2019, Vol. 43
文章信息
- 宋宗诚, 吴志昊, 王丽娟, 胡金伟, 岳新璐, 尤锋. 2019.
- SONG Zong-cheng, WU Zhi-hao, WANG Li-juan, HU Jin-wei, YUE Xin-lu, YOU Feng. 2019.
- 大菱鲆三倍体人工诱导条件优化及规模化诱导
- Optimization of artificial induction conditions and large-scale induction of the triploid turbot Scophthalmus maximus
- 海洋科学, 43(12): 42-49
- Marina Sciences, 43(12): 42-49.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190903002
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文章历史
- 收稿日期：2019-09-03
- 修回日期：2019-09-25
2. 中国科学院实验海洋生物学重点实验室, 海洋大科学研究中心, 山东 青岛 266071;
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266000
2. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Center for Ocean Mega-Science, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China;
3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology(Qingdao), Qingdao 266000, China
多倍体育种作为细胞工程育种的重要组成部分, 因其周期短、见效快和安全性高等特点, 一直受到养殖业者的关注。鱼类多倍体育种应用最多的是三倍体育种, 从细胞遗传学理论来讲, 三倍体无法完成正常的减数分裂, 所以性腺往往不能发育或者低育, 能够避免因性腺发育和繁殖出现的生长减缓、肉质下降、死亡率增高, 以及人工养殖过程中的性早熟等现象[1-2]。由于三倍体的不育性, 还可以防止养殖逃逸个体对自然群体的基因污染和生态环境破坏, 有很高的应用价值。目前已在大西洋鲑(Salmo salar)[3]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[4]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[5]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[6]等几十种养殖鱼类中建立了三倍体诱导技术[7]。尤其是在虹鳟、大西洋鲑等鲑鳟类中进行了系统研发, 在其三倍体诱导、苗种规模化生产培育等方面已建立了成熟的技术, 并进行了商业化应用, 形成了完整的产业链。国内在鱼类三倍体人工诱导和培育技术方面也有诸多研究成果, 在多种经济鱼类中开发了三倍体诱导技术。但目前在倍性制种及产业化应用方面还较为薄弱, 仅有湘云鲫/鲤等一些淡水鱼类三倍体品种进行了推广[8]。在海水鱼类中, 国内外三倍体育种相关工作均尚未达到产业化水平。
大菱鲆(Scophthalmus maximus), 又称“多宝鱼”, 原产于欧洲沿岸, 自1992年引进我国以来, 发展十分迅速, 目前已成为我国北方主要的海水养殖品种[9]。其2016年产量达到4.95万吨, 占世界总产量的83%[10], 创造了巨大的经济效益。随着工厂与网箱接力养殖、北南轮养模式的建立, 其产业也辐射到东南沿海各省。近年来, 大菱鲆养殖业发展逐渐减缓, 急需采取有效方法进行遗传改良。三倍体由于其性腺不育或低育, 可用于高品质商品鱼的生产, 且在生态安全方面也具有优势, 三倍体的诱导和培育可以为大菱鲆良种培育开辟新的途径。近年来在大菱鲆三倍体的诱导与培育方面已有报道[11-13], 大菱鲆三倍体性腺发育异常, 而且三倍体中雌性比例明显增高, 1龄以上三倍体生长显著快于二倍体(P < 0.05)[14]。然而, 目前对于大菱鲆三倍体人工诱导参数的摸索尚不系统[11, 15], 给其规模化生产应用带来了较多不确定性。本研究拟针对这一问题, 通过单因子实验, 对大菱鲆三倍体人工诱导的参数进行优化, 并在此基础上扩大生产规模, 探讨其在规模化生产中的适用性, 为其商业化生产提供参考。
