海洋科学  2019, Vol. 43 Issue (3): 82-89   PDF    
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190117001

文章信息

游出超, 董兰芳, 曾梦清, 蒋艳, 许明珠, 张琴. 2019.
YOU Chu-chao, DONG Lan-fang, ZENG Meng-qing, JIANG Yan, XU Ming-zhu, ZHANG Qin. 2019.
急性低盐度胁迫对可口革囊星虫存活、Na+/K+-ATP酶及磷酸酶活力的影响
Effect of Acute Low-Salinity Stress on the Survival and Na+/K+-ATPase and Phosphatase Activities of Phascolosoma esculenta
海洋科学, 43(3): 82-89
Marina Sciences, 43(3): 82-89.
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190117001

文章历史

收稿日期:2019-01-17
修回日期:2019-03-01
急性低盐度胁迫对可口革囊星虫存活、Na+/K+-ATP酶及磷酸酶活力的影响
游出超, 董兰芳, 曾梦清, 蒋艳, 许明珠, 张琴     
广西壮族自治区海洋研究所 广西海洋生物技术重点实验室, 广西 北海 536000
摘要:为探讨低盐度急性胁迫对可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)的影响规律,研究星虫对急性低盐度胁迫的响应机制,本试验先通过急性毒性试验确定星虫96 h内对低盐度的耐受范围,再选取96 h最小死亡率盐度,研究该盐度急性胁迫下星虫(平均体质量0.85±0.07 g)体质量、体壁含水量、Na+/K+-ATP酶活力以及酸碱磷酸酶活力在96 h内的动态变化。结果表明:在本试验盐度3.0~7.0范围内,可口革囊星虫24 h的最大死亡率盐度是3.0,96 h的最小死亡率盐度为7.0;星虫死亡率随盐度降低逐渐升高,但相同盐度下随着时间延长,星虫死亡率基本不变,可口革囊星虫96h内能耐受的最低盐度是7.0;在低盐度7.0胁迫下,星虫体质量和体壁含水量在12 h内显著增大(P < 0.05),12 h后趋于平稳(P>0.05);Na+/K+-ATP酶活力也在6 h内显著升高至最大值(P < 0.05),6 h至12h又显著降低(P < 0.05),此后稳定在高于对照组水平;酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力变化趋势与Na+/K+-ATP酶活力类似,均是先显著升高(P < 0.05)后显著降低(P < 0.05),最后稳定在高于对照组水平。以上研究表明,可口革囊星虫能够通过Na+/K+-ATP酶、酸碱磷酸酶等渗透和免疫相关的生理调节机制,迅速响应低盐度环境,其对低盐度有很强的适应力和耐受力。
关键词低盐度胁迫    可口革囊星虫    Na+/K+-ATP酶    磷酸酶    
Effect of Acute Low-Salinity Stress on the Survival and Na+/K+-ATPase and Phosphatase Activities of Phascolosoma esculenta
YOU Chu-chao, DONG Lan-fang, ZENG Meng-qing, JIANG Yan, XU Ming-zhu, ZHANG Qin     
Guangxi Institute of Oceanology, Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi, Beihai 536000
Abstract: To analyze the effect of acute low-salinity stress on Phascolosoma esculenta (P. esculenta) and its response mechanism, acute toxicity testing was first conducted to determine the tolerance range of P. esculenta to low salinity within 96 h. Furthermore, the salinity of minimum mortality rate at 96 h were determined to culture P. esculenta, which investigate the dynamic changes of the body mass, water content of the body wall, and Na+/K+-ATPase and phosphatase activities of P. esculenta (average body mass of 0.85 ±0.07 g) under this acute low-salinity stress within 96 h. The results showed that in the test range (3.0-7.0) of salinity, the maximum salinity at 24 h and minimum salinity at 96 h were 3.0 and 7.0, respectively. The mortality rate of P. esculenta gradually increased with the decrease in salinity from 7.0 to 3.0. However, with the same salinity, the mortality rate remained unchanged with the increase in time. The minimum salinity that P. esculenta can tolerate within 96 h is 7.0. The Na+/K+-ATPase activity also increased significantly to the maximum value within 6 h (P < 0.05) and decreased significantly from 6 h to 12 h (P < 0.05). Subsequently, the Na+/K+-ATPase activity stabilized at a higher level than the control group. The activities of acid phosphatase and alkaline phosphatase were similar to that of Na+/K+-ATPase, both of which initially increased significantly (P < 0.05), then significantly decreased (P < 0.05), and finally stabilized at a higher level than the control group. In conclusion, P. esculenta was able to rapidly respond to the low-salinity environment through the physiological regulation mechanism related to osmosis and immunity, such as Na+/K+-ATPase, acid phosphatase, and alkaline phosphatase, and exhibited strong adaptability and tolerance to low salinity.
Key words: low-salinity stress    Phascolosoma esculenta    Na+/K+-ATPase    acid phosphatase    alkaline phosphatase    

