2018, Vol. 42
文章信息
- 聂绮倩, 莫日坚, 徐德峰, 孙力军, 王雅玲, 叶日英. 2018.
- NIE Qi-qian, MO Ri-jian, XU De-feng, SUN Li-jun, WANG Ya-ling, YE Ri-ying. 2018.
- 海洋芽孢杆菌Bacillus sp. CAMT22370所产葡萄糖氧化酶的分离纯化与表征
- Purification and characterization of the glucose oxidase from a marine strain Bacillus sp. CAMT22370
- 海洋科学, 42(5): 68-76
- Marina Sciences, 42(5): 68-76.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20171017001
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文章历史
- 收稿日期：2017-10-17
- 修回日期：2017-11-20
近年来随着海洋生物技术的兴起和对海洋生物资源开发意识的增强, 国内外对海洋微生物及其酶的研究进展迅速, 开发具有全新性质的酶已成为国际酶制剂研究的热点[1-3]。葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)能高度专一性地催化β-D-葡萄糖与空气中的氧反应, 使葡萄糖氧化成为葡萄糖酸和过氧化氢, 一方面可降低食品基质中的氧分压, 并减缓因葡萄糖存在而造成的褐变[4]; 另一方面过氧化氢在过氧化氢酶的作用下产生新生态氧, 从而起到抑菌或杀菌功效[5]。基于葡萄糖氧化酶良好的生物脱氧、脱糖及抑菌效果, 以及良好的安全性[6], 目前已在面粉改良[7, 8]、乳品脱氧[9]、蛋品脱糖[10]及果汁果酒保鲜[11]等领域得到广泛应用。
目前葡萄糖氧化酶的工业化生产主要采用黑曲霉或青霉发酵[12-15], 但在发酵过程中较低的表达量及较多杂蛋白的存在给分离纯化带来很大困难, 导致产品成本增高[16-17], 且已报道的葡萄糖氧化酶最适温度多在30~40℃的温度范围[18], 而在0~10℃的食品冷链温度下活力相对较低, 在冷藏对虾的黑变防控中效果不佳。基于葡萄糖氧化酶在生物体内分布的广泛性和海洋微生物酶的低温催化特性, 从代表性海洋生物资源中筛选高活力低温葡萄糖氧化酶的目标微生物是发挥葡萄糖氧化酶优良应用潜力的前提[19], 而酶的分离纯化是研究酶结构、功能和工业化应用的基础[20]。本课题组前期从南海近海泥土中分离到一株高产葡萄糖氧化酶的海洋芽孢杆菌Bacillus sp. CAMT22370, 本研究进一步对所产葡萄糖氧化酶进行纯化与表征, 以期为该酶的开发利用奠定初步基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂DEAE-纤维素、Sephadex G-75 (美国Pharmacia公司); 中分子质量蛋白质Marker(日本Takara公司); 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、考马斯亮蓝R-250、TEMED (英国Fluka公司); SDS (美国Amersco公司)。实验所用其它试剂均为国产分析纯。
1.2 主要仪器UV2102紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司); pB-10精密酸度计(德国Sartorius公司); THZ-82型水浴恒温振荡器(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司); 中低压蛋白纯化系统、微型垂直板蛋白质电泳仪(美国Bio-Rad公司); Eppendorf 5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司); Tecan infinite 200多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)。
1.3 Bacillus sp CAMT22370活化、发酵与葡萄糖氧化酶活力测定Bacillus sp CAMT22370分离自环北部湾海泥, 保藏于本实验室, 使用时以NaCl含量3%的营养琼脂30℃培养48 h进行菌株活化, 种子培养液为NaCl含量3%的常规LB液体培养基, 35℃下150 r/min培养48 h作为种子发酵液, 发酵培养基组成为氯化钠35g、鱼粉蛋白胨10 g、麦芽糖10 g、CaCl2 0.5 g, 蒸馏水1 000 mL, 200 mL培养基装于500 mL三角瓶, 121℃灭菌20 min成发酵培养基, 将种子液以6%的体积比接种到发酵培养基, 28℃下200 r/min培养72 h, 发酵结束后8 000 r/min离心5 min收集上清得粗酶液, 粗酶液中葡萄糖氧化酶活力测定参照朱运平等人实验方法进行[16]。
