海洋科学  2018, Vol. 42 Issue (7): 54-63   PDF    
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180105002

文章信息

陈文, 王湘君, 邵东旭, 王玉杰, 孙宏元, 公维洁. 2018.
CHEN Wen, WANG Xiang-jun, SHAO Dong-xu, WANG Yu-jie, SUN Hong-yuan, GONG Wei-jie. 2018.
PEF结合酶法提取方格星虫(Sipunculus nudus)多糖工艺条件
The Polysaccharide Extraction Process by PEF Enzyme Binding Method from Sipunculus nudus
海洋科学, 42(7): 54-63
Marina Sciences, 42(7): 54-63.
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180105002

文章历史

收稿日期:2018-01-05
修回日期:2018-07-09
PEF结合酶法提取方格星虫(Sipunculus nudus)多糖工艺条件
陈文1, 王湘君2, 邵东旭1, 王玉杰1, 孙宏元1, 公维洁1     
1. 海南热带海洋学院 海洋科学技术学院, 海南 三亚 572022;
2. 海南热带海洋学院 生命科学与生态学院, 海南 三亚 572022
摘要:为了优化提取方格星虫(Sipunculus nudus)多糖工艺实验条件, 采用PEF酶法提取方格星虫多糖, 依据料液比、浸提温度、酶底比、PEF电场强度、浸提时间、脉冲数对多糖提取率的影响, 以响应曲面法优化方格星虫多糖提取的最优工艺条件, 通过紫外可见分光光度计测定多糖吸光度进而计算提取率。结果表明:各因素对方格星虫多糖提取率的影响程度为:料液比 > 电场强度 > 提取温度 > 提取时间; 最优工艺条件为:料液比(g/mL) 1︰7, 浸提温度50℃, 酶底比为2.5%, 电场强度30 kV/cm, 脉冲数为12, 浸提时间2 h; 多糖最大提取率为6.45%。
关键词方格星虫(Sipunculus nudus)    PEF    酶法    多糖    响应面法    
The Polysaccharide Extraction Process by PEF Enzyme Binding Method from Sipunculus nudus
CHEN Wen1, WANG Xiang-jun2, SHAO Dong-xu1, WANG Yu-jie1, SUN Hong-yuan1, GONG Wei-jie1     
1. School of ocean science and technology, Hainan Tropic Ocean University, Sanya 572022, China;
2. School of life science and ecology, Hainan Tropic Ocean University, Sanya 572022, China
Abstract: To optimize the extraction process of Polysaccharides from S. nudus experimental conditions. Study on the PEF enzymatic extraction of Polysaccharides from S. nudus, according to the effects of polysaccharide extraction rate, such as the material liquid ratio, extraction temperature, enzyme substrate ratio PEF, extraction time, electric field strength, pulse number, as well as optimization of surface polysaccharides from S. nudus extraction optimum conditions of respons, and calculation the extraction rate of polysaccharide with absorbance UV visible spectrophotometer.The influence of S. nudus polysaccharide extraction rate: The ratio of material to liquid > electric field strength > extraction temperature > extraction time. The optimum technological conditions are as follows: solid-liquid ratio 1:7g/mL, extraction temperature 50, enzyme base ratio 2.5%, electric field strength 30kV/cm, pulse number 12, extraction time 2h. The maximum extraction rate of polysaccharide is 6.45%. This method is a new experiment with satisfactory results.
Key words: Sipunculus nudus    PEF    enzyme    polysaccharide    response surface method    

方格星虫(Sipunculus nudus), 俗称“沙虫”, 是一种肠条状, 浑身光裸无毛, 体壁纵肌成束的无脊椎动物[1-3]; 方格星虫具有丰富的食用和药用价值, 肉质脆嫩, 含有丰富蛋白质、多糖等多种活性物质, 具有滋阴降火、清肺补虚活血强身等功能, 对调节机体多种机能具有重要作用, 被称为海洋的冬虫夏草[4]; 目前主要用于医学领域研究, 并已证实方格星虫具有抗菌、抑制乙肝病毒活性、延缓衰老、抗氧化、抗疲劳、抗辐射、耐缺氧、耐高温及保护心血管系统等多种功效[5]

