卵生鱼类胚后发育过程中, 初孵仔鱼脱离了母体和卵壳的保护, 对环境和营养因子的变化非常敏感^[1-3]。初孵仔鱼器官发育不完善, 在呈现为成鱼形态之前需经历变态过程^[4-6], 并在长期的进化过程中形成了与生存相关的器官优先发育的模式, 称为异速生长^[7-8]。骨骼发育对于养殖鱼类苗种培育至关重要, 异常发育的骨骼影响外部形态及功能需求, 导致运动困难、生长迟滞、甚至引发高的死亡率, 导致较大的经济损失和劳动力浪费^[9-12]。鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus), 俗称龙胆石斑, 隶属鲈形目(Perciformes)、科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephalus), 为暖水性珊瑚礁鱼类, 主要分布在东南亚与澳大利亚附近海域、中国南海诸岛和海南岛等海域, 但数量稀少。鞍带石斑鱼是石斑鱼类群中体型最大的鱼类, 生长速度快、抗病性强、肉质鲜美, 具有很高的营养价值。但由于人工繁育技术的限制, 培育过程中产生较高死亡率, 严重限制了其海水养殖产业的发展。对鞍带石斑鱼苗种培育过程中的养殖条件优化及胚胎发育和胚后外部形态发育的研究已有报道^[13-16], 但尚未见对其骨骼发育及早期发育阶段异速生长研究的报道。本实验中, 作者系统地研究了鞍带石斑鱼苗种培育过程中仔稚鱼的生长特性、骨骼发育及它们之间的关系。本实验结果可为鞍带石斑鱼苗种培育技术的优化提供指导。

1 材料与方法 1.1 鞍带石斑鱼仔稚鱼的培育

亲鱼来自山东省莱州明波水产科技有限公司, 室内标准条件养殖, 对亲鱼进行人工催产并经过人工授精获得受精卵, 收集受精卵转移到孵化网箱, 水温29℃±0.5℃, 缓水流, 持续曝气。初孵仔鱼转移到25 L养殖池, 养殖池中提前播种微绿球藻藻液, 水温29℃±0.5℃, 溶解氧量7.0~8.5 mg/L, 盐度30~ 32, pH 7.7~8.0, 持续曝气, 弱光。仔鱼孵化后3 d开口, 孵化后2~10 d投喂S型褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis), 孵化后6~27 d投喂L型轮虫, 孵化后16~ 40 d投喂卤虫(Artemia sp. nauplii)无节幼体, 孵化后30~45d投喂大卤虫。

1.2 鞍带石斑鱼仔稚鱼样本的采集

样本采集包括的发育时期有变态前期、变态早期(长棘期)、变态晚期(收棘期)及变态后期, 变态期间背/臀鳍棘经历出现-延伸-退化过程。从孵化后开始取样直到孵化后45 d, 每天早上投饵前随机取30个体, 测量生长数据并固定。样本用过量的MS-222 (Sigma- Aldrich, Saint Louis)麻醉后10%福尔马林溶液固定至少24 h, 确保充分固定, 室温保存在70%乙醇中。

1.3 鞍带石斑鱼仔稚鱼样本的骨骼染色

骨骼染色方法根据文献[17-18]描述的方法, 样品处理后保存在甘油中, 并加入少量麝香草粉防止细菌污染。

1.4 鞍带石斑鱼仔稚鱼骨骼染色样本观察和生长发育数据的采集

染色的仔稚幼鱼样品放入加有甘油的培养皿中, 用尼康SMZ 1000体视镜观察, 并用尼康DS-Fi1拍照系统进行照片采集, 采集的图像用Adobe Photoshop CS软件(www.photoshop.com)进行处理。仔稚幼鱼的全长、颅骨长度、脊柱长度和尾鳍复合物长度用SMZ1000体视镜测量。

