2018, Vol. 42
文章信息
- 谭素建, 郇聘, 刘保忠. 2018.
- TAN Su-jian, HUAN Pin, LIU Bao-zhong. 2018.
- 一种酪氨酸酶基因在笠贝初生壳形成中的表达分析
- The expression pattern of a tyrosinase gene potentially involved in early larval shell biogenesis of the limpet Lottia goshimai
- 海洋科学, 42(9): 17-21
- Marina Sciences, 42(9): 17-21.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180312002
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文章历史
- 收稿日期：2018-03-20
- 修回日期：2018-07-31
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266000
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266000, China
贝壳是大多数软体动物的外骨骼, 具有重要的演化意义和经济价值, 其形成和矿化机制等问题一直是研究的热点[1-5]。在软体动物个体发育过程中, 贝壳发育区早在原肠胚阶段就可识别, 而初生贝壳则形成于担轮幼虫早期[6-8]。尚未发生钙化的初生贝壳(Initial non-Calcified Shell, InCaS)是软体动物个体发育过程中的第一个贝壳结构, 也为后续的生物矿化过程(即贝壳的钙化)提供了结构基础[6]。因此, 了解InCaS结构和发生的分子机制不仅对探究软体动物贝壳的演化过程有重要意义[2, 9-11], 而且也有助于生物矿化机制的研究。然而, 迄今为止人们对InCaS生物发生机制的认识甚少。
已有研究表明, 酪氨酸酶在成体贝壳角质层形成过程中发挥了重要作用, 而InCaS与成体贝壳的角质层成分类似, 很可能依赖相同的发生机制[9, 12, 13]。因此, 研究酪氨酸酶基因在InCas发生过程中的表达模式和功能十分重要。此前对长牡蛎(Crassostrea gigas)幼虫的研究发现, 一种酪氨酸酶基因cgi-tyr1特异性表达在早期幼虫的贝壳区域, 与InCaS的形成呈现显著的时空相关性, 提示其参与了InCaS的生物合成[13]。长牡蛎中的相关研究提供了第一个软体动物InCaS的形成涉及酪氨酸酶的证据。然而酪氨酸酶是否参与了不同类群软体动物的贝壳形成过程, 以及其表达模式如何仍有必要进行研究。
本文以腹足纲软体动物笠贝(Lottia goshimai)为对象, 鉴定了一个笠贝酪氨酸酶基因lgo-tyr1, 并初步研究了该基因在担轮幼虫时期的表达模式, 现报道如下。
1 材料与方法 1.1 实验动物与幼虫培养性成熟的笠贝(L. goshimai)采集自青岛沿海, 采回后待其自然产卵和排精。将卵细胞和精子在海水中混合受精, 受精卵在25℃海水中发育。取受精后10 h的担轮幼虫(trochophore)样品, 经4%多聚甲醛固定后梯度甲醇脱水, –20℃保存备用。
1.2 笠贝tyrosinase基因的克隆利用长牡蛎cgi-tyr1序列, 在笠贝幼虫转录组数据库中比对得到一条同源序列。依据该序列设计引物lgo-tyr1-F1(ATTTATACATCTACTTATCTGTCCT)和lgo-tyr1-R1(ATTGCTCTCTTGTTAATAAGAACAAT), 从笠贝幼虫cDNA中成功获得了笠贝的酪氨酸酶同源基因的全长cDNA序列, 命名为lgo-tyr1。
1.3 序列特征和聚类分析对lgo-tyr1编码的氨基酸序列的特征进行了生物信息学分析, 利用Expasy网站提供的工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测了分子量和等电点, 利用SignalP网站工具预测了信号肽序列(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 利用NCBI的CDD数据库检索了lgo-tyr1中的保守结构域情况(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。利用软件MEGA 6.0对lgotyr1编码蛋白序列及其他种属动物的酪氨酸酶同源序列进行了比较, 并以Neighbor-Joining法构建演化树。