多糖是由多个单糖分子缩合、失水而形成的结构复杂的糖类物质, 它的种类繁多, 主要分布于动植物中, 随着海洋生物的开发, 多糖研究对象从陆地植物转向海洋生物, 研究发现, 海洋生物多糖的种类大体分为3种:海洋微生物多糖、海藻多糖和海洋动物多糖[6-7]。动物多糖研究集中在脏器, 提取通常采用热水浸提、碱提、酶提和中性盐溶液提取等提取方法, 所得提取液用乙醇等有机溶剂进行沉淀回收, 使得如色素、单糖、寡糖等一部分杂质得以除去, 得到多糖物质再经过其他处理即可得到粗多糖。能够影响多糖提取量的因素有很多, 比如提取温度、提取溶剂、提取时间、料液比等。酶法提取是通过对蛋白质的降解破坏蛋白质与多糖链之间的共价结合, 达到提取多糖的目的; 高压脉冲电场(PEF)结合酶法提取是利用PEF产生强烈的振动、高的加速度、空化效应和搅拌等特殊作用, 使被提取物的细胞被破坏, 溶剂渗入细胞中, 以便被提取物细胞中有效成分溢出, 该方法可使后续工艺更简易、省时[8-14]。本研究以方格星虫为原料, 在单因素实验基础上, 采取响应面法研究PEF结合酶法提取方格星虫多糖最佳工艺条件, 为方格星虫多糖功能性食品开发、药用价值进一步研究, 星虫高值化开发利用提供一定实验依据和理论基础, 对后续方格星虫的研究开发具有重要的意义。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

方格星虫为三亚市鲜活方格星虫(长度为4~8 cm, 体质量约为3~6 g/条)。

葡萄糖(AR), 无水乙醇(AR), 浓硫酸(AR), 苯酚(AR), 盐酸(AR), 95%乙醇(AR), 丙酮(AR), 三氯乙酸(AR), 胰蛋白酶(1︰250), 上海伯奥生物科技有限公司; 除特殊说明, 所用试剂均为购自广州化学试剂有限公司, 实验用水为超纯水。

ZGF直流高压发生器、高频脉冲发生器, 扬州市鹏远电气有限公司, 60kV/2mA高频直流高压发生器; 北京普析通用仪器有限责任公司; 组织捣碎机JJ-2, 金坛市白塔新宝仪器公司; 电子天平FA2204B, 上海精科天美科学仪器有限公司; 紫外可见分光光度计UV-6300PC, 上海美普达仪器有限公司; 高速台式离心机TGL-18C, 金坛市盛蓝仪器制造有限公司; 真空干燥箱DZF-OB, 金坛市盛蓝仪器制造有限公司; 恒温磁力搅拌器X85-2S, 金坛市盛蓝仪器制造有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 方格星虫的预处理

采购符合实验要求鲜活方格星虫, 用剪刀剪去方格星虫尾部, 使用一次性筷子从尾部至头部将方格星虫内外翻倒, 清洗3~5次去除内脏沙子, 使用蒸馏水清洗2~3次, 将方格星虫剪成短节状, 加入料液比1︰1g/mL, 用组织匀浆机打碎, 低温保存, 以备实验使用。

1.2.2 方格星虫粗多糖的检测 1.2.2.1 葡萄糖最大吸收波长的测定

运用硫酸-苯酚法[15]测定葡萄糖标准溶液曲线, 将葡萄糖置于干燥箱中100℃干燥至恒重, 精确称量0.254 2 g葡萄糖于100 mL烧杯中, 加适量蒸馏水溶解后, 使其在100 mL容量瓶中定容, 配制为2.5420 g/L葡萄糖标准溶液; 从中取2 mL稀释成10 mL, 取稀释液0.6 mL到干燥的10 mL试管中, 加纯水至1mL后, 滴加2.0 mL5%的苯酚, 摇匀后再滴加3.0 mL浓硫酸, 摇匀, 冷却至室温, 用WFJ-7200型可见分光光度计进行测定最大吸收波长。

1.2.2.2 葡萄糖标准曲线的制备

取稀释液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL到10 mL试管中, 配制成不同浓度葡萄糖溶液, 在最大吸收波长下测定其吸光度, 以浓度作横坐标, 吸光度作纵坐标绘制葡萄糖标准曲线, 将实验得到粗多糖也按此方法测其吸光度, 参照标准曲线可算得多糖浓度。

