2019, Vol. 43
文章信息
- 李超, 李妍, 李祥乾, 史大永. 2019.
- LI Chao, LI Yan, LI Xiang-qian, SHI Da-yong. 2019.
- 海洋溴酚衍生物LXQ-5的PTP1B的结合作用和体内降糖活性研究
- Study of PTP1B-binding activity and in vivo hypoglycemic effect of marine bromophenol derivative LXQ-5
- 海洋科学, 43(1): 61-66
- Marina Sciences, 43(1): 61-66.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190313002
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文章历史
- 收稿日期：2018-10-26
- 修回日期：2018-11-25
2. 海洋药物与生物制品功能实验室, 青岛海洋科学与技术国家实验室, 山东 青岛 266235;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266235, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
二型糖尿病(T2DM)是一种危害性极大的代谢综合征, 其主要是由于胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗所导致, 主要特征包括高血糖和高胰岛素血症[1]。据国际糖尿病联盟所统计, 2017年全球糖尿病患者已经达到4.25亿人, 其中T2DM的患者占糖尿病总病例的90%以上。更严重的是, 预计到2045年, 全球的糖尿病患者将达到6.29亿[2]。全球医疗支出的12%(7270亿美元)被用于糖尿病治疗的相关领域。面对日益严峻的患病形势, 二型糖尿病治疗领域的突破将刻不容缓。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是一种在胰岛素靶向组织中广泛表达的蛋白。已有很多研究表明PTP1B是新型的T2DM潜在的治疗靶点, 它能够使胰岛素信号通路中关键的磷酸化蛋白如胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物(IRS)去磷酸化, 从而使胰岛素信号转导受阻[3-5]。此外, 早期细胞培养研究报道, PTP1B的过表达会抑制IR和IRS的磷酸化, 导致胰岛素抵抗的发生[6, 7]; 在PTP1B基因敲除小鼠中观察到糖代谢相关的组织如肝脏和肌肉中IR的酪氨酸磷酸化水平显著提高, 且PTP1B缺陷型小鼠表现出增强的胰岛素敏感性[8-10]。因此, PTP1B作为胰岛素信号通路的负调控蛋白, 已经被广泛认为是一种新型的T2DM的药物治疗靶点。
因为具有特殊的化学结构和多样的生物活性, 海洋来源的化合物日益受到人们的关注[11]。溴酚衍生物LXQ-5是海洋天然产物BDDPM的结构修饰衍生物(结构式如图 1所示), 体外酶学实验表明LXQ-5具有优秀的PTP1B抑制活性, 其抑制作用的IC50值为4.27 mol/L±0.2 μmol/L[12]。本文利用酶动力学实验和分子互作技术探索了LXQ-5的抑制作用类型和与PTP1B体外结合的特点, 然后通过动物实验研究了LXQ-5在二型糖尿病小鼠体内的降血糖活性, 为海洋溴酚衍生物作为新型降糖药物的开发提供了一定的理论基础。
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| 图 1 化合物BDDPM和LXQ-5分子结构式 Fig. 1 Chemical structure of BDDPM and LXQ-5 |
化合物LXQ-5由本实验室合成; 4-硝基苯膦酸二钠(pNPP, Solarbio); PTP1B(Protenintech); 二甲基亚砜(DMSO, Solarbio); Tris(Solarbio); 二甲双胍(Sigma); 羧甲基纤维素钠CMC-Na(青岛秀佰锐生物器材有限公司); N-ethyl-N0(dimethylaminopropyl)- carbodiimide (EDC)、N-hydroxysuccinimide(NHS)和乙醇胺均购自于GE公司; 糖化血红蛋白和糖化血清蛋白检测试剂盒购于南京建成生物公司。
