铜藻为我国沿海习见种, 广泛分布于我国辽宁、山东、浙江、福建、广东等地。铜藻植株高大, 枝叶繁茂, 成片漂浮于水面而形成海藻场, 为多种海洋生物提供了遮蔽、避敌、索饵、产卵、栖息生长的好处所。铜藻是我国浅海植被的珍贵物种, 暖温带海域营造海藻场, 生物修复海洋生态的首选品种。铜藻是藻胶工业的优质饵料, 因富含有益的生源要素而被广泛应用到医药、食品、饲料和有机肥料方面^[1]。

近年来, 随着陆地经济的发展, 对海洋的污染不断加剧, 大型海藻的生境受到破坏, 许多海藻的资源量也下降^[2]; 此外, 作为重要工业原料的褐藻胶需求量不断增加, 依靠自然生长的藻场资源, 已远不能满足人们的需求。因而人们期望能够通过人工繁育苗种的方式来实现海藻场原位修复的目的, 进而满足工业等各行业的需求, 创造更多的经济效益。

孙建璋等^[3]认为“铜藻以有性生殖为主, 残枝营养繁殖为辅, 共同维系种群繁衍”。因此, 观察铜藻卵子、受精卵的发育及幼殖体的早期生长, 有利于深入认识铜藻的有性生殖过程。从而便于利用有性生殖获得苗种进行室内育苗, 增加铜藻资源量。

本研究观察了铜藻精子卵子、受精卵的发生和幼苗的早期发育, 旨在为进一步优化铜藻的人工育苗技术提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料来源

铜藻材料取自浙江省舟山市南麂列岛潮间带自然生长种群。

1.2 铜藻生殖器官观察

从生殖枝上剪下雌雄生殖托, 用灭菌海水反复冲洗生殖托, 然后进行整体拍照及切片显微镜观察。

1.3 铜藻的卵和受精卵的收集和观察

将采回的铜藻种菜置于循环水缸中充气培养, 剪下带有生殖托的生殖枝, 用灭菌海水反复冲洗, 去除附生杂藻。雌株和雄株以1:1的比例混合培养, 培养条件为温度20~21℃、光照60~80μmol/(m²·s)、光暗周期D:L=12:12。将培养皿放于培养缸底部, 用来收集受精卵。

1.4 铜藻幼孢子体生长观察

幼孢子体形成后有些会很快脱离生殖托并沉降在培养皿底部, 收集幼孢子体并制成孢子液, 均匀喷洒在苗帘和藻礁上, 观察幼孢子体的发育状况。有些则继续在生殖托上发育。

2 结果与分析 2.1 生殖托结构

在铜藻繁殖季节的生殖托生长十分茂密, 整个生殖枝几乎都长满生殖托, 而叶和气囊相对稀疏, 此时生殖托贡献了生殖枝的大部分体积和重量。铜藻的雌性生殖托粗短, 长约40 mm, 雄性生殖托细长, 长约25 mm (图 1a)。年幼的生殖托色泽暗淡, 透光性差且表面光滑, 而成熟的生殖托色泽变浅, 呈黄褐色。成熟的铜藻生殖托肉眼可见表面有明显凸起即生殖窝(图 1b), 显微镜下观察雌性生殖窝内的卵清晰可见, 且整齐规律的环绕在生殖窝孔周围, 等待排放(图 1c, 图 1d)。随着卵不断发育成熟, 生殖窝孔逐渐变大, 直至卵放散完全后开始流失(图 1e, 图 1f)。

2.2 卵子和精子的排放

从浙江采回的铜藻, 由于中途运输时避光且干燥, 相当于进行了阴干处理, 所以带回实验室后卵很快就排放, 暂养的第2天便可观察到雌性生殖托明显变粗, 表面挂满卵(图 2a), 用手触碰会有粘黏感, 刚排出的卵也正是靠这种黏液挂在托上等待受精(图 2b)。

整体观察雄性生殖托的外观, 同样可以发现有精子囊母细胞围绕在生殖孔周围, 但相对于卵囊母细胞, 并不清晰整齐, 略显模糊(图 3a)。切片观察发现, 精子囊母细胞并非圆形或者椭圆形, 而是靠近孔的一端较圆, 背离孔的一端则较尖(图 3b)。每一个生殖窝内有大量的这种细胞, 呈放射状自窝孔壁向窝孔中心排列。生殖托成熟后, 每个生殖孔会一簇一簇释放精子(图 4a), 图 4b为刚释放的精子, 具有明显的鞭毛结构, 随后便脱离生殖托, 靠鞭毛游动, 与卵子结合完成受精过程。