1.2.3 PEF酶法提取方格星虫多糖条件研究

每组实验称取方格星虫肉酱的质量均为2.0000 g, 每组实验都进行精密度实验(同一组实验做3次平行实验)考察, RSD均为0.98%以上, 符合效能指标。

1.2.3.1 最优料液比的选取

方格星虫提取液料液比(g/mL)分别选取1︰5、1︰6、1︰7、1︰8、1︰9, 在酶底比为2.5%、浸提温度为50℃、电场强度为30 kV/cm、浸提时间为2 h的条件下进行多糖提取, 依据多糖提取率, 确定其最优料液比。

1.2.3.2 最优浸提温度的选取

浸提温度分别选取40、50、60、70、80℃, 料液比(g/mL)为1︰7, 准确称取方格星虫料液, 在酶底比为2.5%、电场强度为30 kV/cm、浸提时间为2 h的条件下进行多糖提取, 依据多糖提取率, 确定其最优浸提温度。

1.2.3.3 酶底比对方格星虫多糖提取的影响

准确称取方格星虫样品2.000 g, 酶底比分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%, 其他提取条件一定, 研究不同酶底比对方格星虫多糖提取率的影响, 分析其结果得以确定最佳酶底比A

1.2.3.4 最优PEF电场强度的选取

电场强度分别选取15、20、25、30、35 kV/cm, 料液比(g/mL)为1︰7, 准确称取方格星虫料液, 在酶底比为2.5%、浸提温度为50℃、浸提时间为2 h条件下进行多糖提取, 依据多糖提取率, 确定其最优电场强度。

1.2.3.5 最优浸提时间的选取

浸提时间分别选取1、1.5、2、2.5、3 h, 料液比(g/mL)为1︰7, 准确称取方格星虫料液, 在电场强度为30 kV/cm、酶底比为2.5%、浸提温度为50℃条件下进行多糖提取, 依据多糖提取率, 确定其最优浸提时间。

1.2.3.6 最优脉冲数的选取

脉冲数分别选取0、2、4、6、8、10、12、14、16个, 料液比(g/mL)为1︰7, 准确称取方格星虫料液, 在电场强度为30 kV/cm、在酶底比为2.5%、浸提温度为50℃、浸提时间为2 h条件下进行多糖提取, 依据多糖提取率, 确定其最优脉冲数。

1.2.4 PEF酶法提取方格星虫多糖

以方格星虫肉酱为原料, pH为8的氢氧化钠溶液为提取剂配制方格星虫提取液, 将各组实验提取液置于PEF发生器中处理45 min后, 用胰蛋白酶(1︰250)进行酶法提取, 之后放置冷却室温; 用15%的盐酸调节碱提液的pH为7, 然后10 000 r/min离心30 min, 收集其上清液滴加10%的三氯乙酸边搅拌至pH为4.0, 6 000 r/min离心15 min去蛋白, 收集上清液, 在90℃恒温水浴下浓缩至原体积的1/4左右, 冷却至室温后, 加入3倍量95%的乙醇溶液, 在4℃下静置过夜, 将静置液过滤, 得到沉淀后用无水乙醇和丙酮分别多次洗涤, 放置通风处自然风干, 得到方格星虫粗多糖, 将实验得到的粗多糖, 按测定葡萄糖标准溶液吸光度的方法测定其吸光度, 参照标准曲线得多糖的浓度, 方格星虫多糖的提取率计算公式如下。

$ {\rm{多糖提取率}}\left( \% \right) = {\frac{{C{V_1}100}}{{{V_0}M1000}}^{\left[ {16 - 17} \right]}} $

式中, C为粗多糖浓度(g/L), V1为粗多糖溶液体积(mL), V2为稀释后溶液体积(mL), V0为测定所用体积(mL), M为方格星虫肉酱质量(g)。

1.2.5 Box-Behnken中心组合实验设计

为进一步优化实验样品处理的最佳条件, 提高实验的得率, 根据单变量因素考察结果, 选取对多糖提取量影响最大及稳定性较弱的四个单因素(因脉冲数对多糖提取率影响相对稳定), 建立四因素三水平的Box-Behken中心组合实验, 以多糖得率为响应值, 选取对实验结果影响较大的样品处理条件, 选定最优酶底浓度为固定值, 以料液比(A)、浸提温度(B)、电场强度(C)、浸提时间(D)作为实验考察因素, 各因素的三个水平采用–1、0、1进行编码, 每个水平都是由单因素变量考察, 以确定最优提取工艺条件[18], 如表 1所示。