1.4 分离纯化 1.4.1 硫酸铵分级盐析参照刘芳等[17]的实验方法, 取一定体积的粗酶液, 在冰浴上分次缓慢加入充分研细的固体硫酸铵。第一次加硫酸铵至30%饱和度, 冰浴静置4 h, 然后于4℃下, 12 000 r/min离心20 min得到第一个沉淀组分, 记下所加硫酸铵的量作为盐析曲线的起点。继续加硫酸铵于上清至50%饱和度, 同样条件下离心得到第二个组分, 继续收集50%~70%和70%~90%饱和度沉淀组分, 将每一级沉淀物分别溶解在一定体积的50 mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.0)中, 透析脱盐后测定其蛋白质含量和酶活力, 以每段组分的蛋白质含量和葡萄糖氧化酶活力对硫酸铵饱和度作图得盐析曲线。
1.4.2 DEAE-纤维素离子交换层析参照顾磊[18]实验方法, 20 mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液平衡DEAE-纤维素离子交换柱(2.5×50 cm, 50 mL), 取5 mL盐析脱盐后的酶液(总蛋白量约15 mg)加样于离子交换柱, PBS缓冲液充分洗柱(约200 mL), 以1.0 mol/L NaCl溶液为A液, 20 mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲液为B液, A与B液采用梯度混合器进行混合, 形成NaCl连续线性浓度梯度进行洗脱, 流速定为4 mL/min, A280检测蛋白洗脱峰, 收集蛋白峰并超滤浓缩(截留分子质量10 000Da), 调整至同一蛋白浓度后测定每峰的葡萄糖氧化酶活力, 收集最大活性峰处蛋白作为进一步纯化的样品。
1.4.3 Sephadex G-75凝胶过滤层析参照徐德峰实验方法[19], 用20 mmol/L、pH 6.0的PBS缓冲液平衡Sephadex G-75凝胶柱, 取上一步收集的高酶活蛋白峰浓缩液5 mL(约5 mg蛋白)作为分子筛层析的样品, PBS缓冲液洗脱, 流速定为1 mL/min, 收集蛋白峰并超滤浓缩, 调整至同一蛋白浓度后测定其葡萄糖氧化酶活力, 电泳检测高酶活蛋白峰纯度。
1.4.4 蛋白酶纯度鉴定与分子质量测定采用12%分离胶、5%浓缩胶的SDS-PAGE电泳检测纯化后的蛋白酶纯度, 结合标准蛋白分子质量初步确定目标葡萄糖氧化酶的分子质量, SDS-PAGE操作程序参照文献[14]相应部分。样品与上样缓冲液混和后直接上样(每孔20 μL), 采用Bio-Rad微型恒压电泳仪冰浴上电泳至溴酚蓝距前端约0.5 cm处结束电泳, 电压条件定为浓缩胶80V, 分离胶100V。电泳结束后以去离子水浸洗胶2次, 每次20 s, 采用考马斯亮蓝染色对胶片进行染色观察, 分子质量测定根据分子质量标准蛋白Rf值与LogMr之间的对应方程求出。
1.5 Bacillus sp. CAMT22370源葡萄糖氧化酶的表征 1.5.1 最适温度及热稳定性参照Ozyilmaz等实验方法[20], 分别于15、20、25、30、35、40、45 ℃下测定葡萄糖氧化酶的活力, 考察温度对葡萄糖氧化酶活力的影响, 根据实验结果绘制温度-活力曲线, 同时将酶液分别于上述温度下保温2 h, 测定保温前后葡萄糖氧化酶活力的变化, 以最大活力处为对照, 由此计算其余温度点处的相对酶活力, 以相对活力对温度作图, 绘制葡萄糖氧化酶的热稳定性曲线。
1.5.2 最适pH与pH稳定性参照文献[22-23], 分别配制pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲溶液, 然后将50 μL酶液与200 μL缓冲溶液混合, 30℃保温30 min后测定葡萄糖氧化酶的活力, 考察pH对葡萄糖氧化酶活力的影响, 绘制pH-酶活曲线, 确定葡萄糖氧化酶的最适pH, 同时于室温(25℃)下放置2 h, 然后调整至最适pH, 测定葡萄糖氧化酶活力, 以酶活对pH作图, 绘制葡萄糖氧化酶的pH稳定性曲线。
1.5.3 金属离子对葡萄糖氧化酶活性的影响在葡萄糖氧化酶的最适pH条件下, 参照石淑钰等[23]实验方法, 将酶液与不同金属离子混和, 金属离子终浓度为10 mmol/L, 于室温放置2 h后测定酶活, 以未加入金属离子的样品为对照, 考查各种金属离子对葡萄糖氧化酶活性的影响。
1.5.4 葡萄糖氧化酶动力学参数测定参照徐德峰[19]实验方法, 在50 mmol/L、pH 7.0的PBS缓冲溶液中分别配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液(0~2%), 考察底物浓度与反应速度的关系。根据实验数据采用Lineweaver-Burk双倒数作图法确定米氏方程中的Km和Vmax。
1.6 统计分析每个数据均为3次测定平均值, 采用均值±标准差表示, 统计学检验采用SPSS 13.0中相应程序。
2 结果与分析 2.1 Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶的分离纯化 2.1.1 葡萄糖氧化酶分段盐析由于蛋白质构件分子氨基酸所带电荷的不同造成了不同蛋白质其溶解度与等电点不同, 沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同, 因此改变盐浓度与溶液pH值, 可将混合液中的蛋白质分批盐析。粗酶液中混杂有数量众多的杂蛋白, 葡萄糖氧化酶的含量相对偏低, 为浓缩粗酶液并初步纯化葡萄糖氧化酶, 在柱层析之前, 用固体硫酸铵对粗酶液进行了分段盐析, 结果见图 1。
