海洋科学  2018, Vol. 42 Issue (4): 127-131   PDF    
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180323001

文章信息

刘晓玲, 刘军, 王振东, 王振华, 李彦伸, 崔龙波. 2018.
LIU Xiao-ling, LIU Jun, WANG Zhen-dong, WANG Zhen-hua, LI Yan-shen, CUI Long-bo. 2018.
栉孔扇贝foxl2基因在卵子发生中的必要性
Necessity of foxl2 in the oogenesis of the scallop Chlamys farreri
海洋科学, 42(4): 127-131
Marina Sciences, 42(4): 127-131.
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180323001

文章历史

收稿日期:2018-03-23
修回日期:2018-04-10
栉孔扇贝foxl2基因在卵子发生中的必要性
刘晓玲, 刘军, 王振东, 王振华, 李彦伸, 崔龙波     
烟台大学 生命科学学院, 山东 烟台 264005
摘要:采用RNAi技术研究了栉孔扇贝(Chlamys farreri)foxl2基因在卵子发生和卵巢功能维持中的作用。使用体外合成的栉孔扇贝foxl2双链RNA(dsRNA), 以每只50 μg/次的剂量注射进闭壳肌中, 连续注射2次(第一次注射后7天, 再进行第二次注射); 以注射相同体积PBS(相同注射方法)的扇贝作为阴性对照组, 以不注射扇贝作为空白对照组。qRT-PCR检测干扰组扇贝卵巢中的foxl2 mRNA表达量较空白对照组下降了62%, Western blotting检测该蛋白在卵巢中的含量也明显下降, 显示靶基因的表达水平被有效地敲降。组织学观察发现, 栉孔扇贝foxl2干扰后的卵巢中卵母细胞形态异常、细胞核固缩, 卵子发生明显受阻。表明该基因在栉孔扇贝卵子发生中起重要作用。
关键词栉孔扇贝    卵巢    卵子发生    foxl2    RNAi    
Necessity of foxl2 in the oogenesis of the scallop Chlamys farreri
LIU Xiao-ling, LIU Jun, WANG Zhen-dong, WANG Zhen-hua, LI Yan-shen, CUI Long-bo     
College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China
Abstract: This study elucidates the foxl2 function in the oogenesis and ovarian maintenance of the scallop Chlamys farreri. We synthesized the C. farreri foxl2 dsRNA in vitro and then injected into the adductor muscle with 50 μg dsRNA for each scallop. The injection was administered two times; the second injection was on the 7th day after the first injection. The scallops injected with the PBS solution using the same volume and method were considered the negative control, and the scallops without any injection were the blank control. qRT-PCR revealed a 62% decline in the foxl2 mRNA level in the ovaries of RNAi scallops and an apparent reduction in the FOXL2 protein content in the RNAi ovaries, suggesting the effective knockdown in the foxl2 mRNA level. Furthermore, histologically, the abnormal oocyte morphology, enhanced eosinophilia of the cytoplasm, and nucleus pulsation were observed in the ovaries after RNAi, suggesting that oogenesis was apparently blocked. This study establishes that foxl2 plays a vital role in C. farreri oogenesis.
Key words: scallop    Chlamys farreri    ovary    oogenesis    foxl2    RNAi    

FOXL2是一种转录因子, 其在脊椎动物卵巢中高表达, 并在卵巢发育和卵巢功能维持中发挥重要作用[1-4]。Uda等[5]研究发现:敲除foxl2基因的小鼠卵巢发育异常, 卵母细胞周围的体细胞无法完成形态分化, 卵泡发育受阻, 卵母细胞虽能启动分化, 但发育不正常。Unlenhaut等[6]发现在foxl2基因诱导缺失的成体小鼠卵巢内, Sox9的转录活性被激活, 组织学观察到小鼠卵巢体细胞重编程向雄性特征细胞转化。Schmidt等[7]发现在foxl2基因突变的小鼠卵巢中, 颗粒细胞分化失败, 致使卵巢中卵泡池逐渐耗竭, 卵母细胞闭锁。Foxl2基因在无脊椎动物中的研究报道有限[8]。本文作者[9]前期对foxl2在栉孔扇贝性腺中的表达进行了研究, 发现其具有卵巢特异表达特征, 但具体的功能研究尚未见报道。本研究建立了栉孔扇贝foxl2基因有效的RNA干扰方法, 在组织学水平确定栉孔扇贝foxl2干扰前后卵巢的组织结构变化, 分析了foxl2在栉孔扇贝卵子发生和卵巢发育中的作用, 为贝类配子发生和性腺发育研究提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