盐度是影响海洋无脊椎动物生理生态学最重要的环境因子之一[1]。大多数海洋无脊椎动物都是变渗压性的, 它们调节渗透压的作用不完善, 体液的渗透压与海水接近一致并且受到水环境渗透压的影响。水环境盐度升高时, 它们的体重因为失水而减少; 盐度降低时, 其体重由于水分渗入而增加[2]。水生生物对盐度的变化存在一定的适应范围和耐受极限, 这种适应性主要取决于机体对渗透压的调节能力, 而酶活力是最重要的调节方式之一。Na+/K+-ATP酶能催化ATP水解供能, 驱动位于细胞膜两侧的Na+、K+对向运输, 对于机体调节细胞渗透压和离子平衡有重要的调节作用[3]。目前国内外已经开展了一些水生生物的Na+/K+-ATP酶的研究, 包括鱼类[4-8]、贝类[9-10]、甲壳类[11-15]等。许多研究发现, 盐度升高或降低均能导致Na+/K+-ATP酶活力增强[16-21]。在盐度胁迫等逆境环境下, 机体产生大量氧自由基导致氧化损伤, 为维持细胞正常代谢, 生物体形成了复杂的酶类和非酶类免疫保护系统, 而非特异性免疫是机体防御和保护的第一道防线。其中酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)是机体参与免疫防御等活动的两种重要水解酶[22-23]

可口革囊星虫(Phasolosma esculenta)俗称泥虫、泥丁、土笋等, 隶属星虫动物门(Sipuncula)、革囊星虫属(Phascolosoma), 主要分布在中国东南沿海地区的泥质或沙泥质滩涂[24]。其活动范围小、抗逆性强、营养价值高, 是近年来新兴的海水增养殖品种[25]。由于生活在近岸潮间带, 受到潮汐、降雨等影响, 星虫需要通过不断调整自身生理活动以适应海水盐度变化, 因此研究可口革囊星虫对低盐度耐受性以及低盐度急性胁迫下可口革囊星虫Na+/K+-ATP酶和磷酸酶活力的变化, 可为探讨星虫类动物渗透压调节机制提供参考, 为可口革囊星虫人工育苗和养殖生产中养殖水体选择与调控提供基础资料, 丰富星虫类动物生理生态学相关的研究数据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验用可口革囊星虫来源于广西壮族自治区海洋研究所竹林海水育苗基地, 从室内泥池中(盐度23)挖出后, 放入自然海水(盐度23)中暂养7日, 期间每日喂食1次, 试验前一天停止投喂。挑选规格相近、活力较好的个体(平均体质量0.85±0.07 g)作为试验对象。

试验在规格为40 cm×28 cm×22 cm的白色塑料箱中进行, 试验用海水为砂滤自然海水(盐度24), 用充分曝气的自来水调节海水盐度, 水温维持在29~31℃。

1.2 可口革囊星虫96 h低盐度急性胁迫试验

采用将可口革囊星虫直接从对照组转移到试验盐度的方式开展低盐度胁迫试验。根据预实验确定可口革囊星虫24 h最大死亡率盐度和96 h最小死亡率盐度分别为3.0和7.0, 按照等对数间隔设置5个低盐度梯度组, 分别为3.0、3.7、4.6、5.7、7.0。试验过程中随时捞出死亡个体, 观察并记录各组可口革囊星虫在24 h、48 h、72 h和96 h的死亡个体数。死亡的判断标准为身体松软, 吻部伸出, 刺激没有反应。图 1为试验中正常、吸水膨胀和死亡后可口革囊星虫的照片。

