文章信息
- 刘晓玲, 刘军, 王振东, 王振华, 李彦伸, 崔龙波. 2018.
- LIU Xiao-ling, LIU Jun, WANG Zhen-dong, WANG Zhen-hua, LI Yan-shen, CUI Long-bo. 2018.
- 栉孔扇贝foxl2基因在卵子发生中的必要性
- Necessity of foxl2 in the oogenesis of the scallop Chlamys farreri
- 海洋科学, 42(4): 127-131
- Marina Sciences, 42(4): 127-131.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180323001
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文章历史
- 收稿日期:2018-03-23
- 修回日期:2018-04-10
FOXL2是一种转录因子, 其在脊椎动物卵巢中高表达, 并在卵巢发育和卵巢功能维持中发挥重要作用[1-4]。Uda等[5]研究发现:敲除foxl2基因的小鼠卵巢发育异常, 卵母细胞周围的体细胞无法完成形态分化, 卵泡发育受阻, 卵母细胞虽能启动分化, 但发育不正常。Unlenhaut等[6]发现在foxl2基因诱导缺失的成体小鼠卵巢内, Sox9的转录活性被激活, 组织学观察到小鼠卵巢体细胞重编程向雄性特征细胞转化。Schmidt等[7]发现在foxl2基因突变的小鼠卵巢中, 颗粒细胞分化失败, 致使卵巢中卵泡池逐渐耗竭, 卵母细胞闭锁。Foxl2基因在无脊椎动物中的研究报道有限[8]。本文作者[9]前期对foxl2在栉孔扇贝性腺中的表达进行了研究, 发现其具有卵巢特异表达特征, 但具体的功能研究尚未见报道。本研究建立了栉孔扇贝foxl2基因有效的RNA干扰方法, 在组织学水平确定栉孔扇贝foxl2干扰前后卵巢的组织结构变化, 分析了foxl2在栉孔扇贝卵子发生和卵巢发育中的作用, 为贝类配子发生和性腺发育研究提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 实验材料栉孔扇贝Chlamys farreri (壳高为6.02 cm±0.089 cm)购自烟台市芝罘区红利市场, 将健康的增殖期雌性(为卵巢发育初期, 卵原细胞紧贴滤泡壁上, 细胞核透亮。此时的滤泡腔较空, 少见卵母细胞[9])扇贝暂养在16℃左右的过滤海水中, 保持充气并每天更换海水。暂养期间以硅藻和绿藻为饵料进行投喂, 实验室内暂养3 d后进行后续实验。
1.2 RNA干扰实验 1.2.1 双链dsRNA的体外合成参照dsRNA设计原则[10-11], 根据前期获得的栉孔扇贝foxl2基因序列(GenBank注册号: JN642286)[9], 在避免与家族基因以及其他基因序列出现连续重复的基础上, 设计合成dsRNA片段的一对引物P1和P2(表 1)。
引物 | 引物序列(5′-3′) | 长度/bp |
P1 | TAATACGACTCACTATAGGGAGCGGAGGCAGTTTCAACAC | 442 |
P2 | TAATACGACTCACTATAGGGAGCTCCTCAAACTTCCGGCA | |
P3 | TTCTTGGGAATGGAATCTGC | 303 |
P4 | GCCAGACTCGTCGTATTCCT | |
P5 | CCAGTTTGCTCAACTGACGA | 103 |
P6 | CTGATGTGCTGAGGCATTGT | |
注:下划线处的序列为T7启动子序列。 |
采用柱式动物RNAout试剂盒(北京天恩泽公司)提取增殖期扇贝卵巢总RNA, 利用cDNA反转录试剂盒(大连宝生物公司)并按照说明将上述RNA反转录成为cDNA, 以cDNA做为模板, P1和P2为引物, 使用MEGAscript RNAi试剂盒(美国Ambion公司), 按其操作步骤合成栉孔扇贝foxl2 dsRNA, 利用核酸蛋白检测仪测定合成的dsRNA浓度, 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1.2.2 dsRNA注射和取样将上述暂养的健康雌性栉孔扇贝分为3组, 空白对照组(不注射组)、阴性对照组(注射PBS组)、实验组(注射dsRNA组), 每组25个个体, 分别置于200 L水体中启动实验。于实验起始时, 使用微量注射器分别从栉孔扇贝闭壳肌处多点注射, 实验组注射dsRNA(50 μg dsRNA溶于100 μL PBS中), 阴性对照组注射100 μL PBS, 一周后进行第二次注射。实验期间按照1.1的培养条件和日常管理方法培养栉孔扇贝, 于干扰后第12天每组取样。解剖取扇贝卵巢组织, 去除其中的消化道后, 迅速将其分成几份, 一部分于Bouin’s液中固定24 h, 用于后期组织切片观察, 一部分用液氮速冻, 保存于–80℃冰箱用于总RNA和总蛋白的提取。
1.3 qRT-PCR及其数据分析按照1.2.1的方法提取上述3个组RNAi第12天扇贝卵巢的总RNA并反转录为cDNA, 根据栉孔扇贝β-actin基因序列(GenBank注册号: AY335441)和foxl2基因序列分别设计内参引物P3/P4和特异引物P5/P6(表 1), 以扇贝β-actin为内参基因, qRT-PCR检测foxl2在各组织样本中的表达水平。qRT-PCR检测体系如下:引物(2 μmol/L)各1 μL, ROX 0.4 μL, 2×SYBR Green Master Mix 10 μL, RNAase-free水6.6 μL, cDNA模板(cDNA母液稀释10倍)1 μL。每组选取5个样本用于检测, 每个样本设一个重复。扩增产物进行溶解曲线分析以保证其特异性, 所得数据采用2–ΔΔCt的方法分析。