1 材料与方法 1.1 三倍体人工诱导参数筛选 1.1.1 精卵采集及人工授精本研究所用精卵采自威海圣航水产科技有限公司自国外引进的大菱鲆养殖群体。亲鱼(全长40~60 cm♀, 30~50 cm♂)营养强化后, 通过光、温调控等进行促熟。选择体表无伤、形态正常、性腺松软的成熟个体, 擦干鱼体后, 轻轻挤压腹部, 人工收集精卵, 镜检选取质量较好的精卵, 采用半干法按精卵1︰50的比例进行人工授精。受精卵在15.0±0.5℃海水中孵育, 处理前洗卵去除多余精液及卵巢液, 随后采用冷休克法进行三倍体人工诱导, 处理后受精卵仍放回15.0±0.5℃海水中孵育。各处理参数筛选实验中, 每次实验精卵来自同一雌雄亲本, 并选用不同雌雄亲本进行5次重复实验, 每次实验均有未处理的受精卵作为二倍体对照。对照组及各处理组各约5 000粒卵置于500 mL实验杯中, 所有实验杯浸在16 m3水体中以减少温度波动。
1.1.2 倍性鉴定方法筛选以倍性鉴定较为常用的染色体制片计数法、流式细胞仪检测DNA相对含量法及血红细胞体积测量方法对部分处理组和二倍体对照组样品进行倍性检测, 通过对其检测效果的比较筛选最适的倍性鉴定方法。
随机选取100~200粒下包1/2左右的原肠期胚胎, 采用染色体制片计数法测定其倍性。染色体制片的方法参考尤锋和刘静[16]的报道。随机采取50尾初孵仔鱼, 采用流式细胞仪检测DNA相对含量的方法进行倍性鉴定。流式细胞仪样品制备及方法参考吴志昊等的报道[17]。同时进行血细胞涂片观察比较其红细胞体积:取二倍体和三倍体大菱鲆鱼苗各10尾, 采集尾静脉血, 肝素钠抗凝后涂片, 10% Giemsa染色后晾干, 显微镜下观察拍照, 每张照片随机选取30个血细胞, 计算细胞体积。
1.1.3 诱导参数优化 1.1.3.1 处理起始时刻参考Piferrer等的报道[15]以及我们前期预实验结果, 设置5个处理起始时刻梯度, 分别为授精后4、5、6、7、8 min(4、5、6、7、8 mpf)。处理温度设为–2~–1℃, 处理持续时间设为25 min。处理后, 受精卵逐渐升温至15.0±0.5℃继续孵育, 计算各处理组的受精率和孵化率, 并测定其诱导率, 比较筛选最适处理起始时刻。
1.1.3.2 处理温度根据处理起始时刻筛选结果, 将处理起始时刻设为6 mpf。参考Piferrer等的报道[15]以及我们前期预实验结果, 设置5个处理温度梯度, 分别为–4~ –3℃、–3~–2℃、–2~–1℃、–1~0℃、0~1℃。处理持续时间设为25 min。处理后, 受精卵逐渐升温至15.0±0.5℃继续孵育, 计算各处理组受精率和孵化率, 并测定其诱导率, 比较筛选最适处理温度。
1.1.3.3 处理持续时间根据处理起始时刻和处理温度筛选结果, 将处理起始时刻设为6 mpf, 处理温度设为–2~–1℃。参考Piferrer等的报道[15]以及我们前期预实验结果, 设置5个处理持续时间梯度, 分别为12.5、25、37.5、50、62.5 min。处理后, 受精卵逐渐升温至15.0±0.5℃继续孵育, 计算各处理组受精率和孵化率, 并测定其诱导率, 比较筛选最适处理持续时间。
1.2 大菱鲆三倍体规模化诱导 1.2.1 精卵采集及人工授精规模化诱导所使用亲鱼为单因子实验同批亲鱼, 其培育、促熟及精卵采集方法同1.1.1部分。人工采取不同来源大菱鲆优质精卵共3批次, 每批次雌、雄鱼各3~5尾, 卵量为1400~1600 g, 按精卵1︰50的比例进行人工授精。