图 1 试验中正常、吸水膨胀和死亡后可口革囊星虫的照片 Fig. 1 Normal, water-swelled, and dead Phascolosoma esculenta used in the experiment
1.3 96 h急性低盐度胁迫对可口革囊星虫的影响试验

试验选取可口革囊星虫96 h最小死亡率盐度为试验组盐度, 即试验盐度为7.0, 以保证试验过程中大多数可口革囊星虫能够存活。挑选健康活泼的可口革囊星虫, 随机选取7~8条用纯水冲洗干净后滤纸吸干水分, 再用剪刀纵向剖开, 去除内脏和体腔液, 体壁用2.0 mL离心管分装成2管保存于–20℃用于消化酶活力和体壁含水量的测定。剩余的可口革囊星虫放入盐度为7.0的海水中, 分别在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h时随机选取7~8条可口革囊星虫, 同样用纯水冲洗拭干后收集体壁样品。试验过程如有死亡个体应及时捞出, 每24 h换水一次。试验重复三次, 并用自然海水设置对照组, 用同样的方法收集对照组样品。

另取10条可口革囊星虫, 冲洗干净后用滤纸拭干, 称量并记录每条可口革囊星虫的体质量。再将可口革囊星虫放入盐度为7.0的海水中, 在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h时分别取出拭干, 逐条称量体质量后取体壁测定体壁的含水量, 最后绘制平均体质量和体壁含水量随胁迫时间的变化曲线。

1.4 体壁含水量测定

体壁的含水量采用105℃恒温干燥24 h测定。

体壁含水量=(体壁鲜重–体壁干重)/体壁鲜重× 100%

1.5 酶活测定

将–20℃冷冻的可口革囊星虫体壁样品在冰盘上用剪刀剪碎, 转移至玻璃匀浆器, 加入预冷的磷酸缓冲液(pH=7, 质量体积比1︰3), 充分匀浆后, 匀浆液用冷冻离心机(Jouan, C3i, France)离心10 min(4℃, 3 000 r/min), 上清液即为待测酶液。

Na+/K+-ATP酶、ACP和AKP活力均采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定。待测酶液蛋白质量分数以牛血清蛋白作标准, 用考马斯亮蓝法测定。

1.6 数据分析

采用SPSS 20.0对所得数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA), 若差异达到显著(P < 0.05), 则用Tukey多重比较各组数据之间的差异, 结果表示为“平均值±标准误差”(n=3)。

2 结果 2.1 低盐度对可口革囊星虫的96 h急性胁迫

可口革囊星虫放入低盐度环境中, 身体慢慢吸水膨胀, 活力也随时间的延长而减弱。根据预实验结果, 可口革囊星虫在本实验条件下24 h的最大死亡率盐度是3.0, 96 h的最小死亡率盐度为7.0, 这表明96 h内可口革囊星虫能耐受的最低盐度是7.0。表 1是可口革囊星虫死亡率与盐度及时间的关系。随着盐度的降低, 可口革囊星虫死亡率逐渐升高。但相同盐度下随着时间的延长, 可口革囊星虫死亡率基本不变。表 2中各时间点盐度对数与死亡率回归方程的相关系数R2均高于0.95, 显示出很好的拟合度[26], 这说明在3.0~7.0盐度范围内, 可口革囊星虫的死亡率与盐度变化密切相关。

表 1 低盐度急性胁迫可口革囊星虫的死亡率 Tab. 1 Mortality rates of Phascolosoma esculenta under acute low-salinity stress
试验组盐度 24 h 48 h 72 h 96 h
7.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
5.7 6.7 ± 3.3 6.7 ± 3.3 13.3 ± 3.3 13.3 ± 3.3
4.6 43.3 ± 5.8 43.3 ±3.3 43.3 ± 3.3 43.3 ± 3.3
3.7 76.7 ± 3.33 80.0 ± 3.3 80.0 ± 3.3 80.0 ± 0.0
3.0 96.7 ± 3.3 100.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0