利用SPSS软件进行显著性分析(One-way ANOVA), 最小显著差法(Least Significant Difference, LSD)多重检验法进行统计分析(P<0.05表示显著水平)。
1.4 Western blotting(WB)检测利用蛋白提取试剂盒(上海生工生物工程公司)提取3个组RNAi第12天的栉孔扇贝卵巢总蛋白, 核酸蛋白检测仪检测蛋白浓度。选用兔抗β-Actin多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)调平各组织总蛋白的上样量, 采用WB技术并以本实验室自制的栉孔扇贝FOXL2多克隆抗体(抗性特异, 相关内容已投稿)为一抗检测各组(每组3个不同个体混合)卵巢中FOXL2蛋白的合成量。WB流程按文献[12]进行, 其中一抗为FOXL2抗体, 二抗为羊抗兔IgG, DAB显色, 凝胶成像系统拍照。
1.5 组织学切片观察Bouin’s液固定的各组栉孔扇贝卵巢组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡浸蜡、包埋处理后, 切片机切片(6 μm厚), 苏木精–伊红(H & E)染色, 中性树胶封片, Nikon E80i显微镜观察拍照。
2 结果 2.1 dsRNA的质量琼脂糖凝胶电泳检测, 本实验所合成的栉孔扇贝foxl2 dsRNA条带完整、无降解(图 1), 可以用于RNAi实验。
2.2 栉孔扇贝foxl2 mRNA敲降效率qRT-PCR检测, RNAi第12天实验组卵巢中的foxl2 mRNA表达量显著降低(图 2), 分别较相同时间空白对照组降低了62%, 较阴性对照组降低了66%;而两个对照组之间未见显著性差异。表明本实验合成的dsRNA可有效地降低栉孔扇贝foxl2 mRNA表达水平。
2.3 栉孔扇贝FOXL2蛋白在各组卵巢中的含量WB结果显示, RNA干扰第12天的实验组卵巢中FOXL2蛋白含量显著低于空白对照组和阴性对照组。
2.4 栉孔扇贝foxl2 RNAi后卵巢组织结构的观察RNA干扰后12天取样切片观察发现, 3个组栉孔扇贝的卵巢均发育至生长期的初期。切片显示实验组与对照组组织结构明显不同, 光镜下观察, 第12天的空白对照组与阴性对照组卵巢中的卵原细胞紧贴滤泡壁, 核透亮, 胞质具有嗜碱性; 滤泡壁上的卵母细胞胞质增多, 较卵原细胞体积变大, 其游离端向滤泡腔中突出, 随着发育, 卵母细胞体积进一步增大并进入滤泡腔中, 细胞具有更大、更透亮的细胞核并且核仁明显(图 4A, B, a)。但实验组卵巢滤泡中生殖细胞数量减少、体细胞比例相对增加, 部分卵原和卵母细胞形态异常(图 4C-D)。与对照组比, 实验组卵巢滤泡腔中的卵母细胞数量减少明显, 一些卵母细胞发生变形、细胞质嗜碱性增强, 大而透亮的细胞核在多数卵母细胞中消失了(图 4 C, c)。此外, 实验组存在个体差异, 选取切片的7个个体中有3个干扰个体的卵巢中不仅出现卵母细胞发育变形的情况, 甚至还可见少量类似精原细胞(精巢中紧贴滤泡壁的一些着色浅、核透亮、有核仁的细胞, 其形态较卵原细胞小)样的细胞(图 4D, d, E), 它们与空白对照组卵巢中的卵原细胞形态明显不同(图 4a)。
3 讨论RNA干扰是一种将外源合成的双链RNA(dsRNA)导入生物体内, 诱发其同源mRNA高效特异性降解的技术。RNA干扰的效果与dsRNA选择的区段、dsRNA的使用浓度以及导入方法有关。双链RNA被吸收的难易程度具有物种或者细胞的差异性, 因此不同物种导入dsRNA的方法不同。哺乳动物的细胞较难直接吸收dsRNA, 这一类物种的RNA干扰多借助于转染方法得以实施[13]; 而dsRNA似乎更容易进入无脊椎动物细胞中, 可以被细胞内吞[14]。近年来, 许多学者采用直接注射dsRNA的方法执行贝类靶基因RNA干扰实验, 并取得明显效果[15-18]。王芹等[19]通过闭壳肌注射siRNA的方法, 成功抑制了三角帆蚌外套膜细胞中靶基因的表达水平, 说明闭壳肌注射可以使干扰在组织间传递; Fabioux等[15]在研究牡蛎vasa基因的功能时发现, 即使干扰后的靶基因mRNA表达量仅下降了39%, 其性腺的表型变化已明显可见, 由此提出40%的下降水平是vasa mRNA干扰有效性的阈值; Du等[17]发现使用不同剂量的dsRNA敲降马氏珠母贝fam20C的mRNA, 其敲降水平(30%~50%)具有dsRNA剂量相关性。Yang等[20]对栉孔扇贝成体精巢中的klf4基因进行RNA干扰, 结果发现干扰后的精巢出现了雌雄同体的性腺表征, 在精巢中出现了卵原和卵母细胞。本研究使用闭壳肌注射dsRNA的方法实施栉孔扇贝foxl2 RNA干扰, 诱发其卵巢中mRNA水平下降了62%, 表明注入的dsRNA被卵巢细胞吸收, 干扰方法有效、干扰效率高。
根据栉孔扇贝foxl2 RNA干扰后卵巢结构的组织学观察, 发现滤泡中卵母细胞数量减少, 形态异常, 其细胞核发生程度不同的固缩, 卵子发生受阻, 表明foxl2是栉孔扇贝卵子发生的必需基因。Uhlenhaut等[6]研究发现FOXL2缺失的成体小鼠卵巢组织学发生改变, 出现类似精巢生精小管的结构, 大部分生殖细胞都消失了, 残留的卵母细胞也发生了形态退化, 卵巢颗粒细胞重编程转分化, 表现为类支持细胞的形态特征, 而本研究中, 在RNA干扰后的扇贝卵巢中也发现了类精原细胞。Uhlenhau等[6]发现FOXL2缺失后, 小鼠体内雄性相关的基因如Dax1, Dmart1, Dhh等, 尤其是Sox9基因的表达量都急剧上升, 认为FOXL2的作用机制是参与抑制雄性基因的表达来维持卵巢正常。Elzaiat等[21]发现FOXL2缺失的山羊卵巢中, 有三分之二的雄性特异基因上调表达, 而雌性相关基因仅有19个下调表达, 认为FOXL2主要是抑制雄性特异基因而不是激活雌性基因表达来发挥作用。Guiguen等[22]认为FOXL2在鱼类中通过参与类固醇雌激素的生成影响雌性分化和发育。但目前FOXL2的功能作用机制研究在无脊椎动物中几乎不可见, 其在栉孔扇贝卵子发生中是必需的, 但具体作用机制是否与上述文献中FOXL2的作用机制类似, 尚需要进一步的深入研究来明确。