1.2 仪器ELx800酶标仪(Bio Tek); Biacore T200 SPR分子互作仪、CM5分子互作芯片(GE); 快速血糖检测仪及配套血糖检测试纸(美国强生); 低温高速离心机(Eppendof); 电子天平购于常熟市天量仪器有限责任公司。
1.3 动物自发性二型糖尿病BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J (简称BKS db)和野生型C57BLKS/J(简称BKS)雄性小鼠购于南京大学动物模型研究中心(MARC), 周龄为6~7周。
2 方法 2.1 LXQ-5的PTP1B抑制作用类型的研究分别称量1.315、2.630、5.260、10.520以及21.040 mg的pNPP粉末溶于1 mL的Tris-Hcl缓冲液中, 配制成浓度分别为5、10、20、40和80 mmol/L的pNPP溶液作为10倍的储液。然后用DMSO溶解化合物LXQ-5, 并稀释成浓度梯度为800、400、200和100 μmol/L的溶液备用。反应在以96孔板中进行, 每100 μL体系含有88 μL浓度为10 mmol/L的Tris-Hcl缓冲液、10 μL各浓度的pNPP和1 μL各浓度的LXQ-5溶液, 然后加入1 μL PTP1B(60 nmol/L)启动反应, 用酶标仪检测起始的OD405作为反应的起点。反应体系于37℃下孵育10 min, 再一次检测OD405值作为反应终点。最后计算反应速率, 并绘制双倒数图。
2.2 LXQ-5与PTP1B的结合动力学实验使用Biacore T200 SPR光谱仪(GE Healthcare Sciences)来进行化合物LXQ-5与PTP1B的体外结合动力学实验。将PTP1B(终浓度为50 μg/mL)溶于10 mmol/L的乙酸钠缓冲液(pH 4.56)中。然后用氨基偶联的方法将PTP1B固定在CM5分子互作芯片上, 使用等体积比的0.2 mol/L的N-ethyl-N0(dimethylaminopropyl)- carbodiimide (EDC)和0.05 mol/L的N-hydroxysucci nimide (NHS)混合液, 以10 μL/min的流速流经CM5芯片以活化芯片表面的羧基, 然后注入PTP1B使其N末端氨基与芯片表面的羧基发生酯化反应而偶联到芯片上[13]。然后用1 mol/L的乙醇胺溶液(pH 8.5)将芯片上过量的活性酯封闭。偶联完成后, 开始化合物LXQ-5的一系列浓度的进样检测, 得到不同浓度的LXQ-5与PTP1B结合互作的响应值RU。
2.3 LXQ-5小鼠体内降糖研究动物实验选用雄性的自发性二型糖尿病BKS.Cg- Dock7m+/+Leprdb/J(BKS db)小鼠为模型, 以健康的雄性C57BLKS/J(BKS)小鼠为对照, 对LXQ-5的小鼠体内降糖活性进行研究。经过1周时间适应环境后, 使用快速血糖仪和血糖试纸, 采用尾静脉取血的方式测量小鼠的空腹血糖水平, 以确保BKS db小鼠符合实验要求(空腹血糖值大于11.0 mmol/L)。符合标准的糖尿病小鼠随机分为3组, 分别是模型组(BKS db)、阳性对照组(Met)、LXQ-5化合物给药组(LXQ-5), 每组8只。另选8只健康的BKS小鼠为空白对照, 本实验小鼠一共分成4组。正常组(BKS)和BKS db组服用0.5% CMC-Na溶液; Met组服用二甲双胍(80 mg/kg), LXQ-5组服用化合物LXQ-5(80 mg/kg)。实验采用灌胃的口服给药方式, 灌胃体积为10 mL/kg。给药时间一共为5周, 每周需要进行1次空腹血糖(FBG)的测定, FBG测试前一天晚上需对小鼠禁食处理, 12 h后再进行血糖检测。同样, 采用尾静脉取血的方式, 用血糖仪和试纸测试各组小鼠空腹血糖值。
