鱼粉对于水产养殖动物的特殊性作用一直是动物营养与饲料研究的热点和难点问题, 而较多的研究报告显示, 鱼粉作为一种海洋动物蛋白质原料, 在水产动物日粮中具有不可替代性或特殊性^{[1, 2]}。从营养学与生理学方面考虑, 鱼粉为什么具有特殊性而不可替代？这种特殊性是鱼粉作为蛋白质原料的营养作用, 还是鱼粉中含有的特殊成分所产生的生理代谢作用？与含有鱼粉的日粮比较, 无鱼粉日粮对水产动物的生长性能、尤其是生理代谢途径会产生怎样的影响？这些影响的作用位点在哪里？作用的途径是哪些？传统上选用不同的蛋白质原料、通过养殖试验来研究鱼粉的替代效果不能解决鱼体生理代谢存在的问题, 现代组学技术和研究方法为这方面的研究提供了很好的方法和思路。作者以黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)为试验对象, 在池塘网箱中分别用鱼粉日粮和无鱼粉日粮饲养70 d后, 通过鱼体肝胰脏转录组的测定结果, 对鱼粉日粮对黄颡鱼不同的生理代谢途径、尤其是在基因表达水平上具有显著差异表达的代谢途径的分析, 期望揭示日粮鱼粉对黄颡鱼生理代谢的作用位点、作用途径以及作用结果等深层次的问题, 以及从摄食无鱼粉日粮后, 鱼体生理代谢响应方面来认知日粮鱼粉的生理作用和存在的营养学与生理学问题, 为水产动物日粮营养素供给和鱼粉使用技术提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 试验设计与饲料制作

鱼粉为秘鲁生产的超级蒸汽鱼粉, 其原料鱼主要为秘鲁鳀(Peruvian anchovy)。

按照等氮、等脂、等磷进行黄颡鱼试验日粮的配方设计, 配方见表 1。鱼粉组(对照组, FM)含有28%的鱼粉, 无鱼粉组(试验组, NF)以鸡肉粉(美国Tyson)、棉籽蛋白(新疆泰昆)、大豆浓缩蛋白(河南曙光)作为蛋白质原料。以磷酸二氢钙平衡试验配方总磷含量, 以混合油脂(鱼油︰磷脂油︰豆油=1︰1︰2)平衡试验日粮中脂肪含量。

按照吴代武^[3]的方法, 原料粉碎后过60目筛, 按照表 1的配方进行日粮原料的配合。各类原料用混合机混合均匀后, 用华祥牌HKj200制粒机加工制成直径1.5 mm, 长3~5 mm的颗粒饲料。颗粒饲料采用自然风干的方式风干, 在–20℃密封保存备用。测定试验日粮化学组成结果见表 1, 日粮粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、总磷、总能在FM组和NF组无显著差异。

1.2 试验鱼体

试验用黄颡鱼幼鱼购自浙江省湖州农业合作社, 以鱼粉组日粮在网箱中驯养2周后分组。选取规格整齐、平均质量为(12.02±0.11)g的黄颡鱼种360尾, 0.3%食盐溶液浸泡15 min消毒后, 随机分成2组, 每组设4个重复(n=4), 共8个试验单元(网箱), 每个网箱投放45尾黄颡鱼。

1.3 饲养管理

养殖试验在浙江一星集团海盐养殖基地的池塘网箱中进行。在面积为40 m×60 m的池塘中设置试验网箱(网箱规格为长1.5 m×宽1.5 m×深2.0 m)8个, 以海盐县长山河河水为水源。参照吴代武^[3]等方法, 日投喂量为试验鱼体质量的3%~5%, 日投喂两次(5:30~7:00, 17:00~19:00), 两餐日粮的投喂比例为4︰6。每10 d估算1次鱼体增质量, 调整试验日粮投喂量, 正式投喂70 d。