孙休涛等^[4]研究表明鼠尾藻的精子囊母细胞更为明显的特点是端部细胞更圆, 并具有明显的鞭毛类结构。据逄少军等^[5]做的活体切片表明, 羊栖菜雄性生殖窝内有大量的发育成熟的精子囊母细胞, 呈梨形。作者猜想铜藻的精子囊母细胞之所以一端较尖可能归因于它的鞭毛类结构。

2.3 卵子分裂

铜藻卵子从生殖孔排出后会进行卵子分裂, 这个过程是在挂托期间完成的, 研究表明鼠尾藻和羊栖菜的卵子也有明显的“挂托分裂现象”。刚排出的卵细胞内的凝聚核物质并不是很多, 之后在挂托等待受精过程中会在很短的时间内由1核卵先后分裂为2核卵、4核卵、6核卵, 最终分裂为8核卵(图 5), 具有不同核数目的卵细胞同时可见, 由此得出铜藻卵的发育遵循马尾藻科“8核1卵”的模式。当卵细胞成熟后, 1个核在周边位置与精子结合, 其他7个核陆续消失, 然后受精卵移到中央位进行细胞分裂。

2.4 受精卵的分裂和假根的形成

当受精卵完成8核融合后, 很快进行第一次分裂, 形成的细胞壁与长轴垂直, 形成上下两个细胞的幼孢子体。第二次细胞分裂发生于幼孢子体一极的近顶端处, 分裂方向与第一次平行, 此时假根原细胞形成。以后每隔3~4h完成一次分裂过程, 经过数次的横裂和纵裂后, 最终形成多细胞的梨形幼孢子体, 在其表面可以看到非常整齐密集的分裂线(图 6a)。

在受精卵细胞一极形成的假根原细胞也要经过数次分裂, 最终形成一块深色区域(图 6b)。10多个小时后此区域已经明显突起, 呈现出假根雏形。假根生长较快, 受精卵形成24 h后假根已经很长(图 6c, 图 6d)。假根的形成标志着幼孢子体具备了附着能力, 随后其中一些会脱离生殖托, 附着于基质上。另一些则继续在生殖托上发育(图 6e, 图 6f)。

2.5 幼孢子体的生长观察

观察布帘上幼孢子体的发育状况发现, 喷洒幼孢子液2 d后, 幼孢子体已经牢牢附着在基质上, 用水流冲洗孢子体不易脱落。15 d后观察发现第1个叶片形成, 幼苗的平均长度约为1~2 mm(图 7a)。附苗20 d时, 第1个叶片由圆柱状变为扁平状, 同时在靠近根部的位置形成一个突起, 为第2个叶片的雏形(图 7b)。经过25 d的生长, 伴随着幼苗的长大, 在第1个叶片和第2个叶片的叶腋处再形成一个分枝突起, 随后分枝突起逐渐增多(图 7c)。60 d后幼苗的平均长度达到18 mm(图 7d), 期间每个叶片均由圆柱状发展为扁平状, 最后叶片边缘呈现波浪状。

3 讨论 3.1 生殖托的形态及精卵排放

铜藻藻体为雌雄异株, 成熟藻体从外观上很容易区分, 雌性生殖托略粗短, 雄性生殖托较细长, 关于马尾藻属中一些藻类的生殖托形态目前已有很多相关报道, 王飞久等^[6]研究得出通常鼠尾藻雌托粗短, 雄托细长, 但也有界乎二者之间的, 在未完全成熟时不易区分出雌、雄藻体。尽管一般雌生殖托粗短, 雄生殖托细长, 但同性之间差异也很大。2010年, 孙休涛等^[7]通过观察鼠尾藻生殖托的形态再次印证了鼠尾藻雌雄生殖托的这一特征。张立宁等^[8]研究得出成熟的羊栖菜藻体的雌托略粗短, 通常小于约40 mm, 雄托稍细长, 通常大于60 mm。

雌性生殖托上有生殖窝, 即将成熟的卵囊母细胞整齐规律地排列在生殖孔周围, 据Nanba^[9]研究表明铜藻雌性生殖托在放卵前, 生殖窝孔由黏液组成的凝胶状塞子堵着, 成熟后此塞子首先被排出, 然后从生殖窝流出黏液后, 再排放卵子, 卵子黏挂在生殖托表面, 等待受精。