栉孔扇贝Chlamys farreri (壳高为6.02 cm±0.089 cm)购自烟台市芝罘区红利市场, 将健康的增殖期雌性(为卵巢发育初期, 卵原细胞紧贴滤泡壁上, 细胞核透亮。此时的滤泡腔较空, 少见卵母细胞[9])扇贝暂养在16℃左右的过滤海水中, 保持充气并每天更换海水。暂养期间以硅藻和绿藻为饵料进行投喂, 实验室内暂养3 d后进行后续实验。

1.2 RNA干扰实验 1.2.1 双链dsRNA的体外合成

参照dsRNA设计原则[10-11], 根据前期获得的栉孔扇贝foxl2基因序列(GenBank注册号: JN642286)[9], 在避免与家族基因以及其他基因序列出现连续重复的基础上, 设计合成dsRNA片段的一对引物P1和P2(表 1)。

表 1 引物序列 Tab. 1 Sequences of the primers used in this study
引物 引物序列(5′-3′) 长度/bp
P1 TAATACGACTCACTATAGGGAGCGGAGGCAGTTTCAACAC 442
P2 TAATACGACTCACTATAGGGAGCTCCTCAAACTTCCGGCA
P3 TTCTTGGGAATGGAATCTGC 303
P4 GCCAGACTCGTCGTATTCCT
P5 CCAGTTTGCTCAACTGACGA 103
P6 CTGATGTGCTGAGGCATTGT
  注:下划线处的序列为T7启动子序列。

采用柱式动物RNAout试剂盒(北京天恩泽公司)提取增殖期扇贝卵巢总RNA, 利用cDNA反转录试剂盒(大连宝生物公司)并按照说明将上述RNA反转录成为cDNA, 以cDNA做为模板, P1和P2为引物, 使用MEGAscript RNAi试剂盒(美国Ambion公司), 按其操作步骤合成栉孔扇贝foxl2 dsRNA, 利用核酸蛋白检测仪测定合成的dsRNA浓度, 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.2.2 dsRNA注射和取样

将上述暂养的健康雌性栉孔扇贝分为3组, 空白对照组(不注射组)、阴性对照组(注射PBS组)、实验组(注射dsRNA组), 每组25个个体, 分别置于200 L水体中启动实验。于实验起始时, 使用微量注射器分别从栉孔扇贝闭壳肌处多点注射, 实验组注射dsRNA(50 μg dsRNA溶于100 μL PBS中), 阴性对照组注射100 μL PBS, 一周后进行第二次注射。实验期间按照1.1的培养条件和日常管理方法培养栉孔扇贝, 于干扰后第12天每组取样。解剖取扇贝卵巢组织, 去除其中的消化道后, 迅速将其分成几份, 一部分于Bouin’s液中固定24 h, 用于后期组织切片观察, 一部分用液氮速冻, 保存于–80℃冰箱用于总RNA和总蛋白的提取。

1.3 qRT-PCR及其数据分析

按照1.2.1的方法提取上述3个组RNAi第12天扇贝卵巢的总RNA并反转录为cDNA, 根据栉孔扇贝β-actin基因序列(GenBank注册号: AY335441)和foxl2基因序列分别设计内参引物P3/P4和特异引物P5/P6(表 1), 以扇贝β-actin为内参基因, qRT-PCR检测foxl2在各组织样本中的表达水平。qRT-PCR检测体系如下:引物(2 μmol/L)各1 μL, ROX 0.4 μL, 2×SYBR Green Master Mix 10 μL, RNAase-free水6.6 μL, cDNA模板(cDNA母液稀释10倍)1 μL。每组选取5个样本用于检测, 每个样本设一个重复。扩增产物进行溶解曲线分析以保证其特异性, 所得数据采用2–ΔΔCt的方法分析。

利用SPSS软件进行显著性分析(One-way ANOVA), 最小显著差法(Least Significant Difference, LSD)多重检验法进行统计分析(P<0.05表示显著水平)。

