2018, Vol. 42
文章信息
- 贺惠, 陈阳阳, 王勋功, 甄毓, 米铁柱, 于志刚, 李迎. 2018.
- HE Hui, CHEN Yang-yang, WANG Xun-gong, ZHEN Yu, MI Tie-zhu, YU Zhi-gang, LI Ying. 2018.
- 海洋沉积物氨氧化菌群落结构的测序分析
- Analysis of ammonia-oxidizing bacteria community structure in marine sediments using different sequencing technologies
- 海洋科学, 42(8): 22-29
- Marine Sciences, 42(8): 22-29.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20171215002
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文章历史
- 收稿日期：2017-12-15
- 修回日期：2018-07-23
2. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266071;
3. 海洋环境与生态教育部重点实验室, 山东 青岛 266100;
4. 中国海洋大学 环境科学与工程学院, 山东 青岛 266100;
5. 海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室, 山东 青岛 266100
2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China;
3. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China;
4. College of Environmental Science and Engineering, Qingdao 266100, China;
5. Key Laboratory of Marine Chemical Theory and Technology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China
海洋沉积物是地球上最大面积的覆盖层, 约占地球总面积的48.6%[1]。沉积物中丰富的微生物, 是沉积物与水体之间物质交换的主要推动力; 微生物的分布与代谢也影响着沉积物中碳、氮等生源要素的生物地球化学过程。氨氧化过程作为硝化过程的关键限速步骤, 在全球氮循环中发挥着极为重要的作用。氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)是氨氧化过程的主要驱动者之一, 氨单加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)是氨氧化微生物特有的一种胞内酶。对AOB来说, 该酶由amoC、amoB和amoA三个亚基组成, 为一保守的amoCAB结构[2, 3]。amoA基因编码氨单加氧酶的活性位点, 且在AOB中保守性较高, 因此amoA基因常用作AOB群落研究的特征基因, 已被用于多种生境中AOB群落信息的研究[4-7]。
20世纪90年代以来, 以第1代测序技术为基础的分子生物学方法得到了广泛应用, 极大推动了微生物生态学的研究进程。克隆文库技术是目前最常用的微生物群落组成和多样性分析方法, 该方法通常与第1代测序技术相结合, 获得微生物群落的组成和多样性特征。但是克隆文库技术能获得的基因序列条数有限, 仅能反映有限的优势微生物类群, 且工作量大、花费较高[8]。同时, 由于克隆子的选择是随机的, 从统计学角度来说, 只有克隆子数目足够多时, 克隆文库才能比较真实地反映环境中微生物的群落组成情况[9]。21世纪初, 第2代测序技术开始兴起, 在各种环境如土壤[10, 11]、海水[12]、活性污泥[13]、沉积物[14, 15]的微生物群落分析中发挥了重要作用。其中海洋环境中的微生物群落由少数高丰度类群和多数低丰度类群组成[16], 而基于第1代测序技术的克隆文库对这些低丰度类群的检测能力有限, 因此, 第2代测序技术在其中的应用就显得尤为重要。
以往研究中, 根据amoA基因序列, AOB群落可划分为10~40个OTUs[17-19], 与其他微生物类群如硫酸盐还原菌相比, AOB的物种丰富度和多样性水平相对较低。迄今为止, 克隆文库技术仍是AOB群落结构和多样性研究的主流方法, 采用高通量测序技术分析AOB群落结构和多样性的研究并不多见[20-22]。基于以上考虑, 本研究以amoA基因为目的基因, 分别采用克隆文库技术、454高通量测序技术和illumina测序技术, 分析了东海海域沉积物中AOB菌群组成、多样性等方面的特征, 旨在比较不同测序技术在分析海洋沉积物AOB菌群特征中的优劣, 为海洋沉积物中AOB分子生态学研究提供参考。
1 材料和方法 1.1 样品的采集与保存2011年8月初采集东海海域表层沉积物样品, 采样站位为31站(122.55°E, 29.56°N)(图 1)。用箱式采泥器采集表层沉积物后, 刮取表层3 cm样品, 置于封口袋中, 于-20℃冰箱中保存用于核酸提取。