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| 图 1 Bacillus sp. CAMT22370源葡萄糖氧化酶盐析曲线 Fig. 1 Curve of ammonium sulfate precipitation of glucose oxidase from Bacillus sp. CAMT22370 |
由图 1可以看出, 粗酶液中蛋白质的沉淀伴随着整个盐析过程, 在70%饱和度前几乎呈线性变化趋势, 估计与粗酶液中复杂的蛋白质组成有密切关系。当酶液中硫酸铵饱和度小于30%时, 沉淀中葡萄糖氧化酶活力较低, 当饱和度继续增加时, 沉淀中葡萄糖氧化酶活力随硫酸铵饱和度的增加而增加, 达到70%时, 葡萄糖氧化酶活力开始下降。据此, 收集硫酸铵饱和度30%~70%的组分, 离心收集沉淀即得粗酶。基于盐析原理分析, 蛋白质分子表面的水化膜厚度及所带电荷的性质和电量是决定盐析分级沉淀效果的内在因素, 本实验中高酶活部分集中在硫酸铵饱和度30%~70%之间, 表明发酵液中葡萄糖氧化酶蛋白分子水化膜厚度及所带电荷处于中等水平。与王志新等[24]先采用90%饱和度硫酸铵全部沉淀黑曲霉A9发酵液中蛋白后, 再分离纯化其中葡萄糖氧化酶相比, 本实验针对性更强。
2.1.2 葡萄糖氧化酶DEAE-纤维素离子交换层析取盐析后收集到的蛋白粗酶溶于少量50 mmol/L、pH 7.0的PBS洗脱液中, 在相同的缓冲液中进行透析除盐, BaCl2检测透析至溶液无SO42–, 0.45 μm超滤膜过滤后进行DEAE-纤维素柱层析, 结果见图 2。
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| 图 2 Bacillus sp. CAMT22370发酵液(a) DEAE-纤维素与(b) Sephadex G-75蛋白层析曲线 Fig. 2 Purification of glucose oxidase from Bacillus sp. CAMT22370 by (a) DEAE-cellulose chromato graphy and (b) molecular sieve chromatography |
由图 2可以看出, 经过DEAE-纤维素离子交换层析共分出4个蛋白组分, 酶活跟踪发现P1组分基本没有活性, 且在洗脱初期被洗脱下来, P3和P4组分活性也较低, 葡萄糖氧化酶活力主要集中在P2处。将DEAE-纤维素柱层析收集到的P2蛋白组分浓缩液取出2 mL, 进行Sephadex G-75凝胶过滤层析, 以50 mmol/L、pH 7.0 PBS缓冲液1.0 mL/min恒速洗脱, 记录A280 nm值并检测葡萄糖氧化酶活力, 结果见图 2b。由图 2b可以看出, 经DEAE-纤维素离子交换纯化后的P2蛋白在Sephadex G-75凝胶过滤又分出Pa和Pb两个组分, 酶活检测发现其酶活主要集中在Pb处。通过多步纯化操作, 使Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶纯化了2.12倍, 酶活得率32.37%, 比活力达到8.47 U/mg, 纯化流程及结果见表 1。
| 纯化步骤 | 总蛋白/mg | 总活力/U | 比活力/(U/mg) | 蛋白回收率/% | 纯化倍数 |
| 粗酶液 | 72.3 | 289.5 | 4.00 | 100.00 | 1.00 |
| 硫酸铵沉淀 | 52.7 | 254.8 | 4.83 | 72.89 | 1.21 |
| DEAE-纤维素 | 35.7 | 219.7 | 6.15 | 49.38 | 1.54 |
| Sephadex G-75 | 23.4 | 198.2 | 8.47 | 32.37 | 2.12 |
将发酵液硫酸铵盐析浓缩酶液、DEAE-纤维素离子交换浓缩液和Sephadex G-75凝胶柱层析Pb组分进行SDS-PAGE电泳, 结果见图 4。
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| 图 3 Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶纯化流程电泳图谱 Fig. 3 Purification profiles of glucose oxidase from Bacillus sp. CAMT22370 M.蛋白质分子质量; 1.硫酸铵盐析浓缩液; 2. DEAE-纤维素层析浓缩液; 3. Sephadex G-75层析浓缩液 M. molecular weight of marker proteins; 1. concentration solution purified by salting-out of ammonium sulfate; 2. concentration solution purified by DEAE-cellulose chromatography; concentration solution purified by Sephadex G-75 chromatography |
