2019, Vol. 43
文章信息
- 黄津伟, 张天喆, 高燕, 吴弘, 高雨, 闫春财, 胡利莎. 2019.
- HUANG Jin-wei, ZHANG Tian-zhe, GAO Yan, WU Hong, GAO Yu, YAN Chun-cai, HU Li-sha. 2019.
- 基于种特异性PCR及线粒体基因标记的天津沿海牡蛎物种多样性研究
- Diversity of oyster species along coastal Tianjin based on Species-specific PCR and Mitochondrial genetic markers
- 海洋科学, 43(12): 89-96
- Marina Sciences, 43(12): 89-96.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190723001
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文章历史
- 收稿日期：2019-07-23
- 修回日期：2019-09-19
2. 天津市宝坻区第一中学, 天津 301800;
3. 天津渤海水产研究所, 天津 300221;
4. 中国科学院海洋研究所, 青岛 266071
2. No.1 Middle School of Tianjin Baodi District, Tianjin 301800, China;
3. Tianjin Bohai Fishery Research Institute, Tianjin 300221, China;
4. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China
牡蛎属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、牡蛎超科、牡蛎科, 是世界性广布种类, 因其重要的经济价值和营养价值而被人们所熟知。由于牡蛎贝壳形态受环境影响极大, 使得单纯依靠形态特征进行牡蛎分类出现很多问题, 同物异名和异物同名现象非常严重。最初, 我国学者将北方潮间带常见的一种贝壳较小、通常分布在高潮线和低潮线间的牡蛎鉴定为僧帽牡蛎(Ostrea cuccullata Born 178)[1]。后期多位学者对我国北方这种牡蛎种类进行了研究, 名称有褶牡蛎(Crassostrea plicatula)[2]、巨牡蛎未定种(C. sp)[3]及长牡蛎(C. gigas)[4]。王海艳等[5-6]结合形态学和分子生物学方法(核基因28SrRNA和线粒体基因16S rRNA、COI)对我国江苏、山东、辽宁等沿海典型海区潮间带的牡蛎进行了较为详细的研究, 结果表明这些海区的牡蛎与C. giga gigas聚为一支, 命名为长牡蛎, 支持李孝绪等[4]的结论。Wang等[6]通过对长牡蛎和福建牡蛎进行比较分析, 认为福建牡蛎应为长牡蛎的亚种, 分别定名为长牡蛎(C. gigas gigas)和福建牡蛎(C. gigas angulata)[7]。
天津市地处渤海湾西北部, 海岸线长153公里, 滩涂面积336 km2, 该海域潮汐为非正规半日潮, 滩涂坡度平缓, 泥沙底质, 水质肥沃, 为理想的底栖贝类增殖场。在距今5 000~6 000年前的全新世时期, 在复杂的海陆变迁及河流的共同作用下, 产生了大量的沼泽、盐沼和泻湖, 并形成了天津独特的贝壳堤、牡蛎礁等自然景观[8]。天津曾是中国东部沿海平原贝类最为发达的地区之一, 其贝壳堤、牡蛎滩规模大、连续性好, 层次清晰, 举世罕见, 是天津海陆变迁的重要产物和有力佐证, 为国际海洋学、地质学、地理学及生态环境的研究提供良好的环境材料, 具有重要的科学研究价值[9-10]。天津海区的牡蛎生物量大, 具有重要的经济及生态价值, 但是其种类组成未见有详细报道。
为了解天津沿海牡蛎的物种多样性情况, 本研究在天津沿海自南至北5个地点进行了系统采样, 在形态和分子生物学分析相结合的基础上, 对此海区牡蛎的种类组成和生物多样性进行了分析, 明确了此地区牡蛎的种类和分布情况, 以期为研究天津古牡蛎礁的种类组成、现生牡蛎资源状况及合理保护提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 样品采集与保存牡蛎调查区域为天津沿海(图 1), 遵循随机原则采集潮间带及牡蛎礁样本, 采样时不分大小。共采集约230个样品, 样品采集后活体运回实验室进行形态学特征及分子生物学研究。
