黑鲷(Acantho pagrusschlegelii), 俗称海鲋、青鳞加吉、黑加吉等, 属脊索动物门(Chordata)、辐鳍鱼纲(Actinopterygii)、鲈形目(Perciformes)、鲷科(Sparidae)、棘鲷属(Acanthopagrus)。体形为长椭圆形、侧扁, 体态优雅、色泽素丽、肉质鲜美, 是一种名贵的海产鱼类^[1]。黑鲷鱼的抗逆性强, 对温度、盐度适应范围广, 但养殖周期长、抗病力差。近年来由于没有对种鱼进行选育和改良, 种质资源已经开始出现衰退, 病害日趋严重、品质下降, 经济效益明显下滑, 影响了黑鲷养殖业的稳定与持续发展。真鲷(Pagrosomus major), 俗称加吉鱼、红加吉、铜盆鱼等, 属脊索动物门、辐鳍鱼纲、鲈形目、鲷科、真鲷属(Pagrosomus)。真鲷为近海暖温性底层肉食性鱼类, 具有生长快、便于暂养、经济价值高等特点, 是另一种名贵的海水养殖鱼种。近年来, 真鲷的人工养殖试验已取得了一定的成果, 在中国南方沿海地区已经发展成为一种主要的海水养殖鱼种。但真鲷抗逆性差、不耐低温^[2-3]。

因此, 作者期望通过杂交育种的方式, 将真鲷与黑鲷进行杂交, 使得杂交鲷产生杂种优势, 克服亲本不耐低温、生长偏慢的缺点。鲷科鱼类的远缘杂交育种研究相比较其他海水鱼类开展的要早。早在1964年, 原田辉雄等^[4]初次尝试了真鲷与黑鲷的正反试验, 甚至还进行了石鲷(石鲷科)与黑鲷之间的科间远缘杂交, 亦成功培育出杂交鱼苗, 但孵化和成活率极低, 没有生产养殖价值。随后国内研究者也进行了多种鲷科鱼类远缘杂交研究, 为鲷科鱼类杂交育种积累了丰富的经验^[5]。颜付云等^[6]对杂交鲷(真鲷♀×黑鲷♂)和黑鲷幼鱼的代谢率及排泄率进行比较, 发现杂交鲷幼鱼具有代谢率显著低于亲本的优点, 也继承了父本耐低温的优点, 但却失去了双亲耐高温、耐低氧的特点, 并出现了应激反应大等不良性状。蒋宏雷等^[7-8]对杂交鲷(真鲷♀×黑鲷♂与黑鲷♀×真鲷♂)的胚胎发育进行了研究, 寻找杂交鲷胚胎发育适宜温度以及胚胎畸形等问题, 认为无论正交反交, 真鲷与黑鲷仍存在生殖隔离, 杂交繁育难度较大, 要达到规模生产, 需要继续研究实验。

温度、光照条件是影响海水鱼类生长、生存的重要环境因素, 同时也对种苗培育有着重要的影响, 不同的鱼类对环境因素的适应范围有较大差异, 国内外对此也有许多报道。李涛等^[9-10]研究了温度骤变对黑鲷仔鱼存活率的影响, 结果表明, 当水温由18℃降至14、12℃时, 黑鲷仔鱼在24 h的存活率接近50%;当水温由18℃骤升至22℃以上时, 仔鱼存活率急剧下降; 当水温由18℃骤升至26℃时, 仔鱼在24 h内全部死亡, 可见温度骤升较温度骤降对黑鲷仔鱼存活率影响更大。对于杂交鲷, 过去几年的育苗实验, 其受精卵孵化率和仔鱼成活率都很低, 因此探究杂交鲷受精卵孵化及仔鱼发育所需的最适环境因子, 对杂交育苗乃至今后的养殖都有着重要的意义。作者将在之前研究成果的基础上, 对黑鲷(♀)×真鲷(♂)杂交子一代的受精卵孵化影响因素进行探究, 以期寻找温度、盐度对杂交鲷受精卵孵化及仔鱼发育的影响, 为提高杂交鲷育苗的孵化率及成活率提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料

实验用鱼为江苏省海水增养殖技术及种苗中心养殖的真鲷(♂)和黑鲷(♀)。通过注射促排卵素LHR-A2, 将处于繁殖期的两种亲鱼人工诱导其性腺成熟, 注射剂量为每公斤鱼体质量2 μg, 雄鱼剂量减半。采用湿法人工授精, 并收集受精卵。将收集到的受精卵放入盐度略高于自然海水的水中静置, 剔除沉底的死卵, 收集上浮的好卵。

收集到的受精卵一部分作为受精卵孵化实验的材料, 另取一部分状态良好受精卵放置在孵化车间孵化, 待仔鱼完全孵出后, 挑选无畸形的正常仔鱼进行仔鱼存活率的相关试验。仔鱼开口饵料的投喂使用当日购买的新鲜活轮虫, 投喂密度约为10个/L。