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| 图 4 Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶最适反应温度及温度稳定性 Fig. 4 The optimal temperature and its stability at different temperature of glucose oxidases from Bacillus sp. CAMT22370 |
由图 3可以看出, 粗酶液经硫酸铵盐析沉淀后仍有较多杂蛋白, 经DEAE-纤维素离子交换后杂蛋白进一步减少, 进一步经Sephadex G-75凝胶柱层析后, 将Pb组分电泳检测, 发现只有一条主带, 将分子质量M及迁移率Rf值进行拟合, 得分子质量M与Rf间相关公式为LogMr= –2.27Rf+5.14(R2=0.9938), 根据迁移率计算纯化后的葡萄糖氧化酶分子质量为68.72 kDa, 与苏茉等[25]分离自黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶分子质量94.1 kDa不同, 但与安玉麟等[26]将黑曲霉葡萄糖氧化酶基因66.5 kDa的原核表达融合产物不同, 原因可能在于菌株来源不同, 其酶蛋白的合成和翻译后修饰存在不同。
2.2 Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶的表征 2.2.1 葡萄糖氧化酶最适温度及热稳定性在20 mmol/L、pH 7.0 PBS缓冲液中, 分别于15、20、25、30、35、40、45℃下测定葡萄糖氧化酶活力, 考察温度对葡萄糖氧化酶活力的影响, 绘制温度-酶活力曲线, 同时在各自温度下放置2h后再次于最适温度处测定酶活, 以保温前初始值为对照, 绘制温度-相对活力曲线, 结果见图 4。
由图 4可以看出, Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶对温度的选择性与其他酶类具有一致性, 当温度较低时活力也较低, 当温度超出一定值时活力开始下降, 这反映了酶作为生物催化剂的结构本质。Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶最适作用温度为30℃, 之后酶活迅速下降。温度稳定性研究表明, 在30℃以前, 酶相对活性可维持在95%以上, 但当高于30℃时酶活开始迅速下降, 45℃保温2 h活力降至75%左右, 综合研究表明, 本菌株所产葡萄糖氧化酶热稳定性较差, 而低温下可显示良好的酶学活性。石淑钰等[23]自黄海海泥样品中分离出的一株假单胞杆菌Pseudomonas migulae GOD2, 热力学性质表明, 此菌株所产葡萄糖氧化酶在低温条件下具有较佳的催化活性, 20℃时催化活力最高, 10℃时仍具有较高的酶活, 但热稳定性较差, 随着温度升高酶活迅速降低, 60℃处理1 h酶活基本丧失。本研究结果与石淑钰等的研究相似, 所分离的海洋细菌葡萄糖氧化酶均有较佳的低温催化活力, 提示海洋微生物产葡萄糖氧化酶的酶学性质与陆生菌株有显著的内在差别, Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶更适合在低温下使用, 提示在食品冷链保鲜中有应用潜力。而且, 本课题组进一步考察了Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶对南美白对虾冷链保鲜过程中品质的影响, 结果表明Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶不仅能有效防止对虾褐变, 而且对其色泽、气味、硬度、弹性、咀嚼性和黏附性等品质指标都有良好的保持作用[27]。因此, 以上结果综合表明Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶在食品冷链保鲜中具有潜在应用价值。
2.2.2 葡萄糖氧化酶最适pH及pH稳定性分别于3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、7.8缓冲溶液中测定葡萄糖氧化酶的活力, 考察pH对葡萄糖氧化酶活性及稳定性的影响, 结果见图 5。
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| 图 5 Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶最适pH及稳定性 Fig. 5 The optimum pH and its stability at different pH of glucose oxidases from Bacillus sp. CAMT22370 |