1.2.2 规模化诱导及孵育受精卵在15.0±0.5℃海水中孵育, 处理前洗卵去除多余精液及卵巢液, 随后在筛选得到的最适三倍体诱导条件下分批进行人工诱导, 处理后受精卵合并放回15.0±0.5℃海水中孵育, 受精卵置于16 m3水体中的1 m3生产用孵化网箱中以保证温度稳定, 各批次实验均设未处理的受精卵作为二倍体对照。受精卵及鱼苗参照大菱鲆养殖技术规范(NY/T-5153-2002)进行培育。
1.2.3 倍性鉴定及形态学跟踪倍性鉴定为初孵仔鱼期。取初孵仔鱼50尾, 采用流式细胞仪检测DNA相对含量的方法进行倍性鉴定并计算其诱导率。流式细胞仪样品制备及方法同1.1.2。同时, 对其中一批的处理组及二倍体对照组胚胎发育情况在体视镜下观察拍照进行跟踪比较。
1.3 数据分析诱导参数优化实验组及规模化诱导中的受精率、孵化率及诱导率的计算方法相同。二倍体对照组以及处理后的处理组各取出约500粒受精卵, 相同条件下孵育, 孵育水温为15.0±0.5℃。计算各组受精率、孵化率和诱导率:
受精率(%)=囊胚期上浮卵数/总上浮卵数×100%,
孵化率(%)=孵化后12h正常初孵仔鱼数/总上浮卵数×100%,
诱导率(%)=孵化后12h三倍体初孵仔鱼数/孵化后12 h正常初孵仔鱼数×100%,
为减少不同精卵来源及质量的差异导致的误差, 文中所述受精率与孵化率分别为相对受精率(处理组与二倍体对照组受精率的百分比)与相对孵化率(处理组与二倍体对照组孵化率的百分比)。
计算各组的平均值和标准差, 并使用SPSS16.0软件进行单因素方差分析及Duncan’s多重比较分析差异的显著性, 以P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 倍性鉴定方法的比较不同倍性鉴定方法对大菱鲆三倍体处理组及二倍体对照组进行倍性检测的结果见图 1。原肠期胚胎进行染色体制片计数中期分裂相染色体测定倍性与流式细胞仪检测DNA相对含量的结果进行比较发现, 两种方法测定的诱导率基本一致。二倍体红细胞的平均体积为21.54±1.75 μm3, 三倍体红细胞的平均体积为33.41±6.62 μm3。三倍体红细胞体积和二倍体的比值为1.55, 其倍性鉴定结果也与染色体制片及流式细胞仪结果一致。考虑染色体制片方法较为繁琐, 血红细胞体积测量方法可能受鱼龄、生理状态等因素的影响。故本研究后续实验中采用流式细胞仪法鉴定倍性及测定诱导率。
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| 图 1 大菱鲆二倍体对照组(a、c、e)和三倍体诱导组(b、d、f)的倍性检测结果 Fig. 1 Ploidy analysis of turbot in control diploid(a, c, e) and triploidinduction groups (b, d, f) 注: a、b, 染色体中期分裂相, 标尺长度5 μm; c、d, 流式细胞仪检测结果; e、f, 血细胞涂片结果, 标尺长度20 μm |
不同处理起始时刻、处理温度和处理持续时间对受精率、孵化率及诱导率的影响见图 2。处理起始时刻为4、5、6 mpf时, 其受精率、孵化率及诱导率基本一致。但处理起始时刻为7、8 mpf时, 其孵化率和诱导率开始下降。由于6 mpf处理的受精率、孵化率及诱导率相对较高, 因此认为6 mpf是最适处理起始时刻(图 2a)。处理温度结果显示, –2~–1℃以及–1~0℃受精率、孵化率和诱导率较高, 0~1℃处理虽受精率、孵化率也较高, 但其诱导率显著下降(P < 0.05), 综合考虑选择受精率、孵化率最高的–2~ –1℃作为最适处理温度(图 2b)。处理持续时间结果显示, 处理25~50 min均可得到较高的受精率、孵化率及诱导率, 而处理12.5 min和72.5 min其受精率、孵化率明显较低(P < 0.05), 其中处理12.5 min诱导率也较低, 因此选择处理25 min作为最适处理持续时间(图 2c)。