1.4 Western blotting(WB)检测

利用蛋白提取试剂盒(上海生工生物工程公司)提取3个组RNAi第12天的栉孔扇贝卵巢总蛋白, 核酸蛋白检测仪检测蛋白浓度。选用兔抗β-Actin多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)调平各组织总蛋白的上样量, 采用WB技术并以本实验室自制的栉孔扇贝FOXL2多克隆抗体(抗性特异, 相关内容已投稿)为一抗检测各组(每组3个不同个体混合)卵巢中FOXL2蛋白的合成量。WB流程按文献[12]进行, 其中一抗为FOXL2抗体, 二抗为羊抗兔IgG, DAB显色, 凝胶成像系统拍照。

1.5 组织学切片观察

Bouin’s液固定的各组栉孔扇贝卵巢组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡浸蜡、包埋处理后, 切片机切片(6 μm厚), 苏木精–伊红(H & E)染色, 中性树胶封片, Nikon E80i显微镜观察拍照。

2 结果 2.1 dsRNA的质量

琼脂糖凝胶电泳检测, 本实验所合成的栉孔扇贝foxl2 dsRNA条带完整、无降解(图 1), 可以用于RNAi实验。

图 1 电泳检测转录合成的dsRNA Fig. 1 The electrophoretic detection of the synthesized dsRNA 1. DNA Marker DL2000; 2-3. dsRNA产物; 4.对照(未加转录酶) 1. DNA Marker DL2000; 2-3. dsRNA product; 4. control (transcriptase not added)
2.2 栉孔扇贝foxl2 mRNA敲降效率

qRT-PCR检测, RNAi第12天实验组卵巢中的foxl2 mRNA表达量显著降低(图 2), 分别较相同时间空白对照组降低了62%, 较阴性对照组降低了66%;而两个对照组之间未见显著性差异。表明本实验合成的dsRNA可有效地降低栉孔扇贝foxl2 mRNA表达水平。

图 2 Foxl2 mRNA在栉孔扇贝卵巢中的相对表达量分析 Fig. 2 The level of foxl2 mRNA detected by qRT-PCR in C. farreri testes after RNAi 实验组卵巢中的表达量设置为1.0, 不同的字母(a, b)表示显著性差异(P<0.05) The expression level in the ovary of the experimental group was set as 1.00; different letters (a and b) indicate statistically significant differences (P < 0.05)
2.3 栉孔扇贝FOXL2蛋白在各组卵巢中的含量

WB结果显示, RNA干扰第12天的实验组卵巢中FOXL2蛋白含量显著低于空白对照组和阴性对照组。

图 3 Western blot检测RNA干扰后栉孔扇贝卵巢中的FOXL2蛋白含量 Fig. 3 The content of the FOXL2 protein detected by Western blotting in C. farreri testes after RNAi
2.4 栉孔扇贝foxl2 RNAi后卵巢组织结构的观察

RNA干扰后12天取样切片观察发现, 3个组栉孔扇贝的卵巢均发育至生长期的初期。切片显示实验组与对照组组织结构明显不同, 光镜下观察, 第12天的空白对照组与阴性对照组卵巢中的卵原细胞紧贴滤泡壁, 核透亮, 胞质具有嗜碱性; 滤泡壁上的卵母细胞胞质增多, 较卵原细胞体积变大, 其游离端向滤泡腔中突出, 随着发育, 卵母细胞体积进一步增大并进入滤泡腔中, 细胞具有更大、更透亮的细胞核并且核仁明显(图 4A, B, a)。但实验组卵巢滤泡中生殖细胞数量减少、体细胞比例相对增加, 部分卵原和卵母细胞形态异常(图 4C-D)。与对照组比, 实验组卵巢滤泡腔中的卵母细胞数量减少明显, 一些卵母细胞发生变形、细胞质嗜碱性增强, 大而透亮的细胞核在多数卵母细胞中消失了(图 4 C, c)。此外, 实验组存在个体差异, 选取切片的7个个体中有3个干扰个体的卵巢中不仅出现卵母细胞发育变形的情况, 甚至还可见少量类似精原细胞(精巢中紧贴滤泡壁的一些着色浅、核透亮、有核仁的细胞, 其形态较卵原细胞小)样的细胞(图 4D, d, E), 它们与空白对照组卵巢中的卵原细胞形态明显不同(图 4a)。