1.4 整装原位杂交利用5′-含有T7启动子序列(taatacgactcactataggg)的lgo-tyr1-F2(GAAGCAGGATACAACGATGACT)和lgo-tyr1-R2(TCCGGTATGAAGAGGTAGGTTA)扩增笠贝的部分cDNA序列作为探针模板。使用地高辛标记的NTP混合物(Roche)和T7 RNA聚合酶(Fermentas)合成地高辛标记的RNA探针。在担轮幼虫中进行整装原位杂交以研究lgo-tyr1的表达模式。整装原位杂交的过程按照Thisse报道的方法[14]进行。
1.5 扫描电子显微镜观察收集10 hpf的担轮幼虫, 在2.5%戊二醛中4℃固定过夜。然后将幼虫在乙醇中梯度脱水, 并过渡至乙酸异戊酯。样品经干燥、喷金后, 使用Hitachi S-3400N扫描电子显微镜进行观察。
2 结果 2.1 Lgo-tyr1基因扩增得到的lgo-tyr1基因cDNA全长2603bp, 包括33bp的5′UTR, 2430bp的编码序列(ORF)以及139bp的3′UTR, 编码一个含809个氨基酸的前体蛋白, 其相对分子质量为90.27 ku, 理论等电点7.63。其中第1~19个氨基酸被预测为信号肽序列(Signal peptide, SP), 保证新生蛋白进入内质网-高尔基体以接受必要的翻译后修饰。蛋白序列分析显示Lgo-TYR1具有典型的酪氨酸酶特征, 包括两个铜离子结合结构域和它们内部的六个保守组氨酸残基(图 1a和图 1b)。对已知的酪氨酸酶结构分析表明[15], 这两个铜离子结合结构域构成了Lgo-TYR1催化活性中心。整个分子的结构见图 1。
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| 图 1 Lgo-TYR1示意图以及保守结构域 Fig. 1 A scheme of Lgo-TYR1 and multiple alignment of the two copper-binding domains 注: (a)Lgo-TYR1的结构示意图。信号肽位于N末端, 酪氨酸酶功能区段包含两个铜离子结合结构域(CuA和CuB), 组成催化活性中心。(b) Lgo-tyr1和部分软体动物酪氨酸酶基因之间两个铜离子结合结构域的多重比对。星号表示六个保守的组氨酸残基 (a) Signal peptide is located at the N terminal. Two copper-binding domains (CuA and CuB) comprised of the catalytic center. (b) Multiple alignment of the two copper-binding domains between lgo-tyr1 and tyrosinase genes of other mollusks. The six conserved histidine residues are indicated by asterisks |
基于lgo-tyr1所编码的氨基酸序列及其他物种的同源序列, 构建了系统演化树(图 2)。从图 2可以看出: lgo-tyr1首先和其他三种头足纲软体动物的酪氨酸酶基因聚为一支, 再与双壳纲软体动物的酪氨酸酶基因形成软体动物分支; 人(Homo sapiens)、鸡(Gallus gallus)、斑马鱼(Danio rerio)等的酪氨酸酶基因形成脊椎动物分支, 线虫(Caenorhabditis elegans)则单独占据一个分支。
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| 图 2 Lgo-tyr1的聚类分析, 节点处的数值表示1000次重复抽样所得的自举(bootstrap)值 Fig. 2 A phylogenetic tree of tyr-homologs. The bootstrap values were calculated from 1000 replicates |
目前已报道了软体动物的多个酪氨酸酶, 包括可能参与合浦珠母贝(Pinctada fucata)成体贝壳角质层形成的酪氨酸pf-per-tyr以及可能特异性地参与幼虫贝壳早期发育的cgi-tyr1[12-13]。作者的分析结果表明: lgo-tyr1与pf-per-tyr并非直系同源, 相较于pf- per-tyr, lgo-tyr1与cgi-tyr1的系统发生关系更近。
2.3 Lgo-tyr1在笠贝早期发育中的表达分析笠贝(L. goshimai)的受精卵呈现出典型的软体动物胚胎发育模式[6, 16], 在担轮幼虫阶段(10 hpf)已经可以观察到InCas的形成。笔者用整装原位杂交方法研究了lgo-tyr1在该时期担轮幼虫中的表达情况(图 3)。lgo-tyr1 mRNA在担轮幼虫背侧的圆形贝壳区检测到, 信号呈现出中心圆形的弥散状和与中心紧邻的环状细胞带中的斑状(图 3a)。SEM观察证实圆形褶皱的InCaS已经出现在该时期担轮幼虫的背部(图 3b), 因此可以基本确认lgo-tyr1除了在圆形贝壳区域的表达外, 在贝壳区紧邻的环状细胞带中也有表达。
