2019, Vol. 43
文章信息
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- WANG Ke-ke, TIAN Ye, JIANG Yuan-qing, LI Pei-feng, LIU Chun-ying, YANG Gui-peng. 2019.
- 温度对海洋硅藻吸收或释放一氧化氮的影响
- Effect of temperature on the uptake and release of nitric oxide by marine diatoms
- 海洋科学, 43(11): 35-41
- Marina Sciences, 43(11): 35-41.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190506001
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文章历史
- 收稿日期：2019-05-06
- 修回日期：2019-06-06
2. 国家海洋局 烟台海洋环境监测中心站, 山东 烟台 264006
2. Yantai Marine Environmental Monitoring Center Station, State Oceanic Administration, Yantai, Shandong 264006, China
浮游植物是海洋生态系统中最重要的初级生产者[1], 是水中溶解氧的主要提供者, 也是地球上固碳固氮的重要生物[2-4]。一氧化氮(NO)是浮游植物体内重要的生长调节因子和信号因子[5-6]。Gross研究发现硅藻在产生醛类化合物来控制藻细胞密度的同时也会产生NO, 表明NO可以作为硅藻的信号分子进而参与硅藻生物量的调控[7]。NO阈值概念的提出也是基于外源NO对海洋微藻的生长有显著的影响[8]。另外, NO能参与浮游植物细胞的程序性死亡过程[9-10]以及其它生理活动[11-12], 并能在藻细胞受到非金属、金属、杀虫剂和紫外线等非生物的生长胁迫时起到保护作用[13]。因此, NO与微藻的关系引起了研究者们的关注。
Kim等在三种海洋赤潮藻Chattonella marina、Cryptomonas ovata和Heterosigma akashiwo中观测到NO的释放[14-15]。Zhang等[6]在亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和裸甲藻(Gymnodinium sp.)三种微藻藻液中检测到浓度大约为10–9~10–8 mol/L的NO。如果微藻大规模生长引起藻华现象, 则会导致海水中NO浓度的增高, 而高浓度的NO会通过海气交换进入到大气中, 进而影响气候和环境[16]。另一方面, Yoshihara等[17]和Nagase[18]等研究发现绿藻在吸收利用炉气时, 也能吸收炉气中10–6 mol/L数量级的NO。赤潮藻比如中肋骨条藻、裸甲藻和旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)也能吸收利用外源的NO[19-20]。因此, 研究微藻释放或吸收NO对进一步认识NO与微藻的关系具有重要的意义。
微藻产生NO的可能途径[21-23]和环境因子对微藻释放NO浓度的影响[20]已有一些报道, 但是关于微藻释放或吸收NO速率的研究基本空白。此外, 温度对海洋微藻生长的影响及机制引起广泛的关注。温度不仅会影响藻类生长和光合作用, 还会影响藻类的细胞组成[24]、短期的营养盐吸收[25]和氮代谢[26]。硅藻因其种类多, 数量大, 增值速率较快, 成为我国近海的优势类群[27]。温度会限制硅藻的生长及对硝酸盐的吸收, 进而对物种演替和氮的海洋生物化学过程产生影响[28-29]。因此本文选用了具有代表性的三种硅藻小新月菱形藻(Nitzschia closterium f. minutissima)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和中肋骨条藻, 进行实验室模拟培养, 探讨温度升高对NO净释放或净吸收速率的影响, 为进一步了解NO在海洋生态系统中的地位和作用提供一定的科学依据。
1 材料与方法 1.1 仪器与材料小新月菱形藻、三角褐指藻和中肋骨条藻, 同属于硅藻门, 分属于羽纹硅藻纲、羽纹纲和中心纲, 均来自中国海洋大学海洋污染生态化学实验室。选取黄海(121°04.228'E, 35°56.248'N)海水作为培养基底, 先用0.45 µm醋酸纤维滤膜过滤, 再用LDZX-50KBS高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂, 中国)灭菌20 min (0.15 MPa), 冷却后充分摇动来恢复溶解气体含量。