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| 图 2 大菱鲆三倍体诱导处理起始时刻(a)、处理温度(b)和处理持续时间(c)与受精率、孵化率及诱导率之间的关系 Fig. 2 Rates of fertilization, hatching, and induction under different initiation times (a), treatment temperatures (b), and treatment durations (c) in the induction of triploidy in the turbot Scophthalmus maximus 注:不同字母表示差异显著P < 0.05 |
在最适条件下(6 mpf, –2~–1℃, 处理25 min)对三批大菱鲆受精卵进行规模化处理。结果见表 1。对照组受精率为90.0%~94.0%, 孵化率为72.0%~82.8%;规模化诱导各批次相对受精率为88.2%~94.3%, 相对孵化率为87.7%~92.5%, 其诱导率为98~100%。对第1批次早期发育情况进行跟踪。三批规模化诱导大菱鲆, 孵化前分别将约1 000 g受精卵放入水泥池中孵化及培育, 培育获得平均体重3.93±0.75 g、3.24±0.55 g、4.06±0.82 g, 平均全长6.78±0.92 cm、6.14±0.88 cm、6.55±0.73 cm的鱼苗各89.04、55.4和64.5万尾。观察发现各发育时期处理组与二倍体对照组的胚胎形态基本一致(图 3), 但三倍体处理组畸形率稍高, 也导致了其孵化率的降低。二倍体对照组胚胎在15.0~15.5℃水温下约105 h破膜, 三倍体处理组与二倍体对照组孵化时间基本一致。
| 批次 | 卵量/ g | 相对受精率/% | 相对孵化率/% | 诱导率/% | 鱼苗数量/万尾 |
| 1 | 1 600 | 94.3 | 92.5 | 100 | 89.0 |
| 2 | 1 400 | 88.2 | 89.5 | 98 | 55.4 |
| 3 | 1 600 | 90.1 | 87.7 | 100 | 64.5 |
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| 图 3 大菱鲆三倍体规模化诱导组与二倍体对照组的胚胎发育情况 Fig. 3 Embryo development comparison of the turbot in triploid induction and control diploid groups 注: a-d, 二倍体对照组; e-h, 三倍体诱导组; a、e, 囊胚期; b、f, 原肠期; c、g, 克氏囊期; d、h, 初孵仔鱼; 标尺长度0.25 mm |
鱼类中三倍体人工诱导的方法主要分为三类。一是生物学方法, 通过不同种间的远缘杂交产生三倍体杂种, 目前多应用于鲤形目鱼类[18]。二是化学方法, 利用化学药品破坏微管或微丝结构, 进而抑制第二极体的排放得到三倍体, 但由于这些化学药品具有毒性, 目前已较少应用[19]。三是物理学方法, 也是目前鱼类三倍体人工诱导中应用最多的方法, 通过温度或压力休克抑制第二极体的排放得到三倍体。在鲆鲽鱼类中, 温度休克法被广泛应用于牙鲆[5]、半滑舌鳎[20]、大菱鲆[15]、条斑星鲽(Verasper moseri)[21]中, 在半滑舌鳎[6]、条斑星鲽[21]、美洲黄盖鲽(Limanda ferruginea)[22]中, 也有应用压力休克法进行三倍体人工诱导的报道。但实际生产中, 压力休克法受限于水压机压力腔的容量, 其处理效率相对较低, 目前仅在虹鳟、大西洋鲑等温度休克法诱导效果不稳定的鱼类中进行了应用[3, 19, 23]。而不受处理的受精卵数量限制, 操作简便并可大规模诱导的温度休克法更加适于商业化生产应用。
