2019, Vol. 43
文章信息
- 张守都, 邹杰, 丛文虎, 李娟, 姜勇, 徐科凤, 李莉. 2019.
- ZHANG Shou-du, ZOU Jie, CONG Wen-hu, LI Juan, JIANG Yong, XU Ke-feng, LI Li. 2019.
- 杂交与三倍体诱导对海湾扇贝(Argopecten irradians)幼虫的复合作用
- Interaction effects of heterosis and triploid inductionon the larval growth and survival of Argopecten irradians
- 海洋科学, 43(11): 28-34
- Marina Sciences, 43(11): 28-34.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180914001
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文章历史
- 收稿日期：2018-09-14
- 修回日期：2019-08-23
2. 广西海洋研究所, 广西 北海 536000;
3. 威海海洋职业学院, 山东 威海 264300;
4. 自然资源部北海环境监测中心, 山东 青岛 266033;
5. 中国科学院海洋研究所, 山东 青岛 266071
2. Guangxi Institute of Oceanology, Beihai 536000, China;
3. Weihai Ocean Vocational College, Weihai 264300, China;
4. North China Sea Environment monitoring Center, MNR, Qingdao 266033, China;
5. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China
杂种优势一般是指两个或两个以上不同遗传类型(不同基因型)的物种、品种、群体、自交系或个体杂交产生的杂种第一代, 在生长势、生活力、抗病性、产量和品质等比其双亲优势的现象。1908年, Shull最早报道了杂种优势现象[1], 他发现杂交F1与纯合的双亲性状的算术平均值比较具有优势, 他把这种现象定义为杂种优势(Heterosis), 并认为是杂合度(Heterozygosity)增加的结果。在此之后, 人们开展了大量的杂种优势的机理研究, 但至今一直没有确切的说法。当前, 关于杂交优势的机理, 主要有显性(dominance)、超显性(overdominance)和上位(epistasis)等三种非加性基因效应假说被认为是对杂种优势最合理的解释[2-3]。
得益于贝类人工育苗技术不断进步与成熟, 到20世纪70年代, 对贝类杂交育种的研究开始日渐繁荣, 像珠母贝[4]、牡蛎[5-8]、扇贝[9-11]、鲍[12]等贝类都开展了大量如何有效利用杂交优势的研究。另外, 还有像贻贝Mytilus edulis和M. galloprovincialis等亚种间的种间杂交也有少量的尝试与研究[13-15]。科学家也开始通过贝类杂交探索杂种优势的背后机理, 其中, 以Hedgecock研究最具有代表性, 他通过两个长牡蛎近交系的杂交实验[16-18]对杂种优势的上位效应假说进行了有效验证。郑怀平等则通过两个不同地理群体海湾扇贝间杂交, 发现中亲杂种优势介于两个单亲杂种优势之间且为正值, 认为导致海湾扇贝杂种优势的原因主要是上位效应[19]。Pogson[20]等通过RFLP技术, 发现DNA的多态性与生长率不相关, 因此他们认为在扇贝中用超显性来解释杂种优势与杂合性的关系是行不通的。经过综合的数量性状的遗传分析, 张国范[21]等认为杂种优势的遗传实质应是显性、超显性、上位、加性、互补和连锁效应等各种基因效应的总和。
