2018, Vol. 42
文章信息
- 蒋南芳, 李炳玺, 李伟达, 刘效磊, 王晓倩, 常新涛, 綦慧敏. 2018.
- JIANG Nan-fang, LI Bing-xi, LI Wei-da, LIU Xiao-lei, WANG Xiao-qian, CHANG Xin-tao, QI Hui-min. 2018.
- 不同磷酸根含量的孔石莼多糖体外抗氧化活性研究
- Antioxidant activity of different phosphate content derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa in vitro
- 海洋科学, 42(9): 22-28
- Marina Sciences, 42(9): 22-28.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180720001
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文章历史
- 收稿日期：2018-07-20
- 修回日期：2018-09-20
2. 潍坊学院, 山东 潍坊 261061;
3. 中共莱芜市委市直机关工作委员会, 山东 莱芜 271100
2. Weifang University, Weifang 261061, China;
3. work committee for offices directly under the CPC Laiwu municipal committee, Laiwu 271100, China
孔石莼(Ulva pertusa)属绿藻门(Chlorophyta)石莼科(Ulvaceae)石莼属(Ulva), 是一种大型绿藻, 在我国, 广泛分布于辽宁, 江苏, 山东等沿海地区。孔石莼具有降低胆固醇、解暑、利水减压等功效, 作为一种中药在中国已有悠久的使用历史[1]。
多糖的活性受其结构影响十分显著, 因此, 研究者们通常采取一定的方法对多糖结构进行修饰来改变其生物活性, 降低毒副作用。修饰方法主要分为化学修饰、生物修饰以及物理修饰。其中以化学修饰为主, 到目前来看, 常用的多糖结构化学修饰方法包括硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、羧甲基化等。据文献记载, 姬松茸多糖经过磷酸化修饰后, 免疫调节作用, 抑菌作用都明显提高[2]。磷酸化修饰后的竹荪子多糖除体外抗氧化活性提高外, 抗肿瘤作用也显著提高[3]。
随着对孔石莼研究的不断深入, 对孔石莼多糖的研究也进一步深化。目前, 孔石莼多糖的衍生化主要有硫酸化、烟酰化、磺化等, 通过研究发现, 经化学修饰后的孔石莼多糖均不同程度提高了体外抗氧化活性[4]。目前, 国内外孔石莼多糖磷酸化相关方面研究暂未发现, 本实验, 将混合磷酸盐与孔石莼多糖进行磷酸化反应, 对磷酸化孔石莼多糖的制备工艺进行初步研究, 并比较化学结构修饰前后其体外抗氧化活性的变化。
1 材料与试剂 1.1 材料孔石莼, 采自于山东省青岛市, 孔石莼粗多糖, 由本实验室提取。
1.2 试剂多聚磷酸钠(STPP)、三偏磷酸钠(STMP), 还原辅酶Ⅰ(NADPH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、硝基四氮唑蓝(NBT)、菲咯嗪、番红花T、Tris等试剂均为市售分析纯。
1.3 仪器DE-101B集热式磁力搅拌器(常州中捷实验仪器制造有限公司)、旋转蒸发器RE52-86A(上海亚荣生化仪器厂)、电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、AR153CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)、UV 8000A型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)、PHS-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、美国Agilent DD2-500核磁共振波谱仪(500MHz)、Vario Macro Cube元素分析仪(德国元素分析系统公司)、傅里叶红外光谱仪(赛默飞世尔科技中国有限公司)、冷冻干燥机FD-1D-50(进口北京博医康实验仪器有限公司)。
2 实验方法 2.1 孔石莼多糖U的制备称取孔石莼干燥藻体100 g, 剪碎, 按料液比1:40加入蒸馏水, 采用水提醇沉方法提取粗多糖, 抽滤除去乙醇, 无水乙醇脱水2次, 抽滤, 干燥得孔石莼粗多糖[5]。