[1] |
Alam M A, Kobayashi Y, Horiguchi R, et al. Molecular cloning and quantitative expression of sexually dimorphic markers Dmrt1 and Foxl2 during female-to-male sex change in Epinephelus merra[J]. Gen Comp Endocrinol, 2008, 157(1): 75-85. DOI:10.1016/j.ygcen.2008.03.018 |
[2] |
Govoroun M S, Pannetier M, Pailhoux E, et al. Isolation of chicken homolog of the FOXL2 gene and comparison of its expression patterns with those of aromatase duing ovarian development[J]. Dev Dyn, 2004, 231(4): 859-870. DOI:10.1002/dvdy.v231:4 |
[3] |
Nakamoto M, Matsuda M, Wang D S, et al. Molecular cloning and analysis of gonadal expression of Foxl2 in the medaka, Oryzias latipes[J]. Biochem Bioph Res Co, 2006, 344(1): 353-361. DOI:10.1016/j.bbrc.2006.03.137 |
[4] |
Oshima Y, Uno Y, Matsuda Y, et al. Molecular cloning and gene expression of Foxl2 in the frog Rana rugosa[J]. Gen Comp Endocr, 2008, 159(3): 170-177. |
[5] |
Uda M, Ottolenghi C, Crisponi L, et al. Foxl2 disruption causes mouse ovarian failure by pervaive blockage of follicle development[J]. Hum Mol Genet, 2004, 13(11): 1171-1181. DOI:10.1093/hmg/ddh124 |
[6] |
Uhlenhaut N H, Jakob S, Anlag K, et al. Somatic sex reprogramming of adult ovaries to testes by FOXL2 ablation[J]. Cell, 2009, 139(6): 1130-1142. DOI:10.1016/j.cell.2009.11.021 |
[7] |
Schmidt D, Ovitt C E, Anlag K, et al. The murine winged-helixtranscfiption factor Foxl2 is required for granulosa cell differentiation and ovary maintenance[J]. Developmental Disease, 2004, 131(4): 933-942. |
[8] |
刘晓玲, 刘建国, 张志峰. 基因foxl2的结构及表达调控[J]. 中国海洋大学学报, 2012, 43(3): 38-43. Liu Xiaoling, Liu Jianguo, Zhang Zhifeng. Structure and expression regulation of gene foxl2[J]. Periodical of Ocean University of China, 2012, 43(3): 38-43. |
[9] |
Liu X L, Zhang Z F, Shao M Y, et al. Sexually dimorphic expression of foxl2 during gametogen-sis in scallop Chlamysf arreri, conserved with vertebrates[J]. Dev Genes Evol, 2012, 222(5): 279-286. DOI:10.1007/s00427-012-0410-z |
[10] |
Doench J G, Petersen C P, Sharp P A. siRNAs can function as miRNAs[J]. Genes Dev, 2003, 17(4): 438-442. DOI:10.1101/gad.1064703 |
[11] |
Suzuki M, Saruwatari K, Kogure T, et al. An acidic matrix protein, Pif, is a key macromolecule for nacre formation[J]. Science, 2009, 325(5946): 1388-1390. DOI:10.1126/science.1173793 |
[12] |