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| 图 1 2011年8月航次表层沉积物采样站位 Fig. 1 Sampling site of surface sediments in August 2011 |
将沉积物解冻混匀后, 用PowerSoil® DNA Isolation Kit(MOBIO, 美国)提取微生物基因组DNA, 得到的DNA保存于-20℃冰箱中待用。基因组DNA提取步骤如下:
将0.25 g沉积物样品加入到PowerBead Tubes中, 涡旋混匀后加入60 μL Solution C1, 颠倒混匀。把PowerBead Tubes固定在涡旋仪上, 最大转速涡旋连续振荡10 min。室温10 000 g离心30 s, 吸取转移上清至一个干净的2 mL Collection Tube中。加入250 μL Solution C2后, 涡旋混匀5 s。4℃孵育5 min, 室温10 000 g离心1 min。避开沉淀小珠, 转移上清至新的离心管中。加入200 μL Solution C3到上清中, 涡旋混匀。4℃孵育5 min, 室温10 000 g离心1 min后避开沉淀小珠, 转移上清至新的离心管中; 加入1 200 μL Solution C4到上清中, 涡旋混匀5 s。将上清转移至Spin Filter, 室温10 000 g离心1 min。弃去滤液, 继续加入上清, 室温10 000 g离心1 min。重复直至过滤完所有上清; 加入500 μL Solution C5至Spin Filter中, 室温10 000 g离心30 s。弃去上清, 室温10 000 g离心1 min。小心转移Spin Filter到2 mL Collection Tube中, 加入100 μL Solution C6到白色滤膜中心, 室温10 000 g离心30 s后, 弃去Spin Filter, 置于-20℃保存。
1.3 克隆文库构建及生物信息学分析 1.3.1 克隆文库构建使用引物amoA-1F(5′-GGG GTT TCT ACT GGT GGT)和amoA-2R(5′-CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC)扩增amoA基因, 长度约491 bp[23]。PCR反应程序为94℃下解链10 min, 随后35个循环包括94℃变性30 s, 58℃复性45 s, 72℃延伸1 min, 72℃延伸10 min后于4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物, 收集目的条带处的凝胶, DNA凝胶回收试剂盒(Takara, 大连)纯化目的片段。
将纯化产物连接到pMD18-T载体上后转化到Escherichia coli Trans 5α感受态细胞中, 通过蓝白斑筛选含有目的基因的阳性克隆, 随机挑取约100个白色克隆至新的Luria-Bertani固体培养基(含100 μg/mL氨苄青霉素)上, 37℃培养箱中倒置培养4~6 h后送测序(华大基因, 北京)。测序结果提交至GenBank数据库, 登录号为KF560993-KF561094。
1.3.2 生物信息学分析利用VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)去除载体序列后, 使用DOTUR软件在97%相似性水平下对amoA基因序列进行聚类, 得到用于物种分类的操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)[22, 24], 并挑选出每个OTU的代表序列。Chao 1、Shannon和覆盖度指数等均由DOTUR软件给出。
1.4 454高通量测序及生物信息学分析 1.4.1 454高通量测序用于amoA基因的扩增引物同上, 扩增时在引物5'端加入barcode。PCR产物使用1.5%琼脂糖电泳检测, 纯化目的条带。采用试剂盒进行扩增子文库构建, 检测合格后, 使用GS FLX+ Titanium平台进行上机测序。454焦磷酸测序委托上海派森诺生物科技有限公司进行。测序得到的amoA序列在Sequence Read Archive(SRA)数据库中的登录号为SRP073073。
1.4.2 生物信息学分析使用Quantitative Insights into Microbial Ecology(QIIME)(version 1.9.0)对原始下机序列进行筛选, 将含有引物错配、模糊碱基、碱基质量分数低于20及长度较短的序列等予以删除, 得到高质量序列, 用于后续的生物信息学分析。使用Uparse软件在97%序列相似性水平上对amoA基因序列进行聚类, 得到用于物种分类的OTUs, 并从每个OTU中挑选出一条序列作为该OTU的代表序列。利用QIIME软件分析样品的多样性情况, 包括Chao 1、Shannon和覆盖度等指数, 并绘制稀释曲线。
1.5 illumina测序及生物信息学分析 1.5.1 illumina测序用于amoA基因的扩增引物同上, 扩增时在引物5′端加入barcode。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 纯化目的条带。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit进行扩增子文库构建, 文库检测合格后, 使用Hiseq2500 PE250平台进行上机测序。由于Hiseq PE250测序平台所得序列有效长度通常在400 bp以内[25], 而amoA基因序列较长(~491 bp), 因此本研究仅对amoA基因5′端进行illumina测序, 并将该测序过程定义为illumina单端测序。amoA基因illumina单端测序委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行, 测序得到的amoA序列在SRA上的登录号为SRP073074。