1.4 样品采集

参照吴代武^[3]等方法, 试验开始时, 随机抽取黄颡鱼6尾, 作为初始样本进行全鱼常规体成分分析。养殖70 d后, 停食24 h采样: (1)对每个网箱黄颡鱼进行称质量、计数, 用于计算成活率、特定生长率和饲料系数; (2)从3个网箱随机抽取3尾、每组9尾鱼保留全鱼样品, 用于体成分测定, 并计算蛋白质沉积率、脂肪沉积率; (3)从每个网箱随机取10尾鱼, 尾静脉采血、静置1 h后3 500 r/min离心10 min。每个网箱鱼血样混合为1个样品、每组4个血清样品, 液氮速冻后于–80℃冰箱保存待测用于血清化学组成分析。

冰盘上解剖鱼体, 采集每个网箱3尾、每个组为12尾黄颡鱼的肝胰脏, 液氮速冻运回实验室用于总RNA的提取。

1.5 样品分析

参照周露阳等^[4]方法, 每个网箱随机抽取3尾全鱼, 合并后搅碎、均质作为全鱼样品。之后取部分全鱼样品, 采用LGJ-18B型冷冻干燥机干燥至恒重用于测定水分含量。所有样品蛋白质(N×6.25)采用凯氏定氮法(ISO 5983-1997)测定; 脂肪酸含量用石油醚索氏抽提法(AOCS Ba 3-38)测定; 用马弗炉(ISO 5984-2002)测定灰分; 采用分光光度法(ISO 6491- 1998)测定日粮总磷的含量; 日粮能量采用XRY-1C型氧弹式热量计测定。

血清样本采用雅培C800全自动生化分析仪测定血清生化成分分析谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总胆红素、总蛋白、葡萄糖、胆固醇和甘油三酯等含量。

按照叶元土等^[5-9]方法, 每尾鱼分别提取肝胰脏总RNA, 电泳检测RNA质量, 选取电泳条带亮度高、清晰、无拖尾的高质量RNA进行等量混合。鱼粉组、无鱼粉组各2个总RNA样本(每个样本至少有5尾试验鱼的总RNA样本组成), RNA质量大于4 μg。

总RNA样本经过RNA-Seq、无参转录组转录本拼接后进行基因功能注释。用于无参转录组转录本拼接的读段长度150 bp。用于转录本基因注释的数据库包括SwissProt、KOG、KEGG GENES序列数据库。基因注释结果主要用于无鱼粉组与鱼粉组结果的差异表达分析, 并进行GO条目和KEGG通路统计分析。对于所有基因, 当其表达量在无鱼粉组、鱼粉组两个不同样品间具有差异、且统计分析中P值(假阳性率) < 0.05时, 认为其在两个不同样品中具有显著差异表达。依据基因在样本中的表达量, 先计算无鱼粉组中与鱼粉组表达量的倍数, 在计算以2为底、差异表达倍数的对数值, 即log₂(NF/FM)值。log₂(NF/FM)值为负值为差异表达下调, 正值为差异表达上调。

以GO BP、GO CC、GO MF条目和KEGG Pathway为单位, 应用超几何检验, 找出与整个基因组背景相比、在差异表达基因中显著性富集的条目、Pathway, 以corrected P-value≤0.05为阈值, 满足此条件的定义为在差异表达基因中显著富集的GO条目、KEGG路径。

1.6 数据分析

参照吴代武^[3]等方法, 原始数据经Excel 2003初步整理后, 用SPSS 19.0进行单因素方差分析(One- Way ANOVA), 事后进行Duncan氏多重比较, 分析试验数据的差异显著性, 结果以平均值±标准差(mean±S.D.)表示, 以P < 0.05为差异显著水平。

2 试验结果 2.1 黄颡鱼的生长性能

由表 2可见, 相对鱼粉组, 无鱼粉组黄颡鱼的生长速度则显著下降了30.25% (P < 0.05);无鱼粉组的饲料系数显著增加了83.94%(P < 0.05)。无鱼粉组的成活率和鱼粉组没有显著差异(P > 0.05);蛋白质沉积率下降了57.05%, 脂肪沉积率下降了54.45%。结果表明, 无鱼粉日粮导致黄颡鱼的生长速度显著下降; 饲料效率显著降低。