表 1 响应面实验的因素及水平 Tab. 1 The factors and levels of response surface experiment
水平 因素
A:料液比/ (g/mL) B:浸提温度/℃ C:电场强度/(kV/c) D:浸提时间/h
–1 1︰6 40 25 1
0 1︰7 50 30 1.5
1 1︰8 60 35 2
2 结果与分析 2.1 葡萄糖溶液标准曲线的绘制

实验测定葡萄糖标准溶液最大吸收波长为490 nm, 吸光度值为0.736, 葡萄糖标准曲线回归方程为y= 2.4703x–0.01813, 且R2为0.99311。

2.2 料液比对方格星虫多糖提取率的影响

图 1所示, 实验所得各组粗多糖加蒸馏水溶解至10 mL形成粗多糖溶液, 从10 mL的粗多糖溶液中取1 mL再稀释至5 mL后, 取稀释液1 mL待用, 按测定葡萄糖标准溶液吸光度的方法测定方格星虫多糖吸光度, 并计算其提取率, 随料液比的增大, 多糖提取率先升高后降低, 当料液比(g/mL)为1︰7时, 多糖提取率达到最大值; 可能的原因是随着溶剂量增加, 溶液中多糖浓度降低, 多糖从方格星虫体中扩散到溶液中的浓度差扩散动力增大利于方格星虫多糖的溢出, 溶剂量过大时, 会导致多糖分解[19], 使提取率降低。确定最优料液比(g/mL)为1︰7。

图 1 料液比对方格星虫多糖提取率的影响 Fig. 1 The affect of material to liquid-grid ratio on the extraction rate of polysaccharides from S. nudus
2.3 浸提温度对方格星虫多糖提取率的影响

图 2所示, 实验所得各组粗多糖, 按粗多糖溶液配制方法和测定星虫多糖吸光度法进行实验操作, 计算其提取率, 随浸提温度升高, 多糖提取率先提高后降低, 到达50℃时多糖提取率达到最大值, 随后随着温度增加多糖提取率开始下降, 温度过高时会引起多糖分解[20], 提取率降低。确定最优浸提温度为50℃。

图 2 浸提温度对方格星虫多糖提取率的影响 Fig. 2 The affect of extraction temperature of polysaccharide extraction rate from S. nudus
2.4 酶底比对方格星虫多糖提取率的影响

图 3所示, 分别测定在不同酶底比影响下方格星虫粗多糖溶液吸光度, 分析结果并计算其提取率, 选出最佳酶底比, 在其他提取工艺条件一定时, 随着胰蛋白酶加入量增大, 方格星虫多糖提取率也逐渐增大, 当酶底比达2.5%时多糖提取率最高, 随后多糖提取率随酶底比增加开始下降, 确定最佳酶底比为2.5%。

图 3 酶底比对方格星虫多糖提取率的影响 Fig. 3 The affect of the ratio of enzyme to substrate grid on the extraction rate of polysaccharides from S. nudus
2.5 PEF电场强度对方格星虫多糖提取率的影响

图 4所示, 实验所得各组粗多糖按粗多糖溶液配制方法和测定方格星虫多糖吸光度法进行实验操作, 计算其提取率, 随电场强度增大, 方格星虫多糖提取率逐渐升高, 当电场强度达到30 kV/cm时多糖提取率达最大值, 之后多糖提取率降低, 可能原因是PEF强烈振动作用, 使星虫细胞被破坏便于星虫多糖溶出, 随电场强度增大, 越多可溶性多糖溢出, 液料浓度变大, 阻止多糖和向液料发散, 电场强度过大时, 会导致部分多糖降解, 使多糖提取率降低[21]。确定最优电场强度为30 kV/cm。