所有的数据均用SPSS 16.0软件(www.ibm.com)进行分析, 统计数据表现为mean ± S.D。并对数据进行ANOVA分析, 并在显著性水平达到0.05时进行T检验。异速生长用方程用y=ax^b进行分析, 其中y表示测量的仔稚幼鱼颅骨长度/脊柱长度/尾鳍复合物的长度, a表示截距, x表示仔稚幼鱼全长, b表示生长系数^[7]。当生长系数b=1时, 代表等速生长, 生长系数b > 或 < 1时, 分别代表正异速生长或负异速生长。

2 实验结果 2.1 鞍带石斑鱼苗种培育过程中的骨骼发育

鞍带石斑鱼仔稚鱼骨骼发育见图 1。初孵仔鱼全长1.5 mm±0.1 mm, 不存在任何软骨与骨元件。当仔鱼全长达到2.3 mm±0.1 mm (3dph)时, 仔鱼开口, 此时存在的骨骼元件主要集中于头部, 此外, 胸鳍原基也可观察到(图 1 a)。当仔鱼全长达到4.1 mm± 0.1 mm (12dph)时, 颅骨的发育更加完善, 背鳍、腹鳍和脊柱发育起始, 背棘和腹棘不断延长, 进入变态早期(图 1 b)。当仔鱼全长达到4.8 mm±0.1 mm (15dph)时, 颅骨、脊柱继续发育, 背棘和腹棘继续延长, 此外, 尾鳍发育起始(图 1 c)。仔鱼骨骼发育不断完善, 当仔鱼全长达到6.4 mm±0.1 mm(20dph)时, 颅骨骨骼接近成体状态(图 1 d)。当仔鱼全长达到9.2 mm± 0.1 mm(25dph)时, 仔鱼身体各部分骨骼基本形成, 此时背棘和腹棘达到最长状态, 可达仔鱼全长的1/2;部分骨骼骨化过程起始, 颅骨中的颌骨与鳃盖骨、背棘、腹棘优先骨化(图 1 e)。

2.2 鞍带石斑鱼早期异速生长特性

生长与日龄的关系见图 2。鞍带石斑鱼仔稚鱼的全长、颅骨长度、脊柱长度及尾鳍复合物长度在变态前期(1.5~3.9 mm±0.1 mm, 0~10 dph)和变态早期(长棘期3.9~10 mm±0.1 mm, 11~25 dph)增加缓慢; 当仔鱼进入变态晚期(收棘期10~25.8 mm±0.1 mm, 26~41 dph)增加较为迅速, 且在此阶段出现较明显的波动性, 其中全长及脊柱长的波动性较明显, 而颅骨长度和尾鳍复合物长度的波动性较为缓和。

颅骨异速生长特性见图 3。鞍带石斑鱼仔稚鱼的颅骨在变态前期(1.5~3.9 mm±0.1 mm, 0~10 dph)和变态早期(长棘期3.9~10 mm±0.1 mm, 11~25 dph)呈现正异速生长模式, 在变态晚期(收棘期10~25.8 mm± 0.1 mm, 26~41dph)以及变态后期为负异速生长。

脊柱的异速生长特性见图 4。鞍带石斑鱼仔稚鱼的脊柱在变态前期(1.5~3.9 mm±0.1mm, 0~10 dph)和变态早期(长棘期3.9~10 mm±0.1 mm, 11~25 dph)呈现负异速生长模式, 在变态晚期(收棘期10~25.8 mm± 0.1 mm, 26~41dph)以及变态后期为近等速生长。

尾鳍复合物的异速生长特性见图 5。鞍带石斑鱼仔稚鱼的尾鳍复合物在变态前期(1.5~3.9 mm±0.1 mm, 0~10 dph)和变态早期(长棘期3.9~10 mm±0.1 mm, 11~25 dph)呈现正异速生长, 在变态晚期(收棘期10~25.8 mm±0.1 mm, 26~41 dph)以及变态后期为近等速生长。