1.1.2 实验仪器

透明玻璃广口瓶2.5 L、增氧系统(小型气泵、橡胶软管、气流控制阀、气石)、电子数显温度计(江苏省精创电气有限公司, 测量范围–50~80℃)、SA287笔式数显盐度计(广州市普析通仪器有限公司)、LX-1330A数字式照度表(泰仕电子工业股份有限公司)、WK-2温度调控器(宁波市鄞州先锋电热设备厂, 控温范围0℃至50℃)、CW-1500A智能型冷凝机(广东日生集团有限公司)、控温电加热板、LED灯(100 W)等。

1.2 方法 1.2.1 不同温度下的杂交鲷受精卵孵化实验

条件设计:设置不同的温度梯度(16、18、20、22、24、26℃)。将经过挑选, 透明的、在海水中上浮的黑鲷(♀)×真鲷(♂)杂交受精卵分组放置于广口瓶中孵化, 每组100粒受精卵, 孵化密度为50粒/L。

实验装置:透明玻璃广口瓶容量为2.5 L, 瓶内装自然海水2 L, 孵化所用海水事先经过石棉布过滤并静置沉淀, 盐度为23。静水孵化, 广口瓶内放置气石, 微充气。在广口瓶外套以水槽, 设置温度调控器、冷凝机、电加热板等控温装置(控温误差±0.5℃), 加热水槽中的水, 以水浴的方式实现广口瓶中的水温控制, 由于微充气, 广口瓶内外热交换均匀, 温度一致, 可以满足试验要求。孵化在室内进行, 自然光照下进行, 白天光照强度约为1 000 lx。

数据记录:待仔鱼孵出, 记录每一组的孵化时间、孵化率、畸形率。其中孵化时间是指受精卵中50%孵化出膜时所用的时间, 孵化率是指待受精卵全部孵化所记录的成功出膜仔鱼数量占初始受精卵数量的比例, 畸形率是指有畸形现象的仔鱼数量占成功出膜仔鱼数量的比例。

孵化时间: 50%受精卵孵化出膜时所用的时间

本实验设置3个平行组, 温度梯度中有一组(20℃)为自然温度组, 即为对照组, 不同的平行组同时进行。

1.2.2 不同温度下的杂交鲷仔鱼存活率实验

条件设计:设置不同的温度梯度(16、18、20、22、24、26℃)。取受精卵孵化实验中同一批的受精卵放置在孵化车间中进行孵化, 孵化条件为海水盐度23, 温度20℃, 水面光照强度约1 000 lx, 静水孵化, 微充气。待仔鱼出膜后第2天, 仔细用烧杯从水中舀取无畸形、有活力的仔鱼200尾, 放置于装有2 L海水的广口瓶中, 培育密度为100尾/L。

实验装置:培育环境、控温装置、光照条件等与1.2.1受精卵孵化实验相同。在仔鱼出膜后第3天投喂轮虫(Brachionus plicatilis)作为仔鱼的开口饵料, 投喂密度为10个/mL(添加密度为2×10⁴个/mL的轮虫母液1 mL), 之后每天6:00、12:00、18:00定时检查饵料密度, 及时补充消耗掉的轮虫。

数据记录:等待孵化出的仔鱼发育, 在仔鱼出膜后第7天, 观察并记录每一组剩余的仔鱼数, 计算仔鱼的存活率。存活率以剩余的仔鱼数量占初始仔鱼数量的百分比来表示。本实验设置2个平行组, 不同的平行组同时进行。

1.2.3 不同光照强度下的杂交鲷受精卵孵化实验

条件设计:设置不同的光照强度条件梯度(10、100、300、800、1 500、4 000、10 000 lx)。挑选状态良好的受精卵放置于广口瓶中进行孵化, 每组100粒受精卵, 孵化密度为50粒/L。

实验装置:透明玻璃广口瓶内装自然海水2 L, 海水事先过滤并静置沉淀, 盐度为23。静水孵化, 微充气。孵化场所选择一间无窗的暗室, 完全隔绝自然光照, 室内悬挂1台100 W的LED灯, 通过调节广口瓶与光源的距离来控制孵化水面的光照强度。暗室内温度为20℃, 光照24 h无间歇。

数据记录:数据记录同实验1.2.1, 待仔鱼孵出, 记录每一组的孵化时间、孵化率、畸形率。本实验设置4个平行组, 不同的平行组同时进行。

1.2.4 不同光照强度下的杂交鲷仔鱼存活率实验

条件设计:设置不同的光照强度条件梯度(200、1 000、2 000、5 000、10 000、15 000、20 000 lx)。取受精卵孵化实验中同一批的受精卵放置在孵化车间中进行孵化, 孵化条件为海水盐度23, 温度20℃, 水面光照强度约2 000 lx, 静水孵化, 微充气。待仔鱼出膜后第2天, 仔细用烧杯从水中舀取无畸形、有活力的仔鱼200尾, 放置于装有2 L海水的广口瓶中, 培育密度为100尾/L。

