单环刺螠(Urechis unicinctus)是螠虫动物门的重要经济海洋动物, 同时也是无管螠目(Xenopneusta)在中国海域分布的唯一物种^[1]。该螠虫形似海参, 体壁中蛋白和营养必需氨基酸含量高, 内脏中也存在大量多糖、酶等生理活性物质, 具有巨大的经济价值。单环刺螠可以存活于硫化物含量较高的海洋环境中, 并对其环境中的硫化物具有一定的解毒能力^[2], 对人类治理海洋硫化物污染给予了新的启示。基于单环刺螠的独特分类学地位、优于其他海洋生物对硫化物的耐受解毒能力以及广阔经济前景, 针对单环刺螠的研究已经在国内外成为新的热点之一^[3-5]。在中国, 单环刺螠主要分布于渤海三大海湾之一的莱州湾地区, 近年来该海域不仅遭受时有发生的海上漏油事件的影响, 而且遭受陆源污染物的大量排放, 海洋污染问题较为突出。环境污染可影响地理种群的多样性, 使生物资源衰退^[6]。进行莱州湾单环刺螠遗传多样性研究, 对该种群的进一步针对性保护和合理开发均有深刻意义。

近年来, 包括简单重复序列、简单重复序列中间区域以及单核苷酸多态性分析等在内的多种分子标记在生物遗传多样性的分析中广泛应用^[7-9]。在当前所有分子标记中, 单核苷酸多态性(SNP)标记是涵盖生物体全部DNA多态的惟一标记方法^[10], 基于COI基因序列的SNP已用于多种海洋生物的遗传多样性分析^[11-13]。生物体线粒体DNA是探究群体遗传学的有效标记, 而COI基因是线粒体DNA的标准目标区域, 并在所有物种中进行编码^[14], 现已进行的大量工作已证明COI基因序列用于物种鉴定、遗传多样性分析和进化分析具有可行性、有效性和准确性^[15-17]。本研究对莱州湾单环刺螠多个群体进行COI基因分析, 以期为该地理种群的保护和合理利用提供基础依据。

1 材料与方法 1.1 样本采集

实验共采集单环刺螠3个群体84个样本, 其中群体1的21个样本(编号1-1~1-21)采自潍坊莱州湾单环刺螠保护区, 群体2的30个样本(编号2-1~2-30)采自莱州浅滩保护区, 群体3的33个样本(编号3-1~3-33)采自昌邑海区。样本来源见表 1。单环刺螠活体运输至实验室。

1.2 基因组DNA提取

解剖单环刺螠活体, 去除其内脏组织, 取其体壁, 采用Omega公司的动物组织DNA提取试剂盒提取单环刺螠基因组DNA。

1.3 基于COI基因序列的遗传多样性分析 1.3.1 COI基因的PCR扩增

根据NCBI上搜索到的单环刺螠COI序列(登录号: EF656365), 利用Primer Premier软件设计扩增该序列所需的特异引物, 并由华大科技有限公司合成, 引物序列(CXF、CXR)见表 2; 同时合成后生动物通用引物, 引物序列(LCO、HCO)见表 2。

分别以CXF、CXR以及LCO、HCO作为上下游引物, 提取的单环刺螠DNA为模板进行PCR扩增。反应总体系50 μL, 其中上下游引物(10 μmol/L)各2 μL, DNA模板2 μL。反应程序: 94℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 30个循环; 最后72℃延伸10 min。纯化后的COI扩增产物由华大科技有限公司进行双向测序。

1.3.2 COI数据分析

利用MEGA5软件中的ClustalW对得到的COI序列进行比对^[18], 去掉两端有误差的部分, 最终得到一个用于分析的碱基序列阵式文件。应用DnaSP软件计算各个核苷酸的多样性^[19], 并分析平均核苷酸差异。利用MEGA5软件进行简约信息位点和突变位点分析^[18], 计算简约信息位点的比率以及各碱基的含量; 利用Kimura 2-parameater模型构建NJ分子系统树^{[20, 21]}。