1.5.2 生物信息学分析将原始下机序列删除引物和barcode序列后, 使用QIIME对其进行筛选, 将含有模糊碱基、碱基质量分数低于20的序列等予以删除, 得到高质量序列, 用于后续的生物信息学分析。使用Uparse软件在97%序列相似性水平上对amoA基因序列进行聚类, 得到用于物种分类的OTUs, 并从每个OTU中挑选出一条序列作为该OTU的代表序列。利用QIIME软件分析样品的多样性情况, 包括Chao 1、Shannon和覆盖度等指数, 并绘制稀释曲线。
2 结果和分析 2.1 amoA基因的扩增amoA基因用引物amoA-1F、amoA-2R扩增后电泳结果如图 2所示。由图 2可以看出, 扩增产物长度在500 bp左右, 在amoA基因长度范围内, 说明amoA基因扩增成功。
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| 图 2 amoA基因扩增结果 Fig. 2 PCR amplification results of amoA gene |
采用克隆文库技术、454高通量测序技术和illumina单端测序技术对AOB菌群多样性进行比较研究, 结果如表 1。就覆盖度而言, 3种测序技术得到的覆盖度均高于90%, 但2种高通量测序技术得到的覆盖度高于克隆文库技术得到的覆盖度, 因此更能客观地反映样品中氨氧化细菌菌群结构的真实信息。Chao 1指数用来表征微生物群落的丰富度, 由表 1可知, 两种高通量测序技术检测到的OTU个数与Chao 1指数一致, 表明高通量测序技术基本能够覆盖样品中所有的AOB种类; 而克隆文库技术检测到的OTU个数仅为Chao 1指数的二分之一, 说明克隆文库技术获得的AOB种类较实际情况少, 低估了AOB的菌群丰富度。Shannon指数通常用来估算微生物群落的多样性, 由表 1可知, 基于克隆文库技术检测到的Shannon指数为1.91, 基于454高通量测序技术检测到的Shannon指数为2.06, 基于illumina单端测序技术得到的Shannon指数为2.01。从整体趋势来说, 两种高通量测序技术检测到的菌群多样性高于克隆文库技术检测到的菌群多样性。
| OTU数/个 | Chao 1指数 | Shannon指数 | 覆盖度/% | |
| 克隆文库 | 15 | 33 | 1.91 | 91.48 |
| 454高通量测序 | 27 | 27 | 2.06 | 100.00 |
| illumina单端测序 | 24 | 24 | 2.01 | 100.00 |
运用3种测序技术得到的氨氧化细菌菌群稀释曲线如图 3所示。两种高通量测序方法得到的稀释曲线均呈现出逐渐平缓的趋势, 说明数据饱和度较好; 而克隆文库得到的稀释曲线呈现出陡峭的上升趋势, 说明数据饱和度不够, 只有增加测序深度才能较真实地反映氨氧化细菌菌群结构的信息。
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| 图 3 不同测序方法得到的氨氧化细菌菌群稀释曲线 Fig. 3 Rarefaction curves of ammonia-oxidizing bacteria by different sequencing methods |
将OTU代表序列与AOB纯培养菌株序列进行比对分析发现, 在属分类水平上, 克隆文库、454高通量测序和illumina单端测序技术得到的优势类群均为亚硝化螺菌属(Nitrosospira), 详见图 4。尽管3种测序技术获得的优势菌群的具体比例不同, 但都可以反映出菌群中的优势组成情况。
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| 图 4 不同测序方法得到的属分类水平上AOB菌群组成分析 Fig. 4 Community composition of AOB at genus level by different sequencing methods |
将3种测序技术(克隆文库技术、454高通量测序技术和illumina单端测序技术)得到的amoA基因序列合并, 按照97%相似度划分OTU, 采用韦恩图来研究不同测序技术得到的OTUs之间的关系(图 5)。结果表明, 454高通量测序技术所得到的OTUs能完整覆盖克隆文库技术所测得的所有OTUs。454高通量测序技术和illumina单端测序技术各自独有的OTUs分别为8个和5个; 且所有独有OTU的相对丰度均低于1%。因此, 对于AOB而言, 454高通量测序技术能够检测到更多菌群, 尤其是低丰度菌群。
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| 图 5 不同测序方法得到的OTUs分布韦恩图 Fig. 5 Venn graph of OTUs obtained from different sequencing methods |