1981年Stanley等[22]报道了人工诱导美洲牡蛎(Crassostrea virginica)三倍体成功以来, 贝类多倍体制作技术取得了快速发展, 目前已在30余种贝类中开展了多倍体育种的研究[23]。田传远等[24]研究了用6-DMAP抑制受精卵第二极体释放而诱导长牡蛎三倍体的最佳条件。相对杂种优势现象来源于父母染色体的相互作用, 三倍体则是染色体的复制增加, 引起遗传基础的改变[25], 但从某种程度上讲, 杂交和多倍体都是通过对染色体的重新组合实现对生物体遗传的干预。
到目前为止, 尚没有将杂种优势和三倍体结合起来研究的报道。本研究在前人对杂种优势和三倍体研究的基础上, 以交配方式和多倍体诱导为因素, 通过2×2交叉实验设计, 构建四个相互对照实验组, 以期验证多倍体处理对杂种优势或自交劣势是否会产生影响, 为进一步探讨海湾扇贝杂种优势的内在机理奠定基础。
1 材料与方法 1.1 亲贝的获取与培养海湾扇贝(Argopecten irradians)取自山东青岛当地养殖群体; 所有实验扇贝的亲贝均按照郑怀平等[26]的方法在青岛崂东海珍品良种培育有限公司的育苗车间中进行暂养, 然后从5℃逐渐升到19℃至性腺成熟, 并在22℃诱导刺激产卵。
1.2 实验设计从暂养亲贝群体中随机选择30个性腺发育至第Ⅳ期的个体[27]。参照郑怀平等[28]的组合方法来实现雌雄同体的扇贝相继分开排放精卵, 共收集到的20份纯净未受精的卵子备用。
将所有的扇贝个体的卵子平均分成4份, 其中2份用该个体自己的精子受精, 另外2份用其他19只扇贝的混合精子受精, 分别形成2份自交和杂交组。取其中1份自交和杂交组受精卵, 待第二极体比例达到40%时, 用100 mg/L的6-DMAP处理20 min建立三倍体实验组[29], 将具有相同交配类型和处理方式的受精卵混合, 至此通过2×2交叉设计产生了四个不同的实验组, 分别根据交配方式和染色体倍性命名为: S2N(自交二倍体组)、C2N(杂交二倍体组)、S3N(自交三倍体诱导组)和C3N (杂交三倍体诱导组)。
1.3 幼虫孵化与培育各组受精卵放置在盛有沙滤海水(水温22℃、盐度30)的50 L塑料桶中孵化, 孵化密度设置20个/mL。每0.5 h搅桶一次以提高孵化率, 大约24 h后受精卵孵化至D形幼虫。幼虫起始密度设置为10个/mL, 每天投饵2次, 投喂饵料为新鲜金藻Isochrysis galbana, 随幼虫生长投喂量从2 000细胞/天提至10 000细胞/天。以电加热水浴的方式保持培养桶中孵化和培育水温恒定在22℃。每天全量换水1次, 为避免各实验组交叉污染, 所有换水设备用过之后在淡水中浸泡5 min。
1.4 取样与数据测量幼虫的生长是通过测量各组的1日龄、5日龄和10日龄的幼虫壳长计算, 存活率通过5日龄和10日龄的密度变化来计算。
1.5 数据分析不同实验组的生长和存活, 采用单因素方差分析, 并进行多重比较。用一般性模型(generalized linear model, GLM)分析交配方式M(C, S)与倍性P(2N, 3N)对各性状单独影响和交互影响, 该模型如下:
| $ {Y_{ijk}} = {\rm{ \mathsf{ μ} }} + {M_i} + {P_j} + {(M \times P)_{ij}} + {e_{ijk}}, $ | (1) |
模型中, Yijk是来自第i个交配方式的第j种环境处理的第k个个体的性状表型值; μ是常数项; Mi是交配方式的影响(i=1, 2); Pj是倍性的影响(j=1, 2); (M×P)ij是交配方式和倍性的交互影响; eijk是随机观察误差。
所有的统计分析均采用SPSS 19.0, 差异显著性设为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 各实验组幼虫孵化率与存活率比较不同实验组幼虫的孵化率和存活率见表 1。其中用6-DMAP处理组的孵化率要显著低于没用药物处理组(P < 0.05)。三倍体诱导自交组(S3N)在第5天幼虫存活率要显著小于其他组的存活率(P < 0.05), 而在第10天三倍体诱导自交组(S3N)全部死亡, 而其他组间幼虫存活率并无显著差异(P > 0.05)。