温度休克法诱导三倍体的三要素是处理起始时刻、处理温度、处理持续时间, 本研究同样围绕这三个要素进行诱导参数的摸索与优化。一般而言, 处理起始时刻是最重要的因素, 对诱导效果的影响最大。本研究中处理起始时刻筛选结果显示, 4~6 mpf处理均可得到较好的结果, 考虑让大菱鲆受精过程充分完全, 以及处理前洗卵所需时间, 故选择6 mpf作为最适处理起始时刻。而7、8 mpf处理其孵化率和诱导率显著下降(P < 0.05), 这可能是由于处理起始时刻较晚导致无法充分抑制第二极体排放所致。处理温度同样是重要的因素之一, 筛选结果显示, –4~0℃处理均可得到较高的三倍体率, 而0~1℃的处理强度不够, 无法完全抑制第二极体排放, 导致三倍体率的下降。同时, 较低的处理温度会对受精卵造成损伤, 这可能是–4~–2℃处理受精率和孵化率较低的原因。因此, 综合考虑选择了受精率、孵化率和诱导率相对较高的–2~–1℃作为最适处理温度。处理持续时间对诱导效果的影响相对较小, 筛选结果显示, 25~50 min处理可得到较好的结果。若处理持续时间太短(12.5 min), 则无法完全抑制第二极体排放, 导致诱导率下降; 而处理持续时间太长(62.5 min)则会对受精卵造成损伤, 导致受精率和孵化率的降低。故综合考虑, 选择受精率、孵化率和诱导率均较高, 且处理持续时间较短的25 min作为最适处理持续时间。大菱鲆三倍体诱导自2000年开始首先由Piferrer等开展了相关研究, 在孵育水温13~14℃下, 受精后5 min, 0℃处理20 min, 得到大菱鲆三倍体, 其三倍体率约为90%[11]。随后, 对三倍体诱导参数进行优化, 在孵育水温13~14℃下, 受精后6.5 min, –1~0℃处理25 min, 得到的大菱鲆三倍体诱导率可达100%[15]。这一诱导条件也得到较广泛的应用[12-14, 24], 但其相对成活率仅有60%, 也未开展严格的单因子实验来确定最适的处理条件。本研究针对这一问题, 根据已报道的诱导参数[15], 扩大条件范围设置单因子实验进行大菱鲆三倍体诱导条件的优化。本研究在15±0.5℃孵育条件下, 得到的大菱鲆三倍体诱导的最适处理参数为, 受精后6 min, –2~–1℃处理25 min, 与Piferrer等的研究结果基本一致[15], 但处理温度较低。由于本研究中孵育水温为15±0.5℃, 高于Piferrer等的报道(13~ 14℃), 故本研究较早的处理起始时刻(6 min)可认为与Piferrer等的结果(6.5 min)一致[15]。实际上, 最适处理起始时刻应当对应于胚胎的某一发育阶段。但胚胎发育常受到遗传背景以及水温等环境因素的影响, 导致胚胎发育速度出现差异。虽然三倍体诱导各参数范围要求并不十分严格, 如在牙鲆三倍体人工诱导实验中, 在受精后3~5 min时, 0~3℃下处理均可得到三倍体, 但其孵化率和诱导率存在一定的差异[5, 25-26]。这种差异放大到商业化生产中对经济效益的影响是十分可观的, 因此应尽量严格其诱导条件, 减少实验误差, 以提高其成活率及诱导率。在鲑鳟鱼类四倍体诱导中, 常使用第一次卵裂指数FCI或卵裂周期τ0作为决定处理起始时刻的基准, 来减少遗传或环境因素造成的误差[27-28]。这是否可应用于海水鱼类三倍体诱导以提高诱导参数的适用性值得进行深入研究。三倍体诱导条件存在物种特异性, 在不同物种中的处理起始时刻、处理强度和处理持续时间均存在较大差异。与其他鲆鲽鱼类三倍体诱导参数, 如牙鲆(5 mpf, 0~2℃, 45 min)[5]、半滑舌鳎(5 mpf, 4℃, 20 min)[20]、条斑星鲽(7 mpf, –1.5℃, 90 min)[21]相比, 大菱鲆三倍体处理温度相对较低, 与同为冷温性鱼类的条斑星鲽一致, 而低于暖温性鱼类的牙鲆和半滑舌鳎。人工诱导三倍体处理温度与其适温范围之间是否存在相关关系尚需结合更多研究结果综合分析。
人工诱导三倍体主要是由于其在生产性能上存在优势。Piferrer等对4~6月龄的三倍体大菱鲆的体长和体重与二倍体进行对比, 并未发现显著差异[11]。而Cal等对大菱鲆生长情况进行跟踪发现, 超过1龄, 三倍体的生长速度明显快于二倍体(P < 0.05); 24~48月龄间, 两者的平均体重相差11.4±1.9%[14]。同时, 由于三倍体雄性与雌性性腺都不能正常发育, 没有因性成熟和繁殖造成的死亡, 成熟期三倍体个体的成活率较高[14]。本研究中, 批量诱导获得的三倍体大菱鲆在早期尚未观察到与二倍体在生长发育方面存在明显的差异, 其生长、性腺发育情况等经济性状正在进行跟踪观察, 我们期望进一步明确其生产性能, 为商业化应用提供支持。
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