2.2 鱼体常规组成

鱼体常规组成可见表 3, 无鱼粉组黄颡鱼干物质、粗蛋白、粗脂肪含量均下降, 灰分含量增加, 其中脂肪含量下降达到显著性差异(P < 0.05)。表明摄食无鱼粉日粮后, 黄颡鱼鱼体水分含量增加, 而营养物质的积累量则降低。

2.3 鱼体血清生化指标

鱼体血清生化指标可见表 4。无鱼粉组的谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量显著高于鱼粉组(P < 0.05), 鱼体肝细胞通透性增加, 肝细胞受到损伤。无鱼粉组的总胆红素、总蛋白、胆固醇和葡萄糖的含量与鱼粉组比较有下降的趋势, 但无显著差异(P > 0.05);无鱼粉组的甘油三酯含量显著低于鱼粉组(P < 0.05)。结果表明, 摄食无鱼粉日粮70 d后, 黄颡鱼肝胰脏受到损伤; 血清营养物质浓度下降, 其中血清甘油三酯为显著下降, 这可能导致鱼体脂肪含量显著下降。

2.4 显著差异表达的基因数

无鱼粉组与鱼粉肝胰脏转录组基因经过统计分析(表 5), 总计有12 020个基因差异表达, 其中差异表达上调的基因有5 020个、差异表达下调的基因有7 000个, 差异表达的基因数量很大。在具有差异表达的基因中, 依据log₂(NF/FM)的绝对值大于2(具有显著差异)、并进行分段统计结果见表 5。具有显著差异表达上调的基因数为1 013个基因、下调的基因数为2 749, 显著差异表下调基因数远大于上调基因数。

2.5 转录组GO分类结果

将经过GO注释的差异表达基因进行分类, 在细胞组成(cellularcomponent, CC)、生物过程(biologicalprocess, BP)和分子功能(molecularfunction, MF) 3个一级条目下的二级条目(Term)中, 上调和下调的基因数统计见表 6。

在细胞组成中, 基因表达受影响最大的是细胞、细胞器和膜的组成, 其中细胞部分有超过50%的基因差异表达下调, 细胞器和细胞器部分合计也有60%左右的基因差异表达下调。在生物过程中, 细胞过程受影响较大, 有19.52%差异表达上调基因、44.39%差异表达下调基因, 其次为代谢过程、生物调节、对刺激的反应、细胞成分组织或生物发生、发展过程等受影响较大。在分子功能中, 受影响最大的是结合, 有18.27%基因差异表达上调、44.76%的基因差异表达下调, 其次为催化活性、分子功能调节剂等。

这些结果表明, 摄食无鱼粉日粮70 d后, 鱼体细胞的组成、细胞代谢过程和分子功能方面均受到了重大的影响, 可能导致了细胞组织结构与功能的重大改变。在差异表达上调与下调的基因比例看, 多数是差异表达下调。因此, 无鱼粉日粮可能更多地是对细胞组成、细胞过程等产生不良的影响。

2.6 转录组KEGG通路分类结果

KEGG通路是将具有显著差异表达的基因, 依据KO注释结果按照KEGG pathway进行分类。结果见表 7。有细胞衰老、蛋白质消化吸收、轴突导向、趋化因子信号通路、MAPK信号通路等共15个代谢通路的基因显著差异表达, 且这些通路中, 均是差异表达下调的基因数大于差异表达上调的基因数。

依据表 7的信息, 黄颡鱼摄食无鱼粉日粮70 d后, 其肝胰脏转录组KEGG通路差异基因表达可以得到以下结果:无鱼粉日粮对黄颡鱼生理代谢的作用位点主要集中在几个重要的信号通路、神经分泌与调控系统, 作用方式表现为对信号通路、神经分泌与激素调控系统形成较大的干扰。这些信号通路主要为细胞增殖与分化(细胞衰老、癌症中的微小RNA通路、PI3K-Akt信号通路、ErbB信号通路)、炎症因子产生与抗炎症因子(趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TRP通道的炎症介质调节)、激素调控(GnRH信号通路、胰岛素信号通路)和蛋白质消化吸收、糖代谢等, 显示对细胞增殖、分化的负面影响, 并引起炎症介质产生与传导、免疫防御反应等生理响应。尤其是引起神经系统(轴突导向)、下丘脑激素调控系统(GnRH信号通路、5-羟色胺能突触)、胰腺分泌系统等的重大变化; 无鱼粉日粮对黄颡鱼作用结果主要表现为对细胞损伤增强, 损伤作用的路径主要为细胞炎症因子传导; 鱼体的生理响应主要为抗炎症反应、清除损伤的细胞和蛋白质等成分、免疫防御系统结构损伤和能力的下降, 在鱼体可能出现抗应激能力下降、抗病力下降等表象; 对日粮蛋白质消化吸收(蛋白质消化吸收)、胰腺分泌、胰高血糖素(胰岛素信号通路、胰岛素信号通路、胰高血糖素信号通路)系统等产生重大不利影响, 降低了鱼体对日粮营养物质利用能力, 鱼体沉积的营养物质减少、生长速度降低。