2.2 不同磷酸根含量的孔石莼多糖PU的制备称取一定量的磷酸化试剂(STPP: STMP为6:1)溶于100 mL蒸馏水中, 加入5 g无水硫酸钠后加入1 g孔石莼多糖超声使其溶解充分, 调节pH, 在不同温度(60~100℃)下各反应一定时间。待反应完成后冷却至室温, 加入4000 mL的95%乙醇静置24 h, 除去液体将沉淀干燥后加入100 mL蒸馏水于60℃水浴复溶, 采用3500 Da透析袋分别在自来水和蒸馏水中透析48 h。将透析液浓缩预冻后再进行冷冻干燥得磷酸化孔石莼多糖PU[6-9]。通过控制磷酸化试剂的用量, 反应时间, 反应温度以及反应pH来制备得到了六种不同取代度的PU。
2.3 磷酸根的含量测定采用元素分析仪对原料U及六种磷酸化孔石莼多糖PU进行磷元素含量测定。
2.4 红外光谱解析分别将适量U和磷酸根含量最高的PU6, 用KBr混合压片法在4000 cm-1~400 cm-1范围内进行红外扫描。
2.5 体外抗氧化活性实验根据磷元素分析测定的结果, 将6个不同磷酸根含量的PU与原料多糖U进行体外抗氧化活性研究, PU1至PU6的磷酸根含量由低到高。
2.5.1 对羟自由基清除能力的测定干净试管中加入1.0 mL 150 mmol/L, pH=7.4的磷酸钠盐缓冲液, 1 mL 360 μg/mL的番红花溶液, 0.5 mL 2 mmol/L EDTA-Fe溶液然后加入不同浓度的多糖溶液1.0 mL, 最后加入3% H2O2 1 mL, 充分振荡摇匀置于37℃水浴中反应30 min, 在520 nm处测定各试管溶液吸光度。对照组和空白组中的多糖溶液均用蒸馏水替代。对照组中磷酸缓冲溶液用H2O2替代[10]。
由PMS-NADH系统产生超氧阴离子, 并通过硝基四氮唑蓝(NBT)还原法测定。以16 mmol/L, pH 8.0 Tris-HCl缓冲液为溶剂, 0.5 mL 338 μmol/L NADH, 0.5 mL 72 μmol/L NBT, 0.5 mL 30 μmol/L PMS, 摇匀, 加入1.5 mL不同浓度的多糖溶液。静置5 min。采用紫外可见分光光度计于560 nm波长下测吸光度值。在空白对照中, 用Tris–HCl缓冲液替换NADH[11]。
根据参考文献[12], 竹叶多糖的方法测定本实验中多糖对Fe2+的螯合活性。将3.5 mL不同浓度多糖溶液在室温下与FeCl2(2 mmol/L, 0.1 mL)和菲咯嗪(5 mmol/L, 0.4 mL)反应10 min, 然后在紫外可见分光光度计中于562 nm测量吸光度。空白组中多糖溶液用蒸馏水取代。将EDTA配制成浓度梯度相同的溶液, 按相同方法测定其螯合能力, 螯合率公式计算。
本实验用平均数±标准差来表示数据。
3 结果与讨论 3.1 磷元素分析测定结果通过表 1数据显示可知, 磷酸化反应前后多糖中的磷元素含量有极大的差别, 反应制得的磷酸化孔石莼多糖磷含量显著增高。原料中磷含量极低约0.26%, PU6中的磷含量最高约为10.47%, 与原料相比较提高了近40倍。
| 编号 | 磷含量/% | 产率/% |
| U | 0.26 | |
| PU1 | 1.15 | 57.31±1.28 |
| PU2 | 4.42 | 57.83±2.57 |
| PU3 | 5.47 | 66.12±3.44 |
| PU4 | 6.45 | 54.0±2.16 |
| PU5 | 9.42 | 75.0±4.17 |
| PU6 | 10.47 | 75.8±3.79 |
图 1为孔石莼多糖U和磷酸根含量最高的孔石莼多糖PU6的红外光谱图。3414.37 cm-1是O–H吸收峰, 2940.43 cm-1是C–H伸缩振动, 1643.52 cm-1是上糖醛酸中C=O伸缩振动吸收峰, 1254.92 cm-1和846.36 cm-1是硫酸基的特征信号, 将U和PU6比较可发现, 孔石莼多糖在磷酸化修饰后在峰强度, 峰面积以及峰宽等方面与修饰前无明显差异。修饰后的磷酸化孔石莼多糖3400.57 cm-1是O–H吸收峰, 2941.17 cm-1和1390 cm-1是C–H伸缩振动, 1647.47 cm-1是糖醛酸中C=O伸缩振动吸收峰, 1227.97 cm-1和851.03 cm-1是硫酸基的特征峰, 说明经过磷酸化反应后的产物结构没有被破坏, 其基本性质未改变[13, 14]。除去两样品均有的特征峰外, 磷酸化孔石莼多糖PU6在1132.11 cm-1和998.60 cm-1处出现新的特征峰, 1132.11cm-1为引入磷酸盐中的P=O特征峰, 998.6 cm-1为P–O–C的特征峰, 表明磷酸化孔石莼多糖制备成功。
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| 图 1 U和PU6红外光谱 Fig. 1 Infrared spectrum of U and PU6 |