| 组 | 孵化率(±SD, %) | 存活率(±SD, %) | |
| 第5天 | 第10天 | ||
| S2N | 60.41±1.38a | 64.17±4.72a | 23.25±7.27a |
| C2N | 64.54±2.16a | 74.89±17.88a | 18.52±2.05a |
| S3N | 10.23±1.97b | 27.78±9.62b | 0 |
| C3N | 10.60±2.47b | 63.49±5.50a | 15.87±5.72a |
| 注: (1) S代表自交, C代表杂交, 2N代表 2倍体, 3N代表三倍体诱导; (2)同一列中相同字母上标注表示差异不显著(P > 0.05) | |||
各实验组孵化率和幼虫存活率的方差分析结果见表 2, 结果表明, 三倍体诱导对孵化率影响极显著(P < 0.01), 交配方式和倍性诱导对5日龄幼虫存活率影响均极显著(P < 0.01), 交配方式和倍性诱导对幼虫孵化率和存活率的交互作用影响均不显著(P > 0.05)。
| 方差来源 | 自由度 | 孵化/存活 | ||
| 均方 | F值 | P值 | ||
| 孵化率 | ||||
| 交配方式 | 1 | 0.002 | 0.380 | 0.555 |
| 三倍体诱导 | 1 | 0.813 | 203.574 | < 0.001** |
| 交配方式×三倍体诱导 | 1 | 0.001 | 0.265 | 0.621 |
| 第5d存活率 | ||||
| 交配方式 | 1 | 0.162 | 13.912 | 0.006** |
| 三倍体诱导 | 1 | 0.171 | 14.737 | 0.005** |
| 交配方式×三倍体诱导 | 1 | 0.047 | 4.033 | 0.079 |
| 第10d存活率 | ||||
| 交配方式 | 1 | 0.003 | 1.122 | 0.330 |
| 三倍体诱导 | 1 | 0.001 | 0.352 | 0.575 |
| 交配方式×三倍体诱导 | 0 | — | — | — |
| 注: *代表差异显著, **代表差异极显著 | ||||
不同实验组幼虫的壳长生长结果见表 3, 其中第1天, 三倍体诱导杂交组(C3N)生长要低于其他组(P < 0.05), 在第5天, 三倍体诱导杂交组(C3N)则要显著高于其他组(P < 0.05)组, 在第10天杂交三倍体组(C3N)显著高于自交二倍体组(S2N)(P < 0.05), 但与杂交二倍体组(C2N)差异不显著(P > 0.05)。
| 组 | 壳长(±SD, μm) | ||
| 第1天 | 第5天 | 第10天 | |
| S2N | 99.73±1.01a | 126.83±4.79 b | 156.67±17.13b |
| C2N | 99.47±1.17a | 129.83±5.19 b | 186.00±12.47a |
| S3N | 100.33±1.58a | 115.47±6.78c | — |
| C3N | 98.33±2.47b | 134.57±8.23a | 182.67±14.63a |
| 注: (1) S代表自交, C代表杂交, 2N代表 2倍体, 3N代表三倍体诱导; (2)同一列中相同字母上标注表示差异不显著(P > 0.05) | |||
各实验组幼虫生长的方差分析结果见表 4。结果表明, 第1天交配方式对生长存在极显著影响(P < 0.01), 交配方式和三倍体诱导之间存在极显著的互作(P < 0.01), 第5天无论是交配方式和三倍体诱导对生长具有极显著影响(P < 0.01), 而交配方式和三倍体诱导之间的互作也极显著(P < 0.01), 第10天, 由于自交三倍体组(S3N)的死亡缺失, 只检测到交配方式对生长的极显著影响(P < 0.01)。
| 方差来源 | 自由度 | 壳长 | ||
| 均方 | F值 | P值 | ||
| 1 d | ||||
| 交配方式 | 1 | 38.533 | 14.027 | < 0.001** |
| 三倍体诱导 | 1 | 2.133 | 0.777 | 0.380 |