用分析天平(Mettller Toledo, 瑞士)准确称取4, 5-二氨基荧光素(DAF-2) (Sigma公司, 美国), 溶于少量Milli-Q水(Millipore公司, 美国)中, 配制成浓度为276 μmol/L的储备液贮于10 mL棕色血清瓶中避光冷冻保存。然后用移液枪(Eppendorf公司, 德国)移取200 µL上述配制好的DAF-2储备液到5 mL Milli-Q水中混匀, 得到NO捕集液, 贮于10 mL棕色血清瓶, 现配现用。
用NaOH和NaH2PO4 (国药集团化学试剂有限公司, 中国)配制成pH在7.3~7.4范围内的10 mmol/L磷酸盐缓冲液, 再用0.22 µm醋酸纤维滤膜过滤, 冷藏备用。
1.2 实验步骤根据f/2配方在上述灭菌海水中加入营养物质, 调节溶液pH值为8.10±0.02, 按培养液和藻液3︰1的比例加入藻液, 置于GXZ-380B型智能光照培养箱(宁波江南仪器厂, 中国)中静置培养, 培养到指数生长期进行接种, 三角褐指藻、小新月菱形藻和中肋骨条藻的初始藻密度分别为1.50×107个/L、2.75×107个/L和1.00×108个/L。每种海洋硅藻设立三个平行样和空白对照, 培养体积均为200 mL。培养温度分别为20℃和25℃。其他培养条件为:明暗周期(L/D)为12 h︰12 h, 光照强度为8 000 Lux。每8 h摇瓶一次, 以保持藻液中的溶解气体含量和防止藻细胞沉降。根据藻密度变化确定其生长周期, 并分别用处于指数生长期、生长平台期和衰亡期的某一天代表这三个生长阶段, 进行密闭实验。具体方法:从200 mL锥形瓶中移取30 mL藻液于40 mL透明玻璃瓶中, 立即压盖密封, 光照培养6 h, 在密封培养前后取样。取样方法:首先将200 µL内插管(CNW公司, 德国)置于2 mL 9 mm棕色螺纹口自动进样瓶中(CNW公司, 德国), 再用微量进样器(上海安亭微量进样器厂, 中国)移取150 µL NO捕集液于200 µL内插管中, 然后用新的微量进样器从透明玻璃瓶中移取50 µL藻液于内插管底部, 混匀待测。
1.3 测定方法 1.3.1 藻密度的测定取4 mL藻液倒入5 mL离心管中, 滴入一滴鲁格试剂, 摇匀, 取洁净的血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司, 中国)一块, 用光学显微镜(Nikon ALPHAPHOT-2YS2, 日本)计数, 每个样品重复测量3次。硅藻生长速率根据下列公式计算:
(µ为比生长速率, Nt为从任何时间处开始培养t时间后的藻密度, N为任何时间处的藻密度, t为培养时间)。
1.3.2 NO标准曲线的制定将Milli-Q水加热煮沸并保持沸腾状态1~2 min, 趁热取10 mL到棕色血清瓶中, 立即压盖封口, 然后用高纯氮气(99.999%)(青岛豪森新能源有限公司, 中国)吹扫30 min, 待其氧气除净后通入高纯NO (99.9%) (大连大特气体有限公司, 中国)气体30 min, 得到NO饱和溶液[5]。准确移取100 μL NO饱和溶液到8 mL无氧水中, 得到二级NO母液。再移取100 μL二级NO母液到8 mL无氧水中, 得到三级NO母液。分别移取10、20、40、60、80和100 μL三级母液于8 mL NO捕集液中, 反应完全后用高效液相色谱仪(Agilent 1260 Infinity LC, 美国)测定, 在10–10~ 10–9 mol/L范围内的NO标准系列, 然后以NO浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标绘制工作曲线, 得到线性方程y = 0.0094x + 0.1741, R2=0.96。
1.3.3 NO浓度的测定样品采集后, 用高效液相色谱法[30]进行测定, 其中流动相比例为乙腈︰磷酸盐溶液=8︰92, 柱温25℃, 流速1 mL/min, 进样量为10 μL, 荧光检测器的激发波长和发射波长分别为495 nm和515 nm。检测限为0.025×10–9 mol/L, 精密度为3%~5%。
1.3.4 NO净吸收或净释放速率的计算对比空白样, 在藻生长的指数生长期、平台期和衰亡期计算NO表观净吸收或净释放速率, 具体计算方法为:
NO净吸收或净释放速率增加或降低率:
ν为单位藻细胞对NO的净吸收或净释放速率[mol/(个·h)], t为6 h, C1为密闭前藻液中NO浓度, C2为密闭后藻液中NO浓度, 单位为mol/L (假设密闭6 h之内, 硅藻对NO的吸收或释放状态一直不变, 即根据NO速率的正负定义硅藻在这个生长阶段对NO是释放或吸收), A为三个生长阶段取样当天的藻密度, 单位为个/L。
1.3.5 实验数据处理数据采用SPSS 17.0进行相关性分析和显著性差异, 使用OriginPro 8.5绘图。
2 结果 2.1 三角褐指藻的生长与NO净吸收速率三角褐指藻的生长曲线如图 1所示, 两种温度条件下三角褐指藻均在第4天达到生长平台期, 持续3天后进入衰亡期。指数生长期的比生长速率均明显高于衰亡期, 主要是因为生长初期营养盐比较丰富, 随着硅藻高速生长到平台期, 营养盐被大量消耗, 导致衰亡期营养盐不足[20]。在指数生长期, 三角褐指藻对NO的净吸收速率也明显高于平台期和衰亡期(P < 0.05)。温度升高对三角褐指藻的生长并没有明显影响, 但促进了三角褐指藻吸收NO。与20℃相比, 25℃条件下NO净吸收速率在指数生长期、生长平台期和衰亡期分别升高了40.2%、98.2%和16.0%。温度升高对处于生长平台期的三角褐指藻吸收NO的影响程度最大。
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| 图 1 不同温度下三角褐指藻的生长曲线、NO净吸收速率(a)和比生长速率(b) Fig. 1 Growth curves, nitric oxide uptake rates (a), and specific growth rates (b) of Phaeodactylum tricornerum at various temperatures |
培养周期内小新月菱形藻的藻密度变化和NO净吸收或净释放速率如图 2所示, 20℃和25℃条件下小新月菱形藻均在第5天进入生长平台期, 持续3天进入衰亡期。两个温度条件下小新月菱形藻的比生长速率差异不显著, 即温度升高对小新月菱形藻的生长没有明显影响, 但促进了小新月菱形藻吸收NO。在指数生长期, 25℃培养条件下的小新月菱形藻对NO的净吸收速率比其在20℃高50.3%。在平台期, NO净吸收速率升高幅度最大, 20℃和25℃条件下NO净吸收速率分别为2.3×10–19 mol/(个·L)和1.54×10–18 mol/(个·L), 升高了5.7倍。同一温度下, 小新月菱形藻对NO的吸收或释放在不同生长阶段呈现出不同的规律。20℃和25℃条件下, 处于指数生长期的小新月菱形藻对NO的净吸收速率均高于平台期。
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| 图 2 不同温度下小新月菱形藻的生长曲线、NO净吸收或净释放速率(a)和比生长速率(b) Fig. 2 Growth curves, nitric oxide uptake or release rates (a), and specific growth rates (b) of Nitzschia closterium at various temperatures |
中肋骨条藻的藻密度变化与NO净吸收或净释放速率如图 3a所示, 两个温度条件下藻密度均在第11天进入平台期, 持续3天。20℃培养条件下的藻密度远高于25℃(P < 0.01), 说明温度升高抑制了中肋骨条藻的生长。在指数生长期和平台期, 25℃条件下NO净释放速率比20℃分别高了4倍和11.5倍, 表明在20~25℃内, 温度升高在一定程度上促进了中肋骨条藻释放NO。而同一温度下, 中肋骨条藻对NO的吸收或释放在不同生长阶段呈现出不同的规律。在指数生长期, 20℃和25℃条件下NO净释放速率均高于平台期。
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| 图 3 不同温度下中肋骨条藻的生长曲线、NO净吸收或净释放速率(a)和比生长速率(b) Fig. 3 Growth curves, nitric oxide uptake or release rates (a), and specific growth rates (b) of Skeletonema costatum at various temperatures |