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| 图 1 样品采集地点 Fig. 1 Map of sampling sites 注: A唐家河; B大神堂; C东疆港区; D季家堡村; E北疆电厂防波堤 |
观察并记录贝壳的各部分特征, 包括壳形、壳上鳞片情况、壳表面颜色、放射肋分布情况、韧带槽形状及大小、壳内面颜色、闭壳肌痕颜色及形状。通过形态特征对牡蛎进行初步鉴定。选取壳形态具有代表性的牡蛎样本, 对其外壳与内壳形态分别记录。测量样品壳长、宽、高、壳重、总重等参数。
1.3 基因组DNA的提取和目的基因PCR扩增从牡蛎闭壳肌中取出100mg组织, 使用试剂盒TIANamp海洋动物DNA提取试剂盒(北京天根生物有限公司), 按照说明操作提取组织DNA。
通过多重种特异性PCR(聚合酶链式反应)鉴定物种[11]。扩增使用引物包括外引物即COI通用引物LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT CA-3′)[12], 及5种巨牡蛎属牡蛎特异性引物(表 1)。
| 引物名称 | 特异性物种 | 引物序列 | 片段大小(bp) |
| LCO1490 | All | ||
| COCar183r | C. ariakensis | AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG(T)G | 183 |
| COCan222r | C. gigas angulata | AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG©G | 222 |
| COCgi269r | C.gigas gigas | TCGAGGAAATTGCATGTCTGCTACA(T)A | 269 |
| COChk387r | C. hongkongensis | GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG | 387 |
| COCsi546r | C. sikamea | AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC(A)C | 546 |
| HCO2198 | All | 697 |
PCR反应体系为25 μL, 其中包括外引物LCO1490和HCO2198各0.5 μL, 5种内引物各0.4 μL, 1.5μL DNA模板, 2×PCR master mix 12.5 μL, ddH2O 8 μL补足至25μL。循环参数如下:
PCR产物经加有Gelred染料的1%琼脂糖凝胶电泳, 然后用凝胶成像仪观察并拍照。
与已知牡蛎种类的基因条带在胶图中的位置进行比对, 将不能比对出结果的样品以及部分比对成功的样品进行重新PCR, 扩增用通用引物LCO1490和HCO2198。PCR反应体系为25 μL, LCO1490和HCO2198各0.5 μL, DNA模板1.5 μL, 2×PCR master mix 12.5 μL, ddH2O 10 μL补足至25 μL, PCR产物送生工生物科技有限公司进行序列测定。
1.4 数据统计及序列分析DNA序列结果由CLUSTAL X软件[13]采用默认参数比对, 然后经人工校对, 校对后的序列输入NCBI进行序列比对, 确定物种种类。自NCBI下载比对相近种的序列(表 2), 用于遗传距离和系统发育树的计算和构建。
| 牡蛎种名 | 序列登记号 |
| 长牡蛎Crassostrea gigas gigas | KP099018 |
| 福建牡蛎Crassostrea gigas angulata | KP216805 |
| 熊本牡蛎Crassostrea sikamea | HQ661018 |
| 电白牡蛎Crassostrea dianbaiensis | LC120781 |
| 香港牡蛎Crassostrea hongkongensis | KP734088 |
| 近江牡蛎Crassostrea ariakensis | FJ743527 |
| 密鳞牡蛎Ostrea denselamellosa | KP067908 |
| 猫爪牡蛎Talonostrea talonata | KX364277 |