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| 图 3 笠贝担轮幼虫(10 hpf)背侧视图 Fig. 3 Dorsal view of the L. goshimai trochophore (10 hpf) 注: (a)在担轮幼虫背侧, lgo-tyr1表达于圆形贝壳区以及紧邻的环状细胞带(星号)中; (b) SEM观察显示在同一区域存在褶皱的圆形初生贝壳。SF:贝壳发育区, 标尺=50 μm (a) The expression of lgo-tyr1 was restricted in the circular-shaped shell field and cells lying adjacent to shell field (asterisks) on the dorsal side of trochophore; (b) SEM observation revealed that there was a plicated circular-shaped initial shell covering the same region. White dotted lines indicated the circular shell field (SF) and cells lying adjacent to shell field. Bar = 50 μm |
本文从笠贝幼虫cDNA中克隆到了一个酪氨酸酶基因lgo-tyr1, 其序列具有酪氨酸酶家族的诸多特征, 如信号肽序列和两个保守的铜离子结合结构域。值得关注的是, 两个铜离子结合功能域中的6个保守的组氨酸残基在头足纲、双壳纲以及腹足纲的笠贝中毫无变化, 说明这些残基在软体动物演化过程中承受了巨大的选择压力, 其突变可能对其发育过程造成较大影响。
聚类分析表明:各物种的酪氨酸酶基因依其种属来源聚在一起, 说明从整体序列上来看, 不同的种类间具有一定的差异。在软体动物这一分支中可以看到:长牡蛎的cgi-tyr1并未与同属双壳纲的珠母贝(Pinctada margaritifera)和合浦珠母贝(P. fucata)的酪氨酸酶基因聚为一支, 反而与腹足纲的lgo-tyr1演化关系更近。这表明, 已知的双壳贝类酪氨酸酶基因并非是直系同源关系(Ortholog), 而属旁系同源(Paralog), 在演化上属于不同的分支(Clade)。我们克隆的lgo-tyr1与长牡蛎的cgi-tyr1属于直系同源基因, 因此在演化树上聚为一支。考虑到pf-per-tyr在成贝的贝壳角质层形成中起作用, 而cgi-tyr1则可能特异性地参与幼虫贝壳早期发育(类似的, lgo-tyr1可能也是如此)[12, 13], 这一结果提示:软体动物可能同时具备多种酪氨酸酶基因, 且在贝壳形成的不同发育阶段有不同的酪氨酸酶起作用, 这与笔者之前的发现类似[13]。
利用整装原位杂交的方法研究了lgo-tyr1在担轮幼虫中的表达情况, 其结果对于研究lgo-tyr1在InCas形成中的作用具有启示意义。在担轮幼虫中, lgo-tyr1 mRNA在圆形贝壳区被检测到, 与在长牡蛎中的观察一致[13], 这一结果表明lgo-tyr1是涉及InCaS生物合成的基因。结合SEM的观察结果, 本文发现lgo-tyr1除在圆形壳区中表达, 在与InCas紧邻的环状细胞带中可能也有表达(图 3)。这提示贝壳形成时贝壳发育区不同区域的细胞执行不同的功能, 幼虫贝壳的形成是一个复杂的过程。
基于目前的研究报道, 各类群软体动物(除头足类与多板纲动物外)的早期贝壳发育模式十分相似。欧洲帽贝(Patella vulgate)中幼虫贝壳外缘的环状分布细胞为幼虫外套膜外缘, 参与早期贝壳的形成[16]。我们推测, 笠贝lgo-tyr1表达区域外缘环形分布的细胞即为欧洲帽贝研究中涉及的幼虫外套膜细胞(或其一部分)。在欧洲帽贝中, 调控基因engrailed和bmp2/4表达于幼虫外套膜外缘细胞中, 参与贝壳的形成以及InCas边界的确立[16]。考虑到engrailed、bmp2/4与lgo-tyr1的表达区域相邻或部分重合, 而这两个调控基因在InCas尚未出现时就已被激活[16, 17], 笔者推测lgo-tyr1的表达可能受到engrailed和bmp2/4的调控。这些基因间的互相调控关系问题值得进一步研究。
综上所述, 笠贝在担轮幼虫期形成InCas, 以此为基础借助外套膜细胞作用逐渐矿化、生长形成成体贝壳, lgo-tyr1作为重要的角质层形成因子可能涉及其中。正如绝大多数发育事件一样, 当中必然还涉及到其他调控分子与lgo-tyr1协同作用, 这些调控分子是下一步研究中的重要对象。
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