图 4 电场强度对方对格星虫多糖提取率的影响 Fig. 4 The affect of electric field intensity on the other side of lattice the extraction rate of polysaccharide from S. nudus
2.6 浸提时间对方格星虫多糖提取率的影响

图 5所示, 实验所得各组粗多糖按粗多糖溶液配制方法和测定方格星虫多糖吸光度法进行实验操作, 计算其提取率, 随浸提时间的增长多糖提取率提高, 当到达2 h时多糖提取率达最大值, 后浸提时间继续增长多糖提取率降低。可能原因是浸提时间过短提取不充分, 影响多糖提取率, 浸提时间过长多糖发生分解, 多糖提取率降低。确定最优浸提时间为2 h。

图 5 浸提时间对方对格星虫多糖提取率的影响 Fig. 5 The affect of extraction time on the extraction rate of polysaccharide lattice from S. nudus
2.7 PEF处理脉冲数对星虫粗多糖含量的影响

图 6所示, 实验所得各组粗多糖按粗多糖溶液的配制方法和测定方格星虫多糖吸光度法进行实验操作, 计算其提取率, 脉冲数为0个即不经过高压脉冲电场处理只采用酶法提取的星虫粗多糖中的多糖含量最低, 和最高峰脉冲数为12个多糖含量相比明显更低, 说明PEF处理对星虫粗多糖提取有促进作用; 但随着脉冲数继续增加, 多糖含量反而有小幅度降低, 这可能是由于处理时间延长, 高压脉冲电场处理室温度升高, 造成多糖类物质结构改变, 影响多糖得率, 确定高压脉冲电场处理的脉冲数为12个时, 星虫粗多糖提取效果最佳[22-23]

图 6 脉冲数对方格星虫粗多糖提取的影响 Fig. 6 The affect of the number of pulses grid on extraction of crude polysaccharide from S. nudus
2.8 响应面法优化方格星虫多糖提取工艺 2.8.1 Box-Benhken实验设计及其结果 2.8.1.1 响应面试验回归方程拟合

在单因素试验结果的基础上, 以多糖提取率为响应值, 利用Design-Expert 8.05软件对优化方格星虫多糖工艺条件设计及结果见表 2

表 2 Box-Benhken响应面分析试验设计及结果 Tab. 2 Box-Benhken Response surface analysis experimental design and results
实验号 料液比/(g/mL) 浸提温度/℃ 电场强度/ (kV/cm) 浸提时间/h 提取率/ %
1 1︰6 60 30 2 2.183
2 1︰6 50 30 1.5 2.237
3 1︰7 40 25 2 2.175
4 1︰8 50 30 2.5 2.233
5 1︰7 50 30 2 2.425
6 1︰6 50 25 2 2.164
7 1︰7 50 30 2 2.440
8 1︰8 50 35 2 2.063
9 1︰7 50 30 2 2.422
10 1︰8 60 30 2 2.154
11 1︰7 50 35 1.5 2.173
12 1︰7 60 25 2 2.109
13 1︰6 50 30 2.5 2.266
14 1︰7 50 30 2 2.433
15 1︰8 40 30 2 2.084
16 1︰7 60 30 2.5 2.241
17 1︰7 50 25 2.5 2.227
18 1︰6 50 35 2 2.115
19 1︰7 40 30 2.5 2.222
20 1︰7 40 35 2 2.074
21 1︰7 60 35 2 2.160
22 1︰8 50 25 2 2.131
23 1︰7 50 25 1.5 2.200
24 1︰8 50 30 1.5 2.214
25 1︰7 60 30 1.5 2.218
26 1︰7 40 30 1.5 2.210
27 1︰6 40 30 2 2.150
28 1︰7 50 35 2.5 2.198
29 1︰7 50 30 2 2.437

运用Design Expert 8.05软件对表 2中的数据进行回归模型分析, 得到的回归模型:多糖提取率Y=2.44– 0.018A+(1.000E–002)B–0.015C+0.010D+0.010AB–(7.500E–003)AC–(2.500E–003)AD+0.033BC+(2.500E– 003)BD+(5.000E–003)CD–0.14A2–0.15B2–0.17C2–0.063D2, 对二次回归方程模型中的回归系数进行显著性检验分析见表 2