2.7 极显著差异表达的部分基因

以log₂值的绝对值大于5、GO BP注释结果和KO注释结果的基因信息统计列入表 8, 显示极显著差异表达的单一基因。可以得到以下结果: (1)涉及到细胞增殖、分化, 尤其是细胞吞噬、神经细胞突触发育的基因极显著的差异表达、且为差异表达下调; (2)涉及到细胞免疫、体液免疫的多数基因差异表达下调, 显示鱼体免疫防御系统能力具有下降的趋势; (3)参与细胞或组织中蛋白质泛素化标记和降解的基因极显著地差异表达, 清除损伤的细胞组成物质如蛋白质的作用增强。

黄颡鱼摄食无鱼粉日粮70 d后, 肝胰脏转录组中极显著差异表达的基因信息提示, 鱼体自身的免疫防御系统的结构与功能发生重大变化, 且为下调的趋势; 鱼体多数细胞受到衰老、吞噬的生理代谢变化, 激活细胞自我修复、清除变性蛋白质等生理变化; 同时, 鱼体消化能力有下降的趋势。这与生长性能下降、鱼体营养物质含量下降的结果有一致性。

3 讨论 3.1 无鱼粉日粮对黄颡鱼的生长性能和生理代谢产生了重大影响

周歧存^[10]、吉红^[11]等总结了水产动物饲料中鱼粉替代的研究情况, 多数研究结果表明水产动物饲料中鱼粉被植物蛋白、陆生动物蛋白或单细胞蛋白替代后, 鱼体生长速度下降、饲料效率降低, 鱼体免疫能力下降, 肝细胞受到损伤、肠道黏膜受到损害等^{[1-2, 10-11]}。本试验结果与这些研究结果基本一致。与鱼粉组比较, 无鱼粉组黄颡鱼的特定生长率显著下降了30.25%、饲料系数显著增加了83.94%。试验结束时, 黄颡鱼鱼体粗蛋白、粗脂肪、灰分等含量下降, 其中鱼体粗脂肪含量显著下降。鱼体血清总蛋白、血糖、血脂(甘油三酯)含量下降, 其中血脂含量显著下降; 而血清转氨酶活力显著增加, 显示肝胰脏受到损伤。

依据试验结束时鱼体肝胰脏转录组分析结果中GO注释分类、KEGG注释分类结果显示, 无鱼粉日粮诱导了较多的生理代谢通路基因差异表达多数为差异表达下调。本文试验结果表明, 无鱼粉日粮使黄颡鱼的生长性能显著下降, 鱼体营养物质的沉积量减少, 对鱼体神经系统发育与神经细胞分泌、激素调控系统、炎症与抗炎症、免疫防御等多方位的影响。可以认为, 无鱼粉日粮对黄颡鱼生理代谢的影响是多方面、深层次的整体性的影响, 且是不利的影响。

3.2 日粮中鱼粉不仅有营养作用, 还有生理代谢的调控作用

在两个饲料配方中, 仅有28%鱼粉的差异, 日粮的总蛋白、总脂肪、总能量和总磷是一致的, 日粮对黄颡鱼的生长性能和生理代谢作用为什么会有这样大的差异, 是需要研究和讨论的问题。需要从鱼粉的营养作用和生理活性作用两个方面来理解饲料原料、日粮的作用。