铜藻雄性与雌性生殖托上生殖窝孔的布局一样, 也可以观察到精囊母细胞规则围绕在生殖孔周围, 通过横切雄性生殖托发现精子囊母细胞为梨形, 呈放射状排列。孙休涛等^[7]通过观察鼠尾藻生殖托的形态结构发现:鼠尾藻雄性囊母细胞较雌性囊母细胞更为明显的特点是端部细胞更圆, 并具有明显的鞭毛类结构。同时也与羊栖菜的精子囊母细胞相似, 并且得到了证明, 据逄少军等^[5]研究发现, 羊栖菜雄生殖窝内有大量的发育成熟的精子囊母细胞, 呈梨形。每一个生殖窝内有大量的这种梨型细胞, 呈放射状自窝孔壁向窝孔中心排列, 梨型细胞没有明显的色素体, 细胞质浓厚。

观察雌性生殖托的排卵情况发现:同一个生殖托的不同部位并不是同时排卵, 而是由基部向顶端逐渐成熟。本实验材料采回后由于运输过程阴暗干燥, 相当于进行了阴干处理, 因此置于培养缸中培养的第二天便会排卵。排卵部位集中在生殖托的基部和中部, 而距生殖托顶端1/3长度的部位的卵子没有排放。继续观察完成首次的排卵的生殖托, 5 d后发现进行了第二次排卵, 此次排放的卵主要悬挂在生殖托的顶端, 排卵量较少, 只有总量的约30%左右。这种不同步排卵情况与鼠尾藻和羊栖菜的排卵情况非常相似, 据Pang等^[10]报道离体培养的羊栖菜卵子的排放顺序依次为基部、中部、顶部, 存在分段成熟、排放的情况。同样张鑫等^[11]也发现羊栖菜生殖托是由基部向顶部逐渐成熟。孙休涛等^[7]研究发现鼠尾藻在繁殖后期成熟的雌性生殖托发育不足, 因此存在排卵不同步现象。

铜藻精子的放散数量很大, 图 4a呈现了精子的放散情况, 由图可见铜藻的雄性生殖托在排出精子的同时也会分泌黏液, 从而包裹住精子。从一个生殖窝排出的精子呈簇状堆积在生殖窝孔周围的生殖托表面上。有研究发现羊栖菜雄性生殖窝内也会分泌富含精子的黏液^{[5, 12]}。尽管如此, 精子也并不像卵子一样可以靠分泌出的黏液挂在生殖托上, 很容易被水流或者晃动分散开, 而使它们排放入水体中很快与卵子结合受精。精子独特的鞭毛结构也促进了受精过程, 但不同藻类精子的鞭毛结构并不完全相同, 有报道称墨角藻目精子的鞭毛不同于其他褐藻类, 为前短后长的双鞭毛结构^[5], 同时日本学者^[9]也发现铜藻雄性生殖托也会释放一些双鞭毛游动精子, 而本研究中从图 4b只可看见1条鞭毛, 另外一条尚未拍到。因为精子一般在黑夜中放散, 另外它的易分散性、游动功能和细胞没有明显的色素体等因素导致人们很难捕捉和观察它。

3.2 卵和受精卵的分裂发育

卵从生殖窝孔排出后, 黏挂在生殖托表面, 在此期间卵子完成分裂, 此过程被称为“挂托分裂”。日本学者^[13]曾经对墨角藻科多种海藻的卵细胞发育方式进行了研究和归纳, 发现它们的卵囊母细胞经减数分裂可发育成为8卵型、4卵型、纵裂2卵型、横裂2卵型、1核1卵型和8核1卵型这6种不同的发育方式^[14]。国内外相关研究^[15-18]也发现鼠尾藻和羊栖菜属于8核1卵型, Uchida T ^[19]也提到铜藻卵子的多核特征。本文研究观察发现铜藻的卵经历了1核卵、2核卵、4核卵、6核卵、8核卵的分裂过程, 因此判断铜藻的卵子发育属于8核1卵型, 与上述研究结果相同。

受精后的卵经过无数次分裂, 发育成幼苗并形成假根。猪野俊平^[13]把假根细胞的分裂分为1细胞型、2细胞型、4细胞型、放射细胞8型、不规则8细胞型、16细胞型和32细胞型这7种形式^[11]。有研究表明羊栖菜假根的发生属于不规则8细胞型^[20], 而铜藻假根的发生类型还有待进一步研究。