2.8.1.2 响应面试验优化分析

依据回归模型的分析, 经过Design Expert 8.05软件对料液比、浸提温度、电场强度、浸提时间四个因素进行分析, 得到对应的等高线图及响应曲面图, 如图 7~图 12所示, 可以直观的反映出各因素对方格星虫多糖提取率影响。

图 7 浸提温度与料液比作用对提取率影响的等高线及响应曲面 Fig. 7 The influence of extraction temperature and solid-liquid ratio on extraction rate contour and response surface

图 8 电场强度与料液比作用对提取率影响的等高线及响应曲面 Fig. 8 The influence of electric field intensity and solid-liquid ratio on extraction rate contour and response surface

图 9 浸提时间与料液比作用对提取率影响的等高线及响应曲面 Fig. 9 The influence of extraction time and solid-liquid ratio on extraction rate contour and response surface

图 10 电场强度与浸提温度作用对提取率影响的等高线及响应曲面 Fig. 10 The influence of electric field intensity and extraction temperature on extraction rate contour and response surface

图 11 浸提时间与浸提温度作用对提取率影响的等高线及响应曲面 Fig. 11 The extraction time intensity and extraction temperature on extraction rate contour and response surface

图 12 浸提时间与电场强度作用对提取率影响的等高线及响应曲面 Fig. 12 The extraction time intensity and electric field intensity on extraction rate contour and response surface

等高线图形趋于圆形, 反映出浸提温度与料液比的交互作用明显不强, 等高线沿A轴方向相对密集, 表明料液比对响应值影响大于浸提温度, 与回归分析结果相符; 响应曲面表明在一定范围内, 方格星虫多糖提取率随浸提温度与料液比增大而提高。

等高线图形接近圆形, 反映出电场强度与料液比交互作用明显不强, 等高线沿A轴方向相对密集, 表明料液比对响应值影响大于电场强度, 与回归分析结果相符; 响应曲面表明在一定范围内, 方格星虫多糖提取率随电场强度与料液比增大而提高。

等高线图形趋于椭圆形, 反映出电场强度与料液比的交互作用显著性强, 等高线沿A轴方向相对密集, 表明料液比对响应值影响大于浸提时间, 与回归分析结果相符; 响应曲面表明在一定的范围内, 方格星虫多糖提取率随浸提时间与料液比的增大而提高。

等高线图形趋于圆形, 反映出电场强度与浸提温度交互作用显著性弱, 等高线沿C轴方向相对密集, 表明电场强度对响应值影响大于浸提温度, 与回归分析结果相符; 响应曲面表明在一定范围内, 方格星虫多糖提取率随电场强度与浸提温度增大而提高。

等高线图形趋于椭圆形, 反映出浸提时间与浸提温度的交互作用显著性强, 等高线沿B轴方向相对密集, 表明浸提温度对响应值影响大于浸提时间, 与回归分析结果相符; 响应曲面表明在一定范围内, 方格星虫多糖提取率随浸提时间与浸提温度增大而提高。

等高线图形趋于椭圆形, 反映出浸提时间与电场强度的交互作用显著性强, 等高线沿C轴方向相对密集, 表明电场强度对响应值影响大于浸提时间, 与回归分析结果相符; 响应曲面表明在一定范围内, 方格星虫多糖提取率随浸提时间与电场强度增大而提高。

2.8.1.3 方差分析

表 3所示, 获得回归模型P < 0.0001, 是高度显著, 失拟项P > 0.1000, 是不显著, 表明模型预想值与实验值较一致, 是可靠模型, 实验结果受未知因素影响较小。回归模型R2=0.9798, 可以认为有97.98%的响应值变化, 其变化来自料液比、超声温度、浸提电场强度、浸提时间四个因素; 在各因素中A2B2C2D2对方格星虫提取的影响高度显著, ACBD对方格星虫提取影响显著, F值显示出各因素对方格星虫多糖提取率的影响效果为:料液比 > 电场强度 > 提取温度 > 提取时间。