| Saccostrea kegaki | KP067909 |
模型HKY+I+G为ModelTest 3.7[14]软件选择的最佳替代模型。该模型构建最大似然(ML)树和贝叶斯(BI)树, 将密鳞牡蛎Ostrea denselamellosa和Saccostrea kegaki作为外群。BI树用MrBayes3.2[15]软件构建, 采用nst=6, rates=gamma参数, 运行1000万代, 每10000代抽样一次, burn-in设置为25%, 根据剩余样本构建BI树。ML树在线(http://www.atgcmontpellier.fr/phyml/)构建, 参数值与ModelTest3.7的筛选结果一致。
基因序列的碱基组成以及物种两两之间的Kimura 2-parameter遗传距离使用Mega 7[16]计算。
2 结果与分析 2.1 形态分析结果基于形态特征, 本次采集的样品初步鉴定为两种:长牡蛎和猫爪牡蛎(图 2)。长牡蛎:贝壳呈长条形; 背腹缘几乎平行, 壳长为壳高的3倍左右; 左壳深陷, 鳞片粗大, 壳顶固着面小; 右壳较平, 环生鳞片呈波纹状, 排列稀疏, 层次少, 放射肋不明显; 壳表面淡紫色、灰白色或黄褐色; 壳内面白色、瓷质样; 壳顶内面有宽大的韧带槽; 闭壳肌痕大, 马蹄形。猫爪牡蛎:贝壳较小、呈扁平状, 壳质较薄; 左壳壳顶腔较深, 有5~8条放射肋, 在壳的边缘形成爪状, 肋上有少数棘; 贝壳内部边缘没有嵌合体。
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| 图 2 天津地区牡蛎样品图 Fig. 2 Shell morphology of the specimens sampled from Tianjin 注: A:长牡蛎样品, B:猫爪牡蛎样品 |
天津牡蛎样品的形态学特征如表 3所示。结果表明天津沿海长牡蛎相对呈中等大小、肉质偏瘦; 而猫爪牡蛎形态特征明显, 大小与我国南北沿海其他地区的猫爪牡蛎相一致。
| 地点 | 物种 | 长/cm | 宽/cm | 高/cm | 总重/g | 壳重/g | 肉重/g |
| 北疆电厂防波堤 | 长牡蛎 | 3.82 | 2.15 | 1.32 | 8.47 | 6.76 | 1.53 |
| 唐家河 | 长牡蛎 | 4.21 | 2.33 | 1.26 | 8.31 | 6.51 | 1.47 |
| 东疆港区 | 长牡蛎 | 4.62 | 3.02 | 1.46 | 9.32 | 7.20 | 1.67 |
| 季家堡村 | 长牡蛎 | 3.96 | 2.11 | 1.30 | 8.33 | 6.12 | 1.34 |
| 汉沽大神堂 | 长牡蛎 | 5.48 | 2.7 | 1.85 | 27.52 | 22.11 | 4.88 |
| 猫爪牡蛎 | 1.25 | 0.46 | 2.25 | 3.11 | 2.01 | 0.79 |
利用种特异性PCR可以对巨蛎属几种常见牡蛎进行准确鉴别[11]。结果表明, 天津大神堂牡蛎有长牡蛎(图 3, 6~18)和未定种(即猫爪牡蛎, 图 3, 19-21), 其余采样点的牡蛎均为长牡蛎C. gigas gigas。
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| 图 3 天津地区牡蛎种特异性PCR图 Fig. 3 Species-specific PCR of the oysters sampled from Tianjin 注: M: marker; 1:近江牡蛎; 2:福建牡蛎; 3:长牡蛎; 4:香港牡蛎; 5:熊本牡蛎; 6-21:天津地区牡蛎 |
对鉴定出的长牡蛎部分样品和所有猫爪牡蛎的样品进行PCR扩增及序列测定。所得序列人工校对后, 与NCBI比对, 结果表明所测牡蛎确实为长牡蛎和猫爪牡蛎, 支持种特异性PCR和形态学鉴定的结果。基于COI序列用Mega7软件计算的物种之间的遗传距离如表 3所示, 结果表明, 一种牡蛎与长牡蛎之间的遗传距离为同一种内水平的差异, 支持种特异性PCR和形态学鉴定的结果。另一种牡蛎与猫爪牡蛎之间的遗传距离为同一种内水平的差异, 表明其为猫爪牡蛎, 与形态学初步鉴定的结果一致。长牡蛎与猫爪牡蛎种间遗传距离为0.217~0.232, 种内、种间遗传距离未发生重叠, DNA间隙明显。
3 讨论 3.1 天津沿海牡蛎物种多样性经过贝壳形态特征和COI基因鉴定, 天津沿海分布的牡蛎有长牡蛎和猫爪牡蛎两种, 说明该海区牡蛎物种丰富度低。