从鱼粉的营养作用来分析, 蛋白质和氨基酸、脂肪和脂肪酸、糖类、维生素和矿物质等营养素在几乎所有的生物性饲料原料存在, 而不同饲料原料中差异除了营养素的百分含量的差异外, 就是氨基酸的组成模式、脂肪酸的组成模式、不同营养素之间的组成模式。饲料原料或饲料中营养素的组成模式与养殖动物需要的营养素组成模式越接近, 则营养素的平衡性越好, 对养殖动物的生长效果越显著。鱼粉作为来自于海洋鱼类的代表性原料, 在营养素的组成模式如氨基酸组成模式、消化利用率等方面具有优势, 这是鱼粉优于其他饲料原料的主要优势。然而, 仅仅是在营养素方面的优势不足以对养殖动物生产性能产生如此大的差异, 应该是含有对养殖动物生理代谢产生重大影响的物质存在, 并且对养殖动物的生理代谢产生了积极的影响, 并结合在营养素中的优势而成为养殖动物、尤其是水产养殖动物饲料中具有特殊性的饲料原料, 成为一类不可替代的动物蛋白质原料。对于鱼粉的这些特殊活性分子, 作者进行了离体细胞试验, 分离排除, 推测究竟可能属于哪类物质, 结果将另文发表。

有研究指出, 日粮中、尤其是鱼粉中氨基酸可以通过氨基酸受体信号通路和TOR信号通路促进蛋白质的合成^{[1, 12-13]}。本试验中, 这2个代谢通路没有显著差异表达, mTOR(serine/threonine-protein kinase mTOR) log₂(NF/FM)值–0.3238, 没有达到显著差异水平。Regulatory-associated protein of mTOR的log₂(NF/FM)值–1.39、eif-2-alpha kinase GCN2的log₂(NF/FM)值–0.4130。生命起源于海洋, 鱼粉作为海洋动物蛋白质原料, 还有海洋生物的一些成分, 而这些成分应该是水产动物所必需的, 也是其他陆生动物性饲料原料和植物性原料所不具备的。是一类什么特殊物质目前还是未知的, 一些学者称之为“未知生长因子”。可以推测的是:这类物质含量不会很高、且来源于海洋生物。这些物质有什么作用目前也不清楚。如果含量不高、作用又很大, 可以推测的是, 这类物质应该是能够对水产动物生理健康维护、生理代谢调控产生良好的作用, 只有如此才能放大日粮中鱼粉对水产动物生产性能、生理健康的作用效果。

作者之前的研究发现用酶解的鱼溶浆(粉)、酶解的鱼浆等产品替代鱼粉, 在草鱼(Ctenopharyngodon idellus) ^{[14, 15]}、黄颡鱼^[16-17]日粮中试验, 其养殖效果优于鱼粉。尤其是以10%水分含量计的酶解鱼溶浆, 在黄颡鱼日粮中仅仅8%~9%的添加量达到了与28%和30%的鱼粉等效的结果^[17]。这些结果表明, 来自于海洋鱼类的酶解产品用于日粮中的养殖效果远优于传统鱼粉的结果, 而单纯从蛋白质和氨基酸的营养角度去理解是不完整的, 更多地应该是这些产品中含有的生理活性物质对鱼体生理代谢产生了重大影响。

3.3 无鱼粉日粮干扰多个信号通路, 营养代谢被抑制, 鱼体免疫防御能力下降

按照一般生物学规律理解, 鱼粉等产品中含有的生理活性物质要产生生理调节作用, 应该满足以下条件: (1)从物质来源分析, 要有物质基础。这类生理活性物质只有鱼粉或来自于海洋生物如鱼、虾、蟹、软体动物(乌贼、鱿鱼)、海藻等含有或经过加工(酶解)后所产生, 而在其他陆生动物、植物性原料中所没有: (2)从作用位点或作用环境分析, 这类生理活性物质既可以在消化道中发挥作用, 也通过消化道吸收进入鱼体血液、淋巴液并转送鱼体各器官组织中发挥作用; (3)从作用方式或作用途径分析, 这类物质能够对不同的代谢通路、尤其是神经分泌或激素信号通路形成干扰, 放大作用效果, 而不仅仅是营养需要的作用; (4)从作用结果来分析, 这类生理代谢作用的结果是对鱼体生长、发育和生理健康的维护具有正向的结果, 反之为负面影响的结果。