羟基是的很活泼的自由基, 可以在铜离子或铁离子的存在下由超氧阴离子和H2O2形成, 并且可以在体内启动细胞损伤。羟基可以以多种方式产生, 其中最重要的机制就是芬顿反应。有关文献报道, 经磷酸化修饰后的红芪多糖对羟自由基的清除能力有所提高, 在6.0 g/L时, 清除能力为37.5%。而红芪多糖在相同浓度下对羟自由基的清除能力仅为14.3%[15]。肖丽丽等[16]研究发现牡丹籽多糖经过磷酸化反应, 在5.0 g/L时, 其羟自由基清除率最高可达92.61%。与硫酸化, 氨基酸修饰以及羧甲基化修饰相比较, 磷酸化修饰后的牡丹籽多糖表现出最强的羟自由基清除作用。与磷酸化修饰后的红芪多糖和牡丹籽多糖相比较, PU6对羟自由基清除能力明显较强。根据图 2可知, 不同磷酸根含量的孔石莼多糖衍生物均具有较好的羟自由基清除能力, 并且清除能力均强于原料多糖和维生素C。在本实验设定的0.7~3.5 g/L浓度范围内, 随着浓度的升高, 产物羟自由基清除作用逐渐增大, 最后趋向稳定。磷酸化孔石多糖衍生物的清除能力同时也伴随着磷酸根含量的增高而增强。在此浓度范围内, 维生素C、U、PU1、PU2、PU3的清除能力较弱。PU4、PU5对羟自由基的清除能力较为接近。磷酸根含量最高的PU6清除能力最强, 当浓度为3.5 g/L时, 清除率为92.60%。这些结果表明, 磷酸化孔石莼多糖分子结构中的磷酸根, 可能对清除能力起着重要作用。
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| 图 2 U与不同磷酸根含量的PU的·OH清除作用 Fig. 2 ·OH scavenging effect of U and PU |
由氧原子接受了一个电子而形成的超氧阴离子是初代自由基, 经线粒体电子转移系统可以形成羟自由基、单线氧和过氧化氢, 从而损伤蛋白质、DNA、酶等。有报道证明, 超氧化物阴离子直接引发脂质氧化, 这是由于过氧化物和过氧化氢作为单一氧和羟基自由基的前体。在PMS-NADH-NBT体系中, 通过偶联反应从溶解氧产生的超氧阴离子减少了NBT[17]。红景天多糖具有保肝作用, 与其体外抗氧化活性有着密切联系。红景天多糖对超氧阴离子具有一定的清除能力, 但相对于维生素C较弱[18]。碱性条件下的连苯三酚能迅速发生自氧化, 并释放出超氧阴离子自由基。当添加清除剂来清除超氧阴离子自由基时, 连苯三酚的氧化速率会降低。磷酸化葡聚糖能有效清除超氧阴离子, 其EC50值约1.4 g/L[19]。根据图 3可知, 相同浓度下孔石莼多糖U, 磷酸化孔石莼多糖衍生物PU以及VC的O2–清除作用强弱顺序为U > PU > VC, 且U、PU的清除能力明显强于VC。在0.01~0.15 g/L范围内, 清除作用先伴随浓度增大逐渐增强, 然后趋于稳定。在PU1到PU6中, 总体呈现出伴随磷酸根含量增高, 超氧阴离子清除作用越强的现象。据报道[20], 多糖保护超氧阴离子的机制与OH键的解离能有关, 即附着在多糖上的吸电子基团越多, OH键的离解能越弱。当PU6达到0.15 g/L时, 其清除超氧阴离子的能力与孔石莼多糖的清除能力不存在显著性差异。在此实验中, PU显示出比U弱的清除活性。超氧化物是一种相对较弱的氧化剂, 分解形成更强的反应性氧化物种, 如单线态氧和羟基自由基, 从而引发脂质的过氧化反应[21]。磷酸基团的存在可能改变化合物的极性, 这对抗氧化能力有影响[22]。
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| 图 3 U与不同磷酸根含量的PU的O2–清除作用 Fig. 3 Superoxide anion scavenging of U and PU |
有研究报道, 抗氧化剂的金属螯合能力是指其能够降低脂质过氧化反应中催化过渡态金属离子的水平, 金属螯合剂能够和金属之间形成σ–键, 降低氧化还原电位、稳定过渡态离子。若化合物中包括(–OH, –SH, –COOH, –PO3H2, C=O, –NR2, –S–和–O–)其中两种或更多的基团可以表现出更强的金属螯合能力[23]。Thambiraj等[24]在研究过程中发现, 黄豆多糖的抗氧化活性与其单糖组成有着密切关系, 黄豆多糖的铁螯合活性与其半乳糖和甘露糖的含量相关, 含量越高螯合能力越强。根据图 4可知, EDTA-2Na的金属螯合力明显强于U和PU, 孔石莼多糖本身的鳌合力极弱经过磷酸化修饰后得到了极大的提高。并且磷酸化孔石莼多糖螯合力都伴随浓度的提高先增大再稳定。当浓度低于100 μg/mL时, 多糖的螯合能力与磷酸根含量呈现出明显的依赖性, 在此浓度范围内PU6表现出最强的螯合能力。当浓度高于250 μg/mL时, PU5的螯合能力最强, 可达到93.61%, 并伴随浓度的增高逐渐稳定。PU的金属螯合能力明显强于U, PU中的磷酸基团取代了多糖结构中的部分羟基, 表明磷酸基团的螯合能力可能比羟基更好[20, 25]。根据多次实验结果推测当磷酸根含量高达一定程度时, 伴随浓度增高可能对其金属螯合能力有一定的抑制现象, 具体原因需进一步进行研究分析。
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| 图 4 U与不同磷酸根含量的PU的金属螯合能力 Fig. 4 Metal Bonding Capabilities of U and PU |
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