长牡蛎为我国北方优势种, 且为天津沿海的优势种。目前研究发现长牡蛎分布的最南端至江苏省泰州海安县, 该种在潮间带及浅海的岩礁上天然分布, 以其左壳固定在岩石上, 栖息密度较高, 生长力强[5]。因其肉味鲜美、营养丰富, 而具有较高的经济价值, 是我国北方主要的海洋贝类养殖种之一[17], 已经在很多地区得到养殖, 如威海、青岛、日照、东营、唐山等沿海地区, 其中威海地区养殖规模较大。
猫爪牡蛎为广温广布种, 在我国北方沿海如青岛、辽宁[4]和南方沿海如广东、广西、海南[18-20]均有分布, 且在广西生物量大, 为牡蛎优势种之一。李孝绪等[4]根据解剖结构把猫爪牡蛎归为一单独的属—爪蛎属Talonostrea。本研究通过对多种巨牡蛎属牡蛎和猫爪牡蛎的形态及分子遗传距离等分析, 表明猫爪牡蛎嵌合在亚洲的巨蛎属和美洲的巨蛎属之间, 应该归为巨蛎属, 这一结果与Li等[21]观点一致, 将猫爪牡蛎归为巨蛎属Crassostrea, 拉丁名订正为Crassostrea talonata。该牡蛎多固着于潮下带浅水区石块及养殖笼上, 因此除大神堂牡蛎礁外, 在其余4个潮间带海区未采集到。猫爪牡蛎在我国南北沿海均有分布, 且形态特征变化较大, 结合本次采集的样品, 我们有必要对其地理分布及群体遗传学等进行深入地研究。
| 物种 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 20 | |
| 1 | HI | |||||||||||||||||||
| 2 | H2 | 0.002 | ||||||||||||||||||
| 3 | H3 | 0.002 | 0.003 | |||||||||||||||||
| 4 | H4 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | ||||||||||||||||
| 5 | H5 | 0.002 | 0.003 | 0.003 | 0.005 | |||||||||||||||
| 6 | H6 | 0.005 | 0.007 | 0.007 | 0.008 | 0.007 | ||||||||||||||
| 7 | H7 | 0.002 | 0.003 | 0.003 | 0.005 | 0.003 | 0.007 | |||||||||||||
| 8 | H8 | 0.002 | 0.003 | 0.003 | 0.005 | 0.003 | 0.007 | 0.003 | ||||||||||||
| 9 | H9 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 0.007 | 0.005 | 0.008 | 0.005 | 0.005 | |||||||||||
| 10 | H10 | 0.002 | 0.003 | 0.003 | 0.005 | 0.003 | 0.007 | 0.003 | 0.003 | 0.005 | ||||||||||
| 11 | Hll | 0.219 | 0.217 | 0.222 | 0.224 | 0.222 | 0.227 | 0.219 | 0.217 | 0.219 | 0.222 | |||||||||
| 12 | C. gigas gigas | 0.002 | 0.003 | 0.003 | 0.005 | 0.003 | 0.007 | 0.003 | 0.003 | 0.005 | 0.000 | 0.222 | ||||||||
| 13 | C. gigas angulata | 0.029 | 0.031 | 0.027 | 0.029 | 0.031 | 0.034 | 0.031 | 0.031 | 0.032 | 0.031 | 0.225 | 0.031 | |||||||
| 14 | C. ariakensis | 0.166 | 0.166 | 0.166 | 0.166 | 0.164 | 0.173 | 0.166 | 0.168 | 0.161 | 0.168 | 0.231 | 0.168 | 0.176 | ||||||
| 15 | C.dianbaiensis | 0.194 | 0.194 | 0.192 | 0.194 | 0.192 | 0.192 | 0.192 | 0.192 | 0.199 | 0.196 | 0.215 | 0.196 | 0.192 | 0.165 | |||||