表 3 回归模型的方差分析及显著性分析结果 Tab. 3 The analysis of variance and significance analysis results of regression model
方差来源 平方和 自由度 方差 F P 显著性
回归模型 0.35 14 0.025 48.61 < 0.0001 显著
A-料液比 4.033E-003 1 4.033E-003 7.86 0.0141 显著
B-浸提温度 1.200E-003 1 1.200E-003 2.38 0.1284 不显著
C-电场强度 2.700E-003 1 2.700E-003 5.26 0.0377 显著
D浸提时间 1.200E-003 1 1.200E-003 2.34 0.1484 不显著
AB 4.000E-004 1 4.000E-004 0.78 0.3921 不显著
AC 2.250E-004 1 2.250E-004 0.44 0.5185 不显著
AD 2.500E-005 1 2.500E-005 0.049 0.8284 不显著
BC 4.225E-003 1 4.225E-003 8.24 0.0123 显著
BD 2.500E-005 1 2.500E-005 0.049 0.8284 不显著
CD 1.000E-004 1 1.000E-004 0.19 0.6655 不显著
A2 0.13 1 0.13 259.24 < 0.0001 显著
B2 0.14 1 0.14 268.37 < 0.0001 显著
C2 0.19 1 0.19 368.39 < 0.0001 显著
D2 0.026 1 0.026 50.46 < 0.0001 显著
残差 7.180E-003 14 5.129E-004
失拟项 6.300E-003 10 6.300E-004 2.86 0.1612 不显著
纯误差 8.800E-004 4 2.200E-004
合计 0.36 28
R2=0.9798 RAdj2=0.9597
注: (P < 0.0500)表示差异高显著; (P < 0.1000)表示差异显著; (P > 0.1000)表示差异不显著。
2.8.2 响应面实验最优提取条件的选择

由回归模型的分析结果得方格星虫多糖提取的最优条件分别为料液比1︰6.94 g/mL、浸提温度50.29℃、电场强度30 kV/cm、浸提时间2.04 h; 在此条件下的预测提取率6.45%;在实验中为操作简便, 将方格星虫多糖提取最优条件修整为:料液比(g/mL) 1︰7、浸提温度50℃、电场强度30 kV/cm、浸提时间2 h。

3 结果与讨论

当前对多糖的提取主要以酸提法和碱提法为主, 提取率相对高一点, 但不论酸提法还是碱提法, 对提取物活性结构都会有损害, 不利于后续实验连续性展开, 现有研究中对多糖提取方法优化尚未阐明的, 有待进一步研究, 本实验以优化PEF辅助酶法提取方格星虫多糖工艺条件展开研究, 寻求料液比、浸提温度、酶底浓度、PEF电场强度、浸提时间及脉冲数6个因素对方格星虫多糖的提取相互影响; 采用响应面分析法优化方格星虫多糖的提取工艺, 最终确定选用料液比、浸提温度、PEF电场强度、浸提时间四个因素进行进行四因素三水平实验设计, 安排5个中心点, 共设计出29组实验, 确定PEF酶法提取方格星虫多糖的最优工艺条件为:酶底比为2.5%, 料液比(g/mL)为1︰7、浸提温度为50℃、电场强度为30 kV/cm、浸提时间为2 h, PEF酶法提取方格星虫多糖提取率为6.45%。与本研究同时展开的有另两组对比性实验, 均采用超声波提取星虫多糖, 区别在于料液比、酶底比等单变量因素。第一组对比实验提取方格星虫多糖的最优工艺条件为:酶底比为2.5%, 温度为50℃、浸提时间为2 h、料液比(g/mL)为1︰17、超声时间为1 h、pH值为8、超声功率为960 W, 多糖提取率为3.24%(详细研究过程及结果将在其他刊物发表); 第二组对比实验提取方格星虫多糖的最优工艺条件为:料液比(g/L)1︰11、浸提温度60℃、超声浸提3次, 超声功率960 W、浸提时间1.5 h, 碱液浓度5%, 多糖提取率为3.21% (详细研究过程及结果将在其他刊物发表)。在两组对比实验研究中发现, 在其他提取条件相当, 星虫多糖提取由超声波换成PEF, 提取多糖的效果由第一组的3.24%第二组的3.21%增长到了6.45%, 提取率提高近2倍。

本实验方案条件温和, 保全多糖活性不被破坏, 具备对多糖活性后续试验连续性、可操作性及数据有效性, 不仅能够提高提取率, 同时减少操作成本, 操作简便, 提取结果令人满意。

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