首先, 从转录组差异表达基因数的结果看(表 5), 肝胰脏是动物的代谢中心, 无鱼粉日粮对黄颡鱼肝胰脏在转录组水平的基因表达产生了重大的影响, 且影响的面很广(差异表达基因数量多、差异表达的KEGG通路多)、影响的程度较深(对细胞组织结构有影响、对神经分泌和激素信号通路有重大影响)。显示出无鱼粉日粮对黄颡鱼生理代谢的影响是多层面、广泛性的影响, 而不是对单一器官组织、单一作用途径的影响。其结果无鱼粉日粮是对鱼体生长性能(表 2、表 3)和生理健康(表 4)造成整体性的负面影响。如果从鱼粉日粮角度来分析, 就是鱼粉中含有某些生理活性物质, 这些生理活性物质是以神经分泌、激素调控信号通路, 以及其他重要的生理代谢信号通路作为作用位点, 通过对信号通路的实施干扰, 从而对鱼体生长、生理健康等造成重大的影响。

其次, 无鱼粉日粮对生理代谢作用位点或作用层次主要是生理代谢信号通路, 包括了神经分泌信号通路和激素调控信号通路。即鱼粉中可能含有对代谢信号通路产生重大影响的生理活性物质, 并通过干扰生理代谢信号通路对鱼体整体生理代谢产生重大的影响。

受到日粮鱼粉影响的生理代谢通路主要包含了以下KEGG通路(表 7)和GO条目(表 6), 受到无鱼粉日粮影响极显著差异表达的基因也为此提供了部分证据(表 8)。

转录组分析结果表明:神经系统组织结构和神经分泌活动受到损伤或抑制; 多个重要信号通路受到干扰, 生理代谢受到广泛性的影响; 抗应激、免疫防御系统受到深层次的影响, 鱼体生理健康受到不利影响; 营养代谢通路基因差异表达下调, 鱼体整体代谢强度和生长速度下降。

结合养殖试验结果也表明, 无鱼粉日粮导致黄颡鱼的末端神经系统发育受到一定程度的损伤作用, 而神经分泌、神经激素的调控作用受到抑制。作用的结果是对鱼体生长、生理代谢产生整体性的、广泛性的、深层次的不利影响, 导致鱼体生长性能下降、生理代谢的紊乱或被抑制。而养殖试验结果如特定生长率低, 血清转氨酶活性增加, 营养性物质如血清总蛋白、血脂、血糖等的含量降低等结果与上述分析是一致的, 也提供了有效的证据。无鱼粉组黄颡鱼对日粮营养物质的消化吸收受到抑制、胰岛素、胰高血糖素等激素调节活动受到抑制, 其结果就是对饲料利用效率下降、鱼体沉积的营养物质减少。在养殖试验结果中, 与摄食鱼粉组日粮比较, 摄食无鱼粉日粮组黄颡鱼血清总蛋白、血糖、血脂是下降的, 且甘油三酯含量下降达到显著性水平。饲料系数增加, 显示鱼体对饲料利用效率显著下降。鱼体组成中, 蛋白质、脂肪含量下降。这些结果与转录组基因差异表达结果是相互印证的。

4 结论

无鱼粉日粮与含28%秘鲁鱼粉日粮比较, 在池塘网箱中饲喂黄颡鱼70 d, 无鱼粉日粮组黄颡鱼生长性能显著下降。转录组基因差异表达分析结果显示, 无鱼粉日粮导致黄颡鱼神经系统细胞结构损伤、神经分泌和激素分泌出现紊乱, 对多个重要代谢信号通路形成干扰, 放大了无鱼粉日粮对鱼体代谢的作用程度。无鱼粉日粮对黄颡鱼生理代谢的作用是多位点、多途径的, 导致鱼体生理代谢强度整体下降、抗炎症和抗应激能力下降、免疫防御能力下降。综合表现为黄颡鱼生长性能下降、抗应激和抗病能力的下降。