温度通过影响微藻的光合作用和呼吸作用强度来影响藻的新陈代谢, 对微藻的生长速率产生显著影响[31]。Epple[32]发现大部分硅藻的最适生长温度为20~24℃。但不同种类的硅藻在适应温度方面却具有不同的能力。Bonggil Hyun等[33]研究全球变暖对四种海洋硅藻的生长影响时发现, 当温度从20℃升高到25℃时, 中肋骨条藻的生长受到抑制、而柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)表现出快速生长, 对诺氏海链藻(Thalassiosira nordenskioeldii)和双突角毛藻(Chaetoceros didymus)的生长没有明显影响。在本研究中, 如图 1b~图 3b所示, 与20℃相比, 25℃对三角褐指藻和小新月菱形藻的生长无明显影响, 而显著抑制了中肋骨条藻的生长。
3.2 海洋微藻生长与NO的关系NO是微藻体内重要的生长调节因子, 且NO在藻液中的变化是一个复杂的过程[5-6]。如图 1a~图 3a所示, 三角褐指藻和小新月菱形藻表现为吸收NO, 而中肋骨条藻则表现为释放NO。如引言中提到大量的研究证明微藻在生长过程中可释放一定浓度的NO到细胞外。而NO是一种非极性小分子, 暗示着NO可以通过扩散穿透细胞膜[34], Nagase等[18]研究证明液相中的NO可以通过扩散直接被绿藻吸收, 且藻液中的NO会先降低然后达到一个平衡值。所以在短暂的密闭培养体系中, 三种实验硅藻对NO表现出的表观吸收或释放可能主要是由NO分子扩散速率和藻细胞产生NO速率共同决定的。假设其他环境因素一致, NO分子扩散速率不变, 则三种硅藻对NO的表现不同则是由藻细胞产生NO速率的不同导致的, 而藻细胞产生NO速率的不同可能是存在种间差异的缘故。
在藻的不同生长阶段, 藻液中NO浓度不同, 在藻密度达到最高值之前NO浓度达到峰值[20]。海洋微藻藻液中NO浓度与微藻各生长阶段有着密切的联系。如图 1~3所示, 在20℃和25℃条件下, 三种硅藻对NO的净吸收或净释放速率的大小顺序均为:指数生长期 > 平台期 > 衰亡期, 细胞生长速率变慢, 用于细胞生长的营养物质消耗速率也会变慢, 而同时NO净吸收或净释放速率也降低。这种硅藻的比生长速率与NO净吸收或净释放速率的同时期变化说明NO可能参与了三种硅藻的生长代谢。
3.3 温度对NO净吸收或净释放速率的影响作为影响微藻生长的重要环境因素之一, 温度对NO净吸收或净释放速率也会产生影响。25℃下三角褐指藻和小新月菱形藻对NO的净吸收速率均比20℃条件下高。高温会导致NO在液相中以及细胞膜上的扩散系数增大[35], 进而导致NO扩散速率升高即NO净吸收速率升高。微藻产生NO的具体途径尚不清楚, 但实验培养设定的pH值不支持非酶途径产生NO。Sakihama等[36]研究发现一些海洋微藻可以通过一氧化氮合成酶(NOS)途径或者硝酸还原酶(NR)途径产生NO。温度控制着植物细胞内各种化学反应速率, 影响着参与反应的酶的活性[37], 戴爱泉等[38]研究显示旋链角毛藻的NR最适温度为20℃, 而Venturini等[39]研究发现当温度升高时, 表征NOS-І和NOS-П活性的最大催化速度Vmax增加, 本研究显示中肋骨条藻对NO的净释放速率的温度效应顺序为25℃ > 20℃。由于控制中肋骨条藻产生NO的酶种类的不确定性, 所以温度对NO净释放速率的影响机制也不能确定。
温度升高, 中肋骨条藻的生长受到抑制, 而NO净释放速率增加, 则说明在硅藻生长的适合温度下, 硅藻并不一定具有最大NO净释放或净吸收速率。有研究发现NO在藻细胞受到非生物胁迫时会对其进行保护[13], 且林彩等[40]研究发现当温度在25~30℃时, NO对中肋骨条藻的生长促进作用最明显, 所以高温下中肋骨条藻对NO的净释放速率的增加可能是因为在高温胁迫下, 中肋骨条藻会作出释放NO的响应来保护藻细胞。另外, 由图 3(a)可以看出, 高温对处于平台期的中肋骨条藻释放NO的影响程度最高, NO净释放速率在25℃下比其在20℃下高了11.5倍, 而此生长阶段的藻密度最大, 暗示着当发生中肋骨条藻藻华时, 高温会引起NO净释放速率的大幅度升高。
4 结论当温度从20℃升高到25℃, 三种藻的生长趋势大致相同, 但对三种硅藻的生长影响明显不同, 说明不同种类硅藻具有不同的适应温度能力。
在20℃和25℃条件下, 三种硅藻从指数生长期生长到衰亡期, 藻细胞生长速率变慢, NO净吸收或净释放速率下降, 说明NO可能与三种硅藻的生长代谢相关。
与20℃相比, 25℃条件下三角褐指藻对NO的净吸收速率在指数生长期、生长平台期和衰亡期分别升高了40.2%、98.2%和16.0%, 小新月菱形藻对NO的净吸收速率和中肋骨条藻对NO的净释放速率在平台期分别增加了5.7倍和11.5倍。升高温度, 不同种类的硅藻对NO的净吸收或净释放速率有不同程度的升高, 说明全球变暖会促进硅藻代谢NO。
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