| 交配方式×三倍体诱导 | 1 | 22.533 | 8.203 | 0.005** |
| 5 d | ||||
| 交配方式 | 1 | 3 663.075 | 89.585 | < 0.001** |
| 三倍体诱导 | 1 | 330.008 | 8.071 | 0.005** |
| 交配方式×三倍体诱导 | 1 | 1 944.075 | 47.545 | < 0.001** |
| 10 d | ||||
| 交配方式 | 1 | 2 940.000 | 13.308 | < 0.001** |
| 三倍体诱导 | 1 | 510.417 | 2.310 | 0.132 |
| 交配方式×三倍体诱导 | 0 | — | — | — |
| 注: *代表差异显著, **代表差异极显著 | ||||
杂种优势的三大假说仍然是当前关于杂种优势机理解释的主流。其中, 显性假说认为杂交使有害的隐性基因被有利显性等位基因掩盖或互补, 从而使杂种后代表现出杂种优势。而超显性假说认为杂种优势是等位基因间相互作用的结果, 由于具有不同作用的一对等位基因可以在生理上相互作用, 使杂合个体比任何一个纯合个体在生活力和适应性上更为优越。无论是显性假说还是超显性假说都是建立在遗传学的单基因理论上的, 而根据多基因假说, 数量性状是由许多微效多基因控制的, 这些性状与基因之间的关系是一种“网状”结构, 因此, 上位效应假说认为非等位基因间存在互作效应, 这种互作效应既可以是正的, 也可以是负的, 因而会使后代的性状受到抑制或增强[30]。近年来, 随着分子生物学的发展, 特别是分子标记、连锁图谱的构建和QTL定位的基因组学研究的发展, 人们越来越认识到上位效应在杂种优势中扮演了重要的作用。Yu等[31]认为杂合度在水稻杂种优势中的效应是不明显的, 两个基因的互作在所检测的群体内发生的频率更高且更常见, 这种互作常包括很多的位点, 并非是所检测的一个位点。这明确地表明, 上位效应在杂种优势中扮演了重要的角色。
在植物研究中认为多倍体生长优势源于杂合度的提高, 由于多倍体染色体成倍增加, 同源多倍体比二倍体有较多的等位基因, 异源多倍体比二倍体具有更多的杂合位点和更多的互作效应, 因而表现对二倍体的生长优势, 而且无论根据杂种优势的哪种假说都可以解释这种优势产生的原因[32]。在贝类研究中通常认为三倍体不育是成体具有生长优势的主要原因, 如Skjr等[33]研究发现三倍体长牡蛎只有在繁殖期后才表现出对二倍体的生长优势。曾志南等[34]比较了太平洋牡蛎二倍体和三倍体的生长, 发现三倍体在成体的生长速度和抗病能力都要优于二倍体个体, 但在幼虫期并未发现生长和抗病优势。
在本研究中, 通过2×2交叉实验设计, 理论上可以观察三倍体效应与杂种优势的交互作用, 但受实验条件限制, 并未对6-DMAP处理的实验幼虫进行三倍体检测, 故不能对所处理幼虫定性为三倍体, 但假设存在一定比例三倍体, 亦应对实验结果具有积极意义。本研究中, 由于6-DMAP的毒副作用, 用6-DMAP处理的实验组幼虫孵化率均偏低, 但孵化幼虫数量足够进行后续实验。无论是二倍体组还是三倍体诱导组, 杂种组均表现出对自交组的生长优势。而三倍体诱导自交组(S3N)无论是幼虫存活率还是生长均比二倍体自交组(S2N)表现出更多的近交衰退现象, 甚至最终全部死亡, 三倍体诱导杂交组(C3N)则一定程度上比二倍体杂交组(C2N)表现出更大的杂种优势。虽然三倍体诱导自交组也可能是因6-DMAP的毒副作用而导致整个幼虫期的生长和抗逆劣势, 但三倍体处理杂交组表现出的更大杂种优势更可能与三倍体诱导产生的三倍体有关。根据上述结果, 我们推测三倍体效应同杂种优势和自交劣势之间存在互作, 通过方差分析也显示, 杂种优势和药物处理两因素间在幼虫期的生长中确实存在较大的互作。本研究为进一步通过三倍体研究杂种优势机理提供了有益线索。
致谢: 感谢青岛崂东海珍品良种培育有限公司为本研究提供了实验所用的场地以及所有设施。
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