由图 5可以看出, 酶对pH变化较敏感, 其最适pH为6.0, 在5.0以下和7.0以上时酶活迅速降低, 且稳定性也呈类似趋势, 在pH 4.5以下或7.5以上时酶活稳定性迅速下降, 当pH达到9.0时基本损失35%。在最适pH及稳定性方面与毛秋霞等[28]报道的Penicillium notatum青霉所产葡萄糖氧化酶最适pH 6.5相近, 但与石淑钰等[23]分离出的Pseudomonas migulae GOD2葡萄糖氧化酶(最适pH7.0)不同, 总体来讲本课题组所分离的葡萄糖氧化酶较以往报道的葡萄糖氧化酶对pH更为敏感些, 可能是酶蛋白活性中心的催化结构对介质微环境中的电荷量要求较为苛刻, 当偏离pH 5.0~7.0时酶蛋白构象改变, 进而引起催化活力下降, 具体原因有待进一步研究。
2.2.3 金属离子对Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶活性的影响分别配制10 mmol/L的NaCl、KCl、MnCl2、ZnCl2、FeCl3、FeSO4、MgCl2溶液, 将酶液与不同金属离子溶液等体积混和, 室温放置2 h后测定酶活, 以未加入金属离子的样品为对照, 考查各种金属离子对葡萄糖氧化酶活力的影响, 结果见图 6。
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| 图 6 不同金属离子对Bacillus sp. CAMT22370产葡萄糖氧化酶活性的影响 Fig. 6 Influence of metal ions on glucose oxidase activity from Bacillus sp. CAMT22370 |
由图 6可以看出, 在终浓度为10 mmol/L时, 金属离子种类对葡萄糖氧化酶活力有一定影响。Ca2+和Mn2+有明显的激活作用, Na+和Zn2+有轻微的激活作用, 对酶活有不同程度的抑制作用, K+和Mg2+对酶活基本无影响, 而Fe2+、Fe3+和Cu2+对酶活有明显的抑制作用。就激活方面看, 其中以Ca2+激活效果最为明显, 与自身对照可使葡萄糖氧化酶活性提高30%~40%, 但张茜等[29]研究表明Ca2+和Mn2+对Penicillium amagasakiense青霉葡萄糖氧化酶活力基本无影响, 而与胡常英等报道的点青霉HW2203葡萄糖氧化酶应用特性较为类似[30], 原因可能在于物种差异。
2.2.4 Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶动力学参数测定在50 mmol/L、pH6.0的PBS缓冲溶液中配制0~2%的葡萄糖溶液, 考察底物浓度与反应速度之间的关系。根据实验数据, 对变量进行线性拟合, 可得到米氏方程的线性拟合式, 根据方程可以计算出葡萄糖氧化酶的最大反应速度Vmax和米氏常数Km, 结果见图 7。
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| 图 7 Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶双倒数曲线 Fig. 7 Lineweaver-Burk plot of glucose oxidases from Bacillus sp. CAMT22370 |
由图 7根据拟合曲线得葡萄糖氧化酶对葡萄糖的Vmax为26.85 µmol/(L·min), 较黑曲霉H1-9b所产葡萄糖氧化酶21.88 µmol/(L·min)的最大反应速度略低些[25], 而低于青霉Penicillium sp. CBS 120262葡萄糖氧化酶35.71 µmol/(L·min)[31]。就Km值而言, Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶为109.26 mmol/L, 明显大于青霉Penicillium sp. CBS 120262葡萄糖氧化酶的18.4 mmol/L和黑曲霉H1-9b的30.69 mmol/L。基于Vmax和Km定义可知, 该株海洋细菌Bacillus sp. CAMT22370所产葡萄糖氧化酶对葡萄糖的亲和力较黑曲霉和青霉源葡萄糖氧化酶略低, 提示可进一步通过菌种改良提升酶的亲和力。
3 结论通过多步纯化使Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶纯化了2.12倍, 酶活得率32.37%, 比活力达到8.47 U/mg, 分子质量为50 kDa。酶学特性研究表明此酶最适温度为30℃, 超过30℃酶活迅速下降, 45℃保温2 h活力降至75%左右; 该酶对pH变化较敏感, 其最适pH为6.0, 在5以下和7以上时酶活迅速降低, 9.0时基本损失35%;无机盐中Ca2+和Mn2+有明显的激活作用, Na+和Zn2+有轻微的激活作用, K+和Mg2+对酶活基本无影响, 而Fe2+、Fe3+和Cu2+对酶活有明显的抑制作用; 同时通过动力学分析得出酶蛋白动力学常数Vmax为26.85 mmol/(L·min)而Km值为109.26 mmol/L。基于所得菌株葡萄糖氧化酶良好的低温催化活性, 有望在冷链食品的保鲜中进行开发利用, 同时鉴于该酶的温度和pH敏感性, 在酶制剂的制备过程中需进一步研究活性保持技术。
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