3 讨论

饥饿和被捕食是影响仔稚幼鱼存活的主要影响因素之一^[19-22], 因此, 在长期的进化过程中形成了与生存相关的器官优先发育并表现为异速生长的发育模式^[23]。鞍带石斑鱼仔稚幼鱼的全长、颅骨长度、脊柱长度及尾鳍复合物长度在变态前期及变态早期随日龄变化缓慢, 作者推测, 可能是由于初孵仔鱼的器官发育不完善, 从而导致营养摄取及利用能力较低, 在此阶段仔鱼所摄取的能量主要用于与生存相关的器官的发育; 在变态晚期和变态后期, 稚鱼营养摄取及利用的器官发育趋于完善, 因此进入快速生长发育阶段, 这种发育模式也在其他鱼类中发现, 如斑石鲷(Oplegnathus punctatus)^[24]、施氏鲟(Acipenser schrenckii)^[25]、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)^[26]等。

在本实验中, 在仔鱼早期发育阶段颅骨优先发育, 在变态前期和变态早期(长棘期)颅骨呈现正异速生长模式, 进入变态晚期(收棘期), 颅骨接近成体状态并呈近等速生长。类似的发育模式也在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)^[27]和斑石鲷^[24]中发现, 而在鱼(Miichthys miiuy)中, 颅骨发育则表现为在较早的发育阶段为正异速生长, 在较晚的阶段为负异速生长^[28]。此外, 在施氏鲟^[25]和大马哈鱼(Oncorhynchus keta)^[29]的整个早期发育阶段颅骨发育均呈现为正异速生长。

在鞍带石斑鱼中, 变态前期脊索是贯穿身体的唯一轴向支撑结构, 变态早期脊柱发育起始。在变态前期和变态早期(长棘期), 脊柱呈负异速生长, 变态晚期(收棘期)和变态后期呈近等速生长, 这种发育模式可能是由于仔鱼在发育早期所摄取的营养主要用于与生存相关器官的发育, 如与摄食和呼吸相关的颅骨结构, 这种趋势也在西伯利亚鲟(Acipenser baeri)中发现^[30]。而在条石鲷中, 脊柱在早期发育期的较早阶段表现为近等速增长, 在较晚的时期呈现负异速增长^[26], 在鱼(M. miiuy)中, 脊柱在整个早期发育阶段均呈近等速增长^[28]; 而在大马哈鱼(O.keta)中, 脊柱在整个早期发育阶段均呈正异速增长^[29]。

鞍带石斑鱼尾鳍复合物的生长特性与颅骨类似, 在仔鱼变态前期和变态早期(长棘期)为正异速生长, 进入变态晚期(收棘期)为近等速生长, 尾鳍的这种发育模式使仔稚鱼较早的时期获得向前推进的能力, 有利于捕食和逃避被捕食。相似的发育模式也在西伯利亚鲟, 施氏鲟和条石鲷中发现^{[30, 25-26]}; 而在斜带石斑鱼、大马哈鱼和鲈鲤(Percocypris pingipingi)中尾鳍在整个早期发育期均表现为正异速生长^{[27, 29, 31]}。此外, 在斑石鲷和鱼中, 尾鳍在较早的发育阶段表现为正异速增长, 而在较晚的时期呈现负异速增长^{[24, 28]}。

通过对鞍带石斑鱼仔稚幼鱼苗种培育过程中骨骼发育与生长特性的研究, 发现与大多数硬骨鱼类似, 颅骨、脊柱和鳍均呈现出异速生长特性, 骨骼发育起始于孵化后, 并且与摄食和呼吸相关的颅骨原件优先发育, 这是在长期的进化过程中形成的适应生存环境提高种群成活率的结果。本研究表明, 在苗种培育过程中, 可以根据鞍带石斑鱼早期骨骼发育与生长特性, 创造有利条件, 提高仔稚鱼存活率并降低畸形率。