萨姆布鲁克J, 拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂, 译. 3版.北京: 科学出版社, 2002: 1217-1232. Sambrook J, Russell D W. Molecular cloning experiment guide[M]. Huang Peitang, Translation. Third Edition. Beijing: Science Press, 2008. |
[13] |
董超华.克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功能分析[D].青岛: 中国海洋大学, 2009: 37. Dong Chaohua.Molecular cloning, Recombinant expression and fuctional analysis of two pattern recognition receptor from red swamp crayfish Procambarus clarkia[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2009: 37. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10423-2009160338.htm |
[14] |
Saleh M C, van Rij R P, Hekele A, et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing[J]. Nature Cell Biology, 2006, 8(8): 793-802. DOI:10.1038/ncb1439 |
[15] |
Fabioux C, Corporeau C, Quillien V, et al. In vivo RNA interference in oyster-vasa silencing inhibits germ cell development[J]. Febs Journal, 2009, 276(9): 2566-2573. DOI:10.1111/ejb.2009.276.issue-9 |
[16] |
Huvet A, Fleury E, Corporeau C, et al. In vivo RNA interference of a gonad-specific transforming growth factor-β in the pacific oyster crassostrea gigas[J]. Marine Biotechnology, 2012, 14(4): 402-410. DOI:10.1007/s10126-011-9421-4 |
[17] |
Du J Z, Liu C, Xu G R. fam20C participates in the shell formation in the pearl oyster, Pinctada fucata[J]. Scientific Reports, 2018, 23(1): 3563: 1-9. |
[18] |
Ma X S, Ji A C, Zhang Z F, et al. Piwi1 is essential for gametogenesis in mollusk Chlamys farreri[J]. PeerJ, 2017, 5(6): e3412: 1-14. |
[19] |
王芹, 汪桂玲, 陈亚, 等. RNA干扰沉默三角帆蚌HcCA3基因对贝类矿化作用的影响[J]. 基因组学与应用生物学, 2018, 37(2): 741-747. Wang Qin, Wang Guiling, Chen Ya, et al. Effect of silencing HcCA3 gene in Hyriopsis cumingii by RNA interference on mineralization of Shellfish[J]. Genomics ang Applied Biology, 2018, 37(2): 741-747. |
[20] |
Yang D D, Zhang Z F, Liang S S, et al. A novel role of Krüppel-like factor 4 in Zhikong scallop Chlamys farreri during spermatogenesis[J]. PLoS ONE, 2017, 12(6): e0180351: 1-16. |
[21] |
Elzaiat M, Jouneau L, Thepot D, et al. High-throughput sequencing analyses of XX genital ridges lacking FOXL2 reveal DMRT1 up-regulation before SOX9 expression during the sex-reversal process in goats[J]. Biol Reprod, 2014, 91(6): 153: 1-14. |
[22] |
Guiguen Y, Fostier A, Piferrer F, et al. Ovarian aromatase and estrogens: Apivotal role for gonadal sex differentiation and sex change in fish[J]. Gen Comp Endocr, 2010, 165: 352-366. DOI:10.1016/j.ygcen.2009.03.002 |