2 结果与分析 2.1 基因组DNA提取结果

单环刺螠DNA的提取对于整个实验过程至关重要, 使用试剂盒提取的单环刺螠DNA检测后表明, 提取结果较好。

在提取过程中, 单环刺螠的保鲜和细胞裂解条件至关重要。活体单环刺螠内的基因组降解酶活性小, 而机体失活后, 其内的DNA酶迅速活跃, 可使大量DNA损失, 导致所提量甚微。在液氮中快速研磨组织块, 加入蛋白酶水浴保温裂解细胞, 裂解时间一般3 h左右, 同时避免剧烈振荡等造成DNA的断裂。提取后的DNA应即时贮存于–20℃冰箱中, 以减缓其降解的速度。

2.2 莱州湾3个群体COI序列分析实验结果

单环刺螠COI序列扩增特异引物(CXF、CXR)扩增效果较好(图 1), 后生动物通用引物(LCO、HCO)扩增效果较差。扩增后单环刺螠COI序列全长1 533 bp, 去除去掉两端有误差的序列, 最终得到用于分析的1 309 bp碱基序列, 84个样本中, 除去测序失败和序列过短的14个样本, 用于最终分析的样本为70个。将单环刺螠COI序列70个样本的全部序列作为一个共同数据矩阵, 用DnaSP软件进行处理。结果发现:单环刺螠COI序列有变异位点数125个, 其中43个单一变异位点, 82个简约信息位点; 48个单倍型, 单倍型多样性0.977;单倍型多样性方差0.00079, 单倍型多样性标准差为0.028;核苷酸多样性指数为0.01048;平均核苷酸差异数量为13.725。平均碱基

组成: A, 26.3%; G, 17.6%; C, 24.2%; T, 31.8%; A+ T(58.1%)含量高于G+C(41.9%)含量。不同群体的遗传变异参数见表 3。莱州湾单环刺螠70个体的聚类图见图 2, 其中样品1-1~1-21为潍坊莱州湾单环刺螠保护区地理种群(群体1);样品2-1~2-30为莱州浅滩保护区地理种群(群体2);样品3-1~3-34为昌邑海区地理种群(群体3)。从图 2中可见, 70个个体聚类并没有体现出和地理位置相关。

3 讨论

作为生物多样性的重要层次, 遗传多样性是评价生物资源的重要依据, 种群遗传多样性的度量和保护已成为对其生物资源进行评价的核心问题^{[22, 23]}。不了解重要种群的遗传多样性, 就无法实现有针对性的科学保护和合理开发。

物种的遗传多样性是否丰富与单倍型多样性和核苷酸多样性指数高低密切相关^[24], 数值越高, 多样性越丰富, 该物种的遗传多样性越高。莱州湾单环刺螠COI序列的单倍型多样性和核苷酸多样性明显高于中国海文昌鱼(Branchiostoma sp.)、前鳞鮻(Liza affinis)、丽文蛤(Meretrix lusoria)等其他海洋生物^{[12, 25, 26]}, 这可能由于在这些海洋动物中大多数种类已进行了多年人工增养殖, 近亲交配或遗传渐渗使其遗传多样性水平降低。未来在开展单环刺螠大规模人工增养殖活动时, 避免近亲交配, 减少遗传渐渗的出现, 将会对维持该地理种群的较高遗传多样性有重要作用。增殖放流时, 可增加放流单环刺螠的遗传多样性检测, 以保持该种群的较高遗传多样性。本研究结果还显示, 莱州湾3个单环刺螠群体的个体聚类并无地理位置相关性, 1个群体退化时可从其他群体引种, 以维系该地理种群较高的遗传多样性。

作者开展了莱州湾单环刺螠遗传多样性研究, 分析了其变异的大小, 并根据遗传多样性指数, 确定其遗传状况, 从而为该地理种群的长期保护和可持续性利用提供重要基础依据。