2.4 血糖相关指标的测定血清中糖化血红蛋白(GHb)和糖化血清蛋白(GSP)是衡量血糖状况两个重要的参数, 尤其是GHb, 其含量的测量仍然是评估二型糖尿病患者血糖控制的“黄金标准”[14]。各组小鼠给药5周后, 禁食8 h后, 用摘眼球取血方法收集小鼠全血, 血液收集到抗凝管中。取血完成后, 将血液于离心机1 000 g, 20 min离心以分离得到血清样品。最后用GHb和GSP检测试剂盒测定血清中糖化血红蛋白和糖化血清蛋白的含量。
2.5 统计学分析使用GraphPad Prism 7.00软件进行数据的分析处理, 所有数据均以x±s的形式表示。各组间的差异通过t检验分析得到且P < 0.05表示具有显著性的统计学意义。
3 结果 3.1 LXQ-5的抑制剂类型的确定通过酶动力学实验检测了浓度分别为0, 1, 2, 4, 8 μmol/L的LXQ-5对不同浓度底物pNPP的催化能力。通过反应速率和底物浓度双倒数作图法得到Lineweaver-Burk方程。如图 2所示, 双倒数作图法得到的所有直线都相交于X轴上(交点横坐标为–1/Km), 随着LXQ-5浓度的增大, Km的数值保持不变, 而Vmax逐渐降低。因此, LXQ-5是PTP1B的一种非竞争性抑制剂。
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| 图 2 LXQ-5抑制剂类型的确定 Fig. 2 Determination of inhibitory mode of LXQ-5 |
采用Biacore分子互作技术检测了LXQ-5与PTP1B在体外特异性结合作用的强弱和结合特点。通过Biacore T200分析软件, 模拟得到LXQ-5与PTP1B的1︰1结合模型, 如图 3所示, 它们之间特异性结合的具体参数如表 1所示。图 3显示LXQ-5与PTP1B的结合和解离过程符合稳定结合、缓慢解离的特点, LXQ-5具有较长的滞靶时间。表 1显示, LXQ-5与PTP1B结合作用的亲和力常数(KD)为4.28×10–6/(mol/L)。表 1显示LXQ-5与PTP1B在体外结合的结合常数ka值为3.50×106/[mol/(L·s)], 解离常数kd值为0.01 s–1。分子互作结果进一步确证了LXQ-5在体外特异性结合PTP1B的作用, 且它们的结合呈“稳定结合, 缓慢解离”的动力学特点。
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| 图 3 LXQ-5与PTP1B分子互作拟合曲线 Fig. 3 Fitted curve of interaction between LXQ-5 and PTP1B |
| Curve | ka/[mol/(L·s)] | kd/(1/s) | KD /(μmol/L) | Rmax | Conc/(μmol/L) | tc | Chi2 (RU2) | U-value |
| 3.50×106 | 0.01 | 4.28×10–6 | 40.06 | 6.74×1014 | 0.203 | 1 | ||
| Cycle: 9 | 3.900×10–7 | |||||||
| Cycle: 10 | 7.800×10–7 | |||||||
| Cycle: 11 | 1.562×10–6 | |||||||
| Cycle: 12 | 3.125×10–6 | |||||||
| Cycle: 13 | 6.250×10–6 | |||||||
| Cycle: 14 | 1.250×10–5 |
通过每周测定各组小鼠的FBG水平, 所得到的血糖数据如表 2所示, 各组小鼠每周的血糖变化趋势如图 4所示。给药期间, 与健康的BKS小鼠相比, BKS db组小鼠的FBG明显高于BKS小鼠, 差异极显著; 与空白组BKS db小鼠比较, 给药1周后, Met给药组和LXQ-5给药组小鼠的FBG显著性降低(P < 0.01)。但在给药第2周和第3周期间, Met组和LXQ-5组小鼠血糖并不稳定, 有所波动。给药3周后, 这两组小鼠的FBG水平保持稳定的下降趋势, 且较BKS db组小鼠有显著性降低。与Met组小鼠相比, LXQ-5给药组小鼠的FBG降低更为明显。因此, 化合物LXQ-5在二型糖尿病小鼠体内有着良好的降糖效果。
| 组别 | 剂量/(mg/kg) | 给药前 | 第1周 | 第2周 | 第3周 | 第4周 | 第5周 |