进一步分析3种测序技术中不同OTU所占比例, 将序列丰度低于1%的OTU定义为others(图 6)。克隆文库技术检测到的菌群优势种是OTU4, 而该物种在454高通量测序结果中丰度相对较低(3.56%), 在illumina单端测序结果中丰度则低于1%。而对于两种高通量测序结果中丰度相对较高的类群, 如OTU6, 并没有在克隆文库结果中发现。这可能由于克隆文库技术测序通量较低, 导致抽样误差较大, 在反映菌群遗传信息量方面较为有限。而对于illumina单端测序来说, 该技术也不能准确反映菌群组成情况, 这一点在OTU水平上表现得尤为显著, 其与454高通量测序得到的菌群组成结果差异较大。
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| 图 6 不同测序方法得到的OTU分类水平上AOB菌群组成分析 Fig. 6 Community composition of AOB at OTU level by different sequencing methods |
1986年Pace等首次将核酸测序技术应用于微生物学分析[26]后, 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、克隆文库等技术逐渐应用到微生物生态学的研究中[27-30]。在上述几种方法中, 克隆文库技术是目前研究微生物群落组成及多样性的主流方法。自然环境中微生物组成极为复杂, 但由于方法的限制, 克隆文库技术对微生物群落结构的了解仍不全面, 尤其是丰度较低的微生物类群。近几年454高通量测序和illumina高通量测序技术开始兴起, 在微生物生态学研究中发挥着越来越重要的作用。与传统的克隆文库技术相比, 高通量测序技术能提供大量遗传信息, 可以检测到环境中的低丰度类群, 有助于对微生物的群落结构进行全面深入研究。
亚硝化单胞菌属是土壤、淡水、废水及生物滤池中的主要类群, 而近岸海洋环境中AOB则以亚硝化螺菌属为主。本研究中的优势菌群是亚硝化螺菌, 与其他研究结果相吻合[31-33]。虽然克隆文库技术和高通量测序技术检测到的优势类群均为亚硝化螺菌, 但在优势类群丰度方面存在差异。与此类似, 龚俊等[34]基于16S rRNA基因对烟叶表面微生物类群的比较分析发现, 克隆文库和高通量测序技术检测到的细菌优势类群相同, 但优势类群的相对丰度存在差异。illumina单端测序技术由于测序长度方面的限制, 可能会导致物种注释错误等, 因此通过该技术得到的群落结构可能与真实群落结构存在偏差。而对于测序片段长度相同的两种技术, 亚硝化螺菌属在克隆文库结果中的丰度较其在454高通量测序结果中的丰度高, 这主要是由于克隆文库和高通量测序技术的测序通量不同导致的。对克隆文库来说, 基于实验成本的考虑, 通常测序的克隆子数目仅为几百个, 远低于高通量技术测序的上万个、甚至十几万个。因此高通量测序结果较克隆文库结果而言, 能更好地反映氨氧化细菌的群落结构。从本文结果看, 克隆文库技术存在高估物种丰度的可能, 这一研究结果与蔡言安等[35]分别采用克隆文库和高通量测序技术对生物滤池内微生物群落结构的研究结果相一致。
在OTU水平上, 克隆文库技术测得的优势种为OTU4(相对丰度为31.07%), 而该物种在454高通量测序结果中仅占3.56%, illumina单端测序结果中该物种所占比例低于1%, 说明克隆文库技术高估了OTU4的相对丰度, 推测与其较低的测序通量有关。同时, 对于两种高通量技术测得的部分物种, 克隆文库技术并没有检测到, 由此也说明克隆文库技术在菌群组成方面的检测能力有限。与此类似, 张玉等[36]以异化型亚硫酸盐还原酶基因(dissimilatory sulfite reductase, dsrB)为目的基因, 运用克隆文库、454和illumina高通量测序技术对沉积物中硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing prokaryotes, SRP)进行研究, 结果表明克隆文库高估了部分SRP类群的相对丰度; 而对于采用454和Illumina高通量测序技术所检测到的部分SRP主要类群, 在克隆文库技术中并未检测到。
对比3种测序技术, 克隆文库技术通过对氨氧化细菌amoA基因片段构建文库, 进而推测复杂环境微生物群落的结构, 技术成熟且操作性好。但该技术在分析群落组成及多样性时测序量较大, 花费较多, 反映的微生物遗传信息量较为有限, 主要以优势菌群为主, 高估物种丰度及低估菌群大小和多样性的可能性较高[37]。高通量测序技术操作简单、通量高、成本低, 得到的序列信息丰富, 在环境微生物的研究中具有一定的优越性, 能比较真实地反映菌群结构及多样性情况。但在实际操作中我们发现, 由于illumina单端测序片段较短, 在菌群组成分析时, 在准确区分各物种间序列差异方面存在不足, 特别在OTU水平上利用amoA序列对AOB群落组成进行分析时表现尤为显著。同时, 由于环境样品组成复杂, 对不同海域的氨氧化细菌、或者相同海域的其他功能菌群来说, 单端测序仍可能存在低估菌群丰富度和多样性、物种注释错误等问题。因此, illumina单端测序对于利用amoA序列进行氨氧化细菌菌群分析是不可取的。综上, 在分析海洋沉积物中氨氧化细菌菌群时, 454高通量测序技术可以更全面和准确的了解其结构特征。
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