实验装置:培育环境、温度条件、光照控制等与2.2.3受精卵孵化实验相同。在仔鱼出膜后第3天投喂轮虫作为仔鱼的开口饵料, 投喂密度为10个/mL, 之后每天及时补充消耗掉的轮虫。

数据记录:数据记录同实验1.2.2, 统计仔鱼存活率。本实验设置两个平行组, 不同的平行组同时进行。

所有数据用SPSS16.0进行统计分析, 并对结果进行差异显著性检验。

2 结果与分析 2.1 温度对杂交鲷受精卵孵化的影响

观察不同温度下杂交鲷受精卵孵化情况并统计结果(表 1)。结果表明, 温度在16~22℃范围内受精卵都可以孵化, 而温度高于22℃时, 孵化率极低, 不足2%。温度对孵化率的影响显著, 20℃时孵化率达到最高, 为34.00%; 16、18和22℃时孵化率较低, 分别为8.33%、20.00%和18.33%。

与孵化率相似, 孵出仔鱼的畸形率也受到温度因素的显著影响。20℃时畸形仔鱼数最少, 畸形率为16.65%; 16、18和22℃时的畸形率分别为68.81%、38.33%和37.88%;更高温度已不适合受精卵的孵化, 几乎所有的仔鱼都为畸形。

在16~26℃范围内, 受精卵的孵化时间随着温度的升高而缩短, 两者之间呈负相关关系, 符合二次曲线函数(图 1, 实线为点折线, 虚线为拟合的二次曲线)。16℃时孵化时间最长, 为43 h; 在孵化率最高并且畸形率最低的20℃下, 孵化时间为40 h; 而随着温度的继续升高, 在22~26℃时, 孵化时间随温度增加有逐渐缩短的趋势, 孵化时间分别为39、38和38 h。

2.2 温度对杂交鲷仔鱼存活率的影响

在仔鱼出膜后第7天统计存活仔鱼数并计算存活率(图 2)。结果表明, 杂交鲷的存活率随着温度的升高呈下降趋势。其中20~24℃组的差异不显著, 存活率分别为25%、20%和19%; 16和18℃组的存活率分别为60%和49%;而26℃组的存活率最低, 只有7%。

2.3 光照强度对杂交鲷受精卵孵化的影响

观察不同光照强度下杂交鲷受精卵的孵化情况并统计结果(表 2)。结果显示, 在光照强度10~10 000 lx范围内受精卵都可以孵化, 孵化率在65%~72%, 且差异不显著。其中, 300 lx组的孵化率最高, 为71.88%;其余各组的孵化率都相对略低, 低于68.13%。

光照强度对受精卵孵化畸形率的影响则较为显著(图 3)。光照强度为300 lx时, 畸形率最低, 为9.04%;光照强度更低时, 畸形率略有上升, 但不显著; 而当光照强度在300 lx以上, 畸形率随光照强度增加而上升, 差异显著。

各组的孵化时间差异不显著, 光照强度10~ 1 500 lx组的孵化时间为43 h, 略高于4 000、10 000 lx组的42 h。

2.4 光照强度对杂交鲷仔鱼存活率的影响

不同的光照强度下, 杂交鲷仔鱼出膜后7 d的存活率有明显差异(图 4)。光照强度5 000、10 000 lx组的存活率相对较高, 分别为40.75%、38.00%;其余各组随着光照强度的增高或降低, 存活率都有着下降的趋势, 光照强度200、1 000、2 000、15 000、20 000 lx组的存活率分别为20.75%、23.50%、31.25%、28.75%、28.25%。

3 讨论 3.1 温度对杂交鲷受精卵孵化及仔鱼存活的影响

温度对于每一种鱼类的胚胎发育都有着十分重要的影响, 而不同的鱼类发育要求的温度条件不尽相同, 对温度的适应范围也有窄有宽。据文献报导, 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)受精卵孵化的适宜温度为24~30℃, 最适温度为24~26℃^[11]; 条石鲷(Oplegnathus fasciatus)受精卵孵化的适温范围为23~25℃^[12]; 黄鲷(Dentes tumifrons)受精卵孵化的适宜温度为18~22℃^[13]; 金头鲷(Sparus aurata)的孵化适宜温度为19℃^[14]。对于同一物种的不同发育阶段, 其适温范围也有着很大差异, 在胚胎发育时期对于适宜温度的要求往往比其他发育时期更严苛, 适温范围更窄^[15]。大多数鲷科鱼类受精卵孵化的适温范围都在20℃左右, 因此, 在温度实验中, 设计以20℃为中心的梯度, 探究杂交鲷胚胎发育的适宜温度。

