖体蛋白与RNA结合的结构域(图 1中灰色标注区域); 一个eIF2α亚基结构域(AA positions 128-243), 为eIF2α亚基结构域(图 1中黄色标注区域); 此外, eif2s1基因氨基酸序列还包括一个低复杂区域(AA positions 92-106, 图 1中下划线标注), 而第51个氨基酸丝氨酸为磷酸化位点(AA positions: 51, 红色框标注)。该基因全长cDNA序列已经提交NCBI网站, 获得注册号为GenBank Accession No. KJ026541。使用SWISSmodel软件对EIF2S1氨基酸序列进行三维结构预测, 结果如图 2所示。

图 1 刺参eif2s1全长cDNA序列及推导的氨基酸序列 Fig. 1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of eif2s1 of Apostichopus japonicus 灰色标注为S1结构域; 黄色标注为eIF2α亚基结构域; 下划线标注为低复杂区域; 红色框为磷酸化调控位点 S1 domain is indicated by shading, eIF2α subunit domain is marked by yellow, low complexity regions is indicated by underline, and the phosphorylation regulatory site is marked by red border

图 2 EIF2S1蛋白的三级结构预测图 Fig. 2 Three-dimensional structure prediction map of EIF2S1
2.2 序列同源性与系统进化树分析

将刺参EIF2S1序列在NCBI中的Blast同源比对分析发现, 刺参EIF2S1氨基酸序列与紫海胆Strongylocentrotus purpuratus (XP_003730643.1)的EIF2S1氨基酸序列同源性最高, 相似度为76%;而与鸭嘴海豆芽Lingula anatina (XP_013399389.1), 高山倭蛙Nanorana parkeri (XP_018426419.1)、热带爪蟾Xenopus tropicalis (NP_001005630.1)以及罗非鱼Oreochromis niloticus(XP_003446341.1)的EIF2S1序列的同源相似性分别为73%、72%、71%和70%, 表明该基因在不同物种间的保守性很强, 尤其是决定其活性的关键磷酸化调控位点-第51号丝氨酸在上述所有物种中均为完全保守(图 3)。

图 3 刺参EIF2S1多序列同源性比对 Fig. 3 Multiple sequence alignment of EIF2S1 amino acid sequence SP:紫海胆Strongylocentrotus purpuratus (XP_003730643.1); LA:鸭嘴海豆芽Lingula anatina (XP_013399389.1); ON:罗非鱼Oreochromis niloticus (XP_003446341.1); NP:高山倭蛙Nanorana parkeri (XP_018426419.1); XT:热带爪蟾Xenopus tropicalis (NP_001005630.1);黑框为磷酸化位点

以刺参和从NCBI获得的其他物种EIF2S1序列为基础, 利用NJ(neighbor-joining)方法构建系统进化树。结果表明, 刺参EIF2S1的进化地位与刺参生物学分类地位基本一致。且刺参EIF2S1与无脊椎物种EIF2S1同源关系比较接近, 其中棘皮动物门的紫海胆与刺参EIF2S1单独聚成一支, 同源关系最近(图 4)。

图 4 不同物种的EIF2S1系统进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of EIF2S1 amino acid sequences in A. japonicus and other species 系统发育树拓扑结构的可信度采用1000次重抽样来检测, 树形图分支上的数字代表其置信值。紫海胆(Strongylocentrotus purpuratus), XP_011669259.1;鸭嘴海豆芽(Lingula anatina), XP_013399389.1;高山倭蛙(Nanorana parkeri), XP_018426419.1;东方鲀(Takifugu rubripes), XP_003971790.1;热带爪蟾(Xenopus tropicalis), NP_001005630.1;罗非鱼(Oreochromis niloticus), XP_003446341.1;海牛(Trichechus manatus latirostris), XP_004371020.1;裸鼹鼠(Heterocephalus glaber), XP_004837426.2;家鼠(Rattus norvegicus), NP_062229.1;智人(Homo sapiens), NP_004085.1
2.3 刺参夏眠不同时期各组织中eif2s1基因的表达特征分析

利用q RT-PCR技术检测了夏眠关键3个时期刺参4种组织中eif2s1基因的表达模式(图 5)。在肠道组织中, eif2s1基因在深度夏眠期出现显著下调表达(P<0.05), 而在解除期表达量上调回正常生长期水平(P<0.05);在呼吸树组织中, eif2s1基因在夏眠各阶段表达量差异不显著; 在肌肉组织中, eif2s1基因在深度夏眠期表达量有微小下调, 但在解除夏眠期均出现了显著上调表达(P<0.05);在体壁组织中, eif2s1基因在体壁深度夏眠期表达显著下调(P<0.05), 而在解除夏眠期表达量大幅度上调(P<0.05)。