图 4 Foxl2 RNA干扰对栉孔扇贝卵巢影响的组织学观察 Fig. 4 Histological observation of C. farreri ovaries effected by the foxl2 RNAi A.空白对照组卵巢; B.阴性对照组卵巢; C, D.实验组卵巢; E.精巢; a, c, d.分别为A, C, D的局部放大图; 1.变形的卵母细胞; 2、3.类似精原细胞
Og.卵原细胞; Oc.卵母细胞; Sg.精原细胞; Fc.滤泡细胞。标尺: 50 μm
A. ovary of the vacuity control; B. ovary of the negative control; C, D. ovary of the experiment group; E. testis; a, c, d. magnified views of A, C, and D; 1. deformed oocyte; 2, 3. cells like spermatogonium
Og. oogonium; Oc. oocyte; Fc. follicular cell; Sg. spermatogonium. Scale bars: 50 μm
3 讨论

RNA干扰是一种将外源合成的双链RNA(dsRNA)导入生物体内, 诱发其同源mRNA高效特异性降解的技术。RNA干扰的效果与dsRNA选择的区段、dsRNA的使用浓度以及导入方法有关。双链RNA被吸收的难易程度具有物种或者细胞的差异性, 因此不同物种导入dsRNA的方法不同。哺乳动物的细胞较难直接吸收dsRNA, 这一类物种的RNA干扰多借助于转染方法得以实施[13]; 而dsRNA似乎更容易进入无脊椎动物细胞中, 可以被细胞内吞[14]。近年来, 许多学者采用直接注射dsRNA的方法执行贝类靶基因RNA干扰实验, 并取得明显效果[15-18]。王芹等[19]通过闭壳肌注射siRNA的方法, 成功抑制了三角帆蚌外套膜细胞中靶基因的表达水平, 说明闭壳肌注射可以使干扰在组织间传递; Fabioux等[15]在研究牡蛎vasa基因的功能时发现, 即使干扰后的靶基因mRNA表达量仅下降了39%, 其性腺的表型变化已明显可见, 由此提出40%的下降水平是vasa mRNA干扰有效性的阈值; Du等[17]发现使用不同剂量的dsRNA敲降马氏珠母贝fam20C的mRNA, 其敲降水平(30%~50%)具有dsRNA剂量相关性。Yang等[20]对栉孔扇贝成体精巢中的klf4基因进行RNA干扰, 结果发现干扰后的精巢出现了雌雄同体的性腺表征, 在精巢中出现了卵原和卵母细胞。本研究使用闭壳肌注射dsRNA的方法实施栉孔扇贝foxl2 RNA干扰, 诱发其卵巢中mRNA水平下降了62%, 表明注入的dsRNA被卵巢细胞吸收, 干扰方法有效、干扰效率高。

根据栉孔扇贝foxl2 RNA干扰后卵巢结构的组织学观察, 发现滤泡中卵母细胞数量减少, 形态异常, 其细胞核发生程度不同的固缩, 卵子发生受阻, 表明foxl2是栉孔扇贝卵子发生的必需基因。Uhlenhaut等[6]研究发现FOXL2缺失的成体小鼠卵巢组织学发生改变, 出现类似精巢生精小管的结构, 大部分生殖细胞都消失了, 残留的卵母细胞也发生了形态退化, 卵巢颗粒细胞重编程转分化, 表现为类支持细胞的形态特征, 而本研究中, 在RNA干扰后的扇贝卵巢中也发现了类精原细胞。Uhlenhau等[6]发现FOXL2缺失后, 小鼠体内雄性相关的基因如Dax1, Dmart1, Dhh等, 尤其是Sox9基因的表达量都急剧上升, 认为FOXL2的作用机制是参与抑制雄性基因的表达来维持卵巢正常。Elzaiat等[21]发现FOXL2缺失的山羊卵巢中, 有三分之二的雄性特异基因上调表达, 而雌性相关基因仅有19个下调表达, 认为FOXL2主要是抑制雄性特异基因而不是激活雌性基因表达来发挥作用。Guiguen等[22]认为FOXL2在鱼类中通过参与类固醇雌激素的生成影响雌性分化和发育。但目前FOXL2的功能作用机制研究在无脊椎动物中几乎不可见, 其在栉孔扇贝卵子发生中是必需的, 但具体作用机制是否与上述文献中FOXL2的作用机制类似, 尚需要进一步的深入研究来明确。

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