| BKS | 4.2±1.2 | 3.4±1.4 | 3.9±1.5 | 3.0±0.8 | 3.7±0.8 | 3.8±0.8 | |
| BKS db | 27.5±5.2### | 30.5±4.6### | 30.7±3.8### | 31.7±2.8### | 29.4±4.4### | 31.5±2.7### | |
| Met | 80 | 26.6±4.5 | 21.2±6.9** | 22.4±6.5** | 25.1±6.3* | 24.3±6.8 | 21.8±8.3* |
| LXQ-5 | 80 | 27.6±5.5 | 21.4±7.2** | 20.8±4.6** | 22.6±4.6** | 20.9±7.2** | 20.2±6.8** |
| 注:与BKS组小鼠FBG相比, ###差异极显著(P < 0.001);与BKS db组小鼠FBG相比, *差异显著(P < 0.05), **差异极显著(P < 0.01), 下同。 | |||||||
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| 图 4 各组小鼠给药期间空腹血糖变化曲线 Fig. 4 FBG levels changes of all mice during administration |
血清中的GHb和GSP含量检测的结果如图 5所示。BKS db小鼠的GHb和GSP含量较BKS小鼠有极显著性地升高, 反映了BKS db小鼠长期的高血糖水平。而与BKS db小鼠相比, Met给药组和LXQ-5给药组的GHb和GSP水平均有着显著性地降低。尤其是GHb含量, LXQ-5组小鼠的GHb含量得到了极显著性降低。以上结果表明, LXQ-5能够显著性地改善二型糖尿病小鼠的高血糖水平。
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| 图 5 小鼠血清中GHb(A)和GSP(B)含量 Fig. 5 Content of GHb (A) and GSP (B) in serum of mice |
面对肥胖和二型糖尿病发病率在全球疯狂地增长, 我们迫切需要制定有效地治疗和预防策略[15, 16]。针对T2DM治疗靶点的降糖药物的开发一直是药物研发领域的热点之一, 受到全球制药行业的广泛关注和重大资金投入。PTP1B作为胰岛素信号通路的负调控蛋白, 已经被大量的实验研究证明它是一种新型的T2DM治疗的潜在靶点, 具有很大的研究价值[17, 18]。本实验室之前的研究表明海洋溴酚衍生物LXQ-5是一种活性优秀的PTP1B抑制剂, 其IC50值约为4.27 μmol/L。本研究通过酶动力学实验确定了LXQ-5的PTP1B抑制剂类型, 利用Biacore分子互作检测技术分析了LXQ-5与PTP1B在体外特异性结合作用的强弱和特点。结果表明LXQ-5是PTP1B的一种非竞争性抑制剂, 且它们在体外能够特异性结合, 有着较强的亲和力(KD=4.28×10–6 mol/L)。鉴于LXQ-5在体外表现出的优秀PTP1B结合作用和抑制活性, 我们以自发性糖尿病小鼠为模型, 研究了LXQ-5在小鼠体内的降糖活性。实验结果表明口服LXQ-5不仅能够显著地降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平, 而且还对小鼠血清中的GHb和GSP有显著性的降低作用。
给药期间内, 口服二甲双胍和LXQ-5均能显著地降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平。通过比较我们发现, LXQ-5的降糖效果较二甲双胍更稳定, 且在这5周的给药期间所表现出的降糖效果要优于二甲双胍。但是, 它们在给药2~3周均表现出对血糖控制的波动性。这可能是由于小鼠的周龄差异性、生活环境不稳定所导致, 具体的原因还需要我们进一步研究。
海洋溴酚衍生物LXQ-5表现出优秀的PTP1B抑制活性和小鼠体内降糖活性, 表明其已初步具有二型糖尿病候选药物的开发潜力。本研究将为海洋溴酚衍生物作为新型降糖药物的开发提供了一定的科学依据和理论支持。
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