| 16 | C. sikamea | 0.118 | 0.118 | 0.116 | 0.118 | 0.116 | 0.121 | 0.116 | 0.121 | 0.118 | 0.116 | 0.200 | 0.116 | 0.110 | 0.169 | 0.181 | ||||
| 17 | C. hongkongensis | 0.142 | 0.142 | 0.144 | 0.142 | 0.144 | 0.148 | 0.142 | 0.144 | 0.142 | 0.144 | 0.206 | 0.144 | 0.151 | 0.152 | 0.177 | 0.152 | |||
| 18 | T. talonata | 0.224 | 0.222 | 0.227 | 0.229 | 0.227 | 0.232 | 0.224 | 0.222 | 0.224 | 0.227 | 0.007 | 0.227 | 0.229 | 0.236 | 0.219 | 0.207 | 0.211 | ||
| 19 | O. denselamellosa | 0.292 | 0.292 | 0.290 | 0.292 | 0.290 | 0.292 | 0.290 | 0.295 | 0.287 | 0.295 | 0.299 | 0.295 | 0.298 | 0.295 | 0.269 | 0.277 | 0.305 | 0.302 | |
| 20 | S. kegaki | 0.312 | 0.309 | 0.309 | 0.318 | 0.309 | 0.312 | 0.312 | 0.309 | 0.312 | 0.315 | 0.305 | 0.315 | 0.312 | 0.304 | 0.299 | 0.323 | 0.300 | 0.313 | 0.264 |
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| 图 4 天津地区牡蛎及相关物种系统发育树 Fig. 4 Phylogeny tree of oysters from Tianjin and related species from GenBank 注:图中所示为BI树结构, ML树的拓扑结构与BI树基本一致。支上数值表示贝叶斯概率和后验概率值> 0.5/50 |
本研究调查的野生牡蛎个体相对都偏小、肉质较瘦。推测可能是因为采样区域环境变化及人类活动如过量采捕、堤坝构建、填海等对牡蛎的生长产生影响, 进而导致其生长发育受到影响。
3.2 种特异性PCR在天津沿海牡蛎研究中的应用Wang等[11]筛选的种特异性PCR引物对巨蛎属几种常见牡蛎, 即长牡蛎、福建牡蛎、香港牡蛎、近江牡蛎和熊本牡蛎可进行快速准确地鉴别, 但对于分类地位特殊的猫爪牡蛎不适用, 鉴于猫爪牡蛎在我国也是广分布种, 我们认为后期研究如果能够进一步筛选适合猫爪牡蛎的快速鉴定标记, 将会提高分子生物学在分类学研究中的作用。
3.3 牡蛎在生态环境中的作用牡蛎作为潮间带常见的贝类, 通常会聚集生长, 形成一种特殊的海洋生境——牡蛎礁, 其在净化水体、提供栖息生境、促进渔业生产、保护生物多样性和耦合生态系统能量流动等方面均具有重要的生态功能[22]。牡蛎常被选择为环境污染的指示生物, 因为其会在软体部分积累高浓度的重金属和有机污染物[23]。有学者对天津大神堂浅海区的水下活牡蛎礁资源进行了调查[24], 结果表明该区活牡蛎资源由3个分散的礁体组成, 总面积仅约3 km2, 礁体最大厚度1.2 m, 平均厚度0.6 m; 调查区海底地形平坦, 水深介于3.4~ 5.6 m之间, 因受人类活动严重破坏, 仅在有礁体发育的局部范围内有高程约1m的起伏波动, 说明对保护牡蛎礁的保护迫在眉睫。本研究仅采集了沿岸的牡蛎, 发现牡蛎物种多样性单一。以前研究报道表明, 在牡蛎礁中有近江牡蛎的分布, 但是本次研究没有发现此种的存在, 因此我们认为进一步对牡蛎礁上物种种类进行详细调查分析, 能够更全面的反映当地牡蛎种类多样性。
4 结论通过本研究, 发现天津沿海牡蛎的物种多样性比较低, 与前期研究结果相比没有发现近江牡蛎, 可能与人类活动影响密切相关。无论从本研究结果, 还是前期研究的发现, 我们可以看出, 人类活动对牡蛎的野生生境都产生了严重的影响, 呼吁大家在利用海洋资源的同时要更加注意对海洋资源的保护。
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