蒋宏雷等^[16]对杂交鲷鱼苗培育过程中温度与时间的关系研究中发现:将杂交鲷鱼苗培育至相同规格当培育水温越高, 所需时间越短。从本实验结果上来看, 孵化率、畸形率、孵化时间3项指标受温度的影响都很明显, 这与表明杂交鲷受精卵孵化有着比较高的温度要求。在16~26℃范围内, 杂交鲷受精卵孵化率有一个先增后降的曲线, 而畸形率则与之相对的先降后增, 并且较高的孵化率与较低的畸形率所处温度是重合的, 为20℃, 孵化率为34.00%, 畸形率为16.65%。在蒋宏雷^[7]等对鲷鱼杂交繁育的研究中指出黑鲷、真鲷自交的孵化率为72%、90%, 畸形率为6%、4%。可以看出, 杂交产生的低存活率与致畸现象是客观存在的, 可能是杂交受精卵的质量不及自交受精卵的原因造成的。该研究同时得出真鲷与黑鲷正反交的孵化率分别为85%、90%, 显著高于本实验34%的结果, 可能是由于受精卵质量的不同或杂交方法差异所致, 同时也可能受不同孵化条件的影响。

在16~26℃范围内, 受精卵的孵化时间随温度的升高而降低, 曲线拟合一条二次函数方程。这可能是因为促进孵化的孵化酶效果受温度的影响, 大多数鱼类的胚胎具有起源于外胚层的单细胞孵化腺, 由其分泌孵化酶, 使卵膜变薄^[17]。随着温度的上升, 孵化酶的活力会增强, 孵化时间就会缩短, 若温度超过一定范围, 酶的活力就会被破坏, 导致孵化时间的增加^[18]。

温度对7日龄杂交鲷仔鱼存活率的影响为:随着温度的升高, 仔鱼的存活率越来越低。这可能是因为仔鱼还没有开口, 而温度影响着仔鱼对卵黄物质的消耗速度, 温度越高则消耗越快, 无法开口的仔鱼存活时间就越短。

3.2 光照强度对杂交鲷受精卵孵化及仔鱼存活的影响

光照强度与温度一样, 也是直接影响着鱼类胚胎发育的重要因素之一。250~500 lx的光照强度, 是中华鲟(Acipenser sinensis)受精卵的最适发育光照^[19]; 不同的光照条件对点带石斑鱼仔鱼的存活率也有着影响^[20]。

从实验结果中可以看出, 光照对杂交鲷受精卵的孵化率影响并不显著, 在300~800 lx光照下有着较高的孵化率和较低的畸形率。这可能是由于黑鲷产卵时间是在夜间, 由其自身的生活习性所决定的, 较低强度的光照会有利于受精卵的孵化。光照对于畸形率的影响则相对明显一些, 大于800 lx的光照会导致仔鱼畸形率明显上升, 10 000 lx光照下的畸形率接近30%, 是300 lx光照组的3倍, 强光照下致畸现象的机理仍有待进一步研究。孵化时间受光照强度的影响很小, 可以看出影响杂交鲷受精卵孵化的主要因素仍是温度。在本实验中, 不同光照强度下的孵化时间略有差异, 可能是因为实验过程中, 强光照的实验组距离光源较近, 导致温度略有升高(测量温度后发现10 000 lx组的温度比10 lx组的高出0.8℃), 略微影响了实验的准确性。

与受精卵发育所不同的是, 杂交鲷仔鱼生长所需求的光照强度要高于受精卵孵化所需。在5 000 lx光照强度下, 7日龄仔鱼有着最高的存活率, 更高或更低的光照强度都会导致其存活率下降。秦志清等^[21]认为, 过高的光照下, 仔鱼处于高度活动状态, 因此耗能过多, 存活率较差; 而过低的光照下, 仔鱼摄食困难, 因此存活率也会降低。周秋白等^[22]认为光照可以影响仔鱼的摄食、代谢及活动, 从而影响到仔鱼发育阶段对环境条件的适应性以及仔鱼的存活率。在更多的研究中也有提及光照对鱼类育苗的影响, 光照对杂交鲷育苗的影响不如温度、盐度等因素的影响更显著、更直接^[23-24], 因此光照因素在实际生产过程中往往得不到足够的重视, 但也是一个非常重要的环境因子。

综上分析, 在实际生产中, 将培育环境条件控制在温度18~20℃和光照强度300~800 lx范围内, 将有利于提高黑鲷(♀)×真鲷(♂)杂交子代受精卵的孵化率, 而20℃的温度和5 000~10 000 lx的光照条件更有利于孵出仔鱼的存活。