图 5 不同夏眠阶段刺参四种组织中eif2s1基因的相对表达量 Fig. 5 The relative expression levels of the eif2s1 gene of A. japonicus in four tissues during different aestivation stages
3 讨论

夏眠是动物应对夏季高温、干旱、低氧等恶劣环境条件的重要生存策略。由于夏眠期间动物停止运动和摄食, 严峻的能量危机使得机体会采取一切措施最大限度抑制高耗能过程, 以保证生命基础代谢的能量需求。蛋白翻译作为胞内消耗ATP极高的活动, 能量消耗约占细胞总能量的12%~25%, 因而蛋白合成在各类形式的休眠动物中均受到严格抑制[3-7]。机体抑制蛋白合成的调控机制有多种, 包括抑制核糖体的生成[17]、催化有活性的多聚核糖体分解为无活性的寡聚核糖体[18]及直接调控各类蛋白翻译因子等, 而最后一种调控方式目前研究最为深入[5-7, 19-20]。真核生物蛋白翻译起始因子是一类真核细胞中蛋白质翻译所必需的、保证正确的mRNA-核糖体复合物形成的蛋白质, 其中起始因子eIF2被认为是调控蛋白翻译过程的关键限速因子, 在压力应激下其α亚基可发生磷酸化修饰有效抑制蛋白合成[21]

本研究获取了编码刺参蛋白翻译起始因子eIF2α亚基的eif2s1基因全长序列, 结果表明该基因全长2239bp, 其中编码区(ORF)为936bp, 共编码311个氨基酸。序列结构包含一个S1结构域和一个低结构复杂性区域, 且第51位氨基酸丝氨酸为磷酸化位点, 与其他物种相同。氨基酸序列同源性分析表明, 刺参eif2s1基因序列保守性较高, 与紫海胆的同源相似度最高。NJ进化树结果表明刺参eif2s1基因的进化地位与刺参生物学分类地位基本一致。RT-PCR分析表明刺参eif2s1基因在深度夏眠期出现不同程度表达抑制, 而在解除夏眠期表达量反弹上调, 并呈现一定的组织特异性。在解除夏眠期间的肠道、肌肉和体壁组织中, eif2s1基因表达量增加明显, 这可能与这些组织恢复夏眠后蛋白合成量激增有关。值得一提的是, 我们前期的转录组数据显示包括eIF2、eIF4在内的蛋白翻译起始因子在刺参深度夏眠期均出现下调表达, 而在解除夏眠期表达量恢复上调[16], 而最近发表的刺参夏眠各阶段的蛋白质组学数据同样验证了蛋白合成的这一调控趋势[22]。这表明刺参在能量匮乏的夏眠期, 蛋白合成过程出现抑制而在解除夏眠期蛋白合成得以恢复, 而eif2s1基因的表达趋势与蛋白调控趋势相一致, 表明EIF2S1很可能参与了这一调控过程, 可能是夏眠蛋白合成抑制调控的潜在重要靶点。无独有偶, 大量研究表明其他物种动物在休眠期同样出现不同程度的蛋白合成抑制, 而elF-2参与其中[23]:如海水蜗牛Littorina littorea在低氧胁迫期间其转录和翻译过程均明显受到抑制, 且体内elF-2a磷酸化水平出现急剧上升[24]; 而在冬眠地松鼠Spermophilus tridecemlineatus的研究中发现, 中等核糖体的解聚水平和elF-2a磷酸化水平均出现上调[25]; 在褐鼠Microcebus murinus的休眠研究中同样出现了蛋白翻译抑制, 但表现在蛋白翻译因子eIF2α磷酸化水平变化不显著, 而eIF4E磷酸化水平明显增高[26], 这表明elF-2参与不同休眠物种的蛋白抑制调控方式有所差异。

综上所述, 蛋白翻译抑制作为机体控制能量消耗的主要策略广泛存在动物休眠中, 而eIF类翻译起始因子在蛋白合成调控中可能扮演着重要角色。本研究分析了刺参蛋白翻译因子eif2s1基因结构及在夏眠不同阶段的时空表达模式, 结果表明eif2s1基因可能参与了刺参夏眠蛋白抑制调控。最近研究表明可逆磷酸化是调控蛋白翻译起始因子活性的重要手段, 因此未来有必要开展刺参夏眠各阶段eif2s1基因的磷酸化修饰研究, 以进一步阐明其在刺参蛋白抑制调控中发挥的真正作用。

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