表 2 死亡率与盐度对数的回归分析 Tab. 2 Regression analysis of the death and salinity logarithm
时间 回归方程 相关系数R2
24 h Y = −285.5X + 233.6 0.970
48 h Y = −296.4X + 242.1 0.968
72 h Y = −289.0X + 238.6 0.982
96 h Y = −289.0X + 238.6 0.982
2.2 急性低盐胁迫下可口革囊星虫体质量及体壁含水量的变化

急性低盐度胁迫下可口革囊星虫体质量和体壁含水量的变化如图 2所示, 可口革囊星虫体质量和体壁含水量随时间的变化趋势是一致的, 即0~12 h内迅速升高, 可口革囊星虫体质量从0.83 g显著升高到2.03 g(P < 0.05), 体壁含水量则从90.60%显著升高到94.97%(P < 0.05), 12 h后两者均趋于平稳(P >0.05)。

图 2 急性低盐胁迫下可口革囊星虫体质量及体壁含水量的变化 Fig. 2 Changes of the body mass and water content of the body wall of Phascolosoma esculenta under acute low-salinity stress
2.3 急性低盐胁迫下可口革囊星虫Na+/K+-ATP酶活力的变化

图 3是急性低盐度胁迫下可口革囊星虫幼虫Na+/K+-ATP酶活力随时间的变化结果, 可口革囊星虫受盐度为7.0的海水胁迫后, 6 h内Na+/K+-ATP酶活力迅速从0.18 mmol Pi/(g prot·h)显著升高至最大值[1.25 mmol Pi/(g prot·h)], 6 h至12 h内又迅速显著降低至0.62 mmol Pi/(g prot·h)(P < 0.05)。12~96 h Na+/K+-ATP酶活力相对稳定, 没有显著变化(P > 0.05), 但显著高于对照组(P < 0.05)。

图 3 急性低盐胁迫下可口革囊星虫幼虫Na+/K+-ATP酶活力随时间的变化 Fig. 3 Changes of the Na+/K+-ATP enzyme activity of Phascolosoma esculenta under acute low-salinity stress
2.4 急性低盐度胁迫下可口革囊星虫ACP酶活力的变化

急性低盐度胁迫下可口革囊星虫ACP酶活力随时间的变化结果如图 4所示, 急性低盐度胁迫下可口革囊星虫ACP酶活力在0~4 h内从20.20 U/g prot显著升高到最大值32.42 U/g prot(P < 0.05), 4 h至48 h又显著降低(P < 0.05)。48 h开始ACP酶活力趋于稳定, 且高于对照组。

图 4 急性低盐胁迫下可口革囊星虫ACP酶活力随时间的变化 Fig. 4 Changes of the ACP enzyme activity of Phascolosoma esculenta under acute low-salinity stress
2.5 急性低盐胁迫下可口革囊星虫AKP酶活力的变化

图 5所示, 急性低盐度胁迫下可口革囊星虫AKP酶活力与Na+/K+-ATP酶活力变化趋势类似, 在0 h~2 h内AKP酶活力从26.72 U/g prot显著升高, 2~6 h有一个短期的平台期, 而后继续显著升高(P < 0.05), 8 h达到最大值62.80 U/g prot, 随后8~12 h内迅速显著下降(P < 0.05), 10 h后趋于稳定且显著高于对照组(P < 0.05)。

图 5 急性低盐胁迫下可口革囊星虫 AKP 酶活力随时间的变化 Fig. 5 Changes of the AKP enzyme activity of Phascolosoma esculenta under acute low-salinity stress
3 讨论

海水盐度不适的情况下, 水产动物会消耗大量能量调节渗透压来适应环境, 当海水渗透压的改变超过了动物自身的调节能力, 会导致死亡[27]。曾海祥等[28]已经初步研究了可口革囊星虫对温度和盐度的耐受力, 结果表明, 可口革囊星虫72 h内生存的盐度范围为5~30, 耐受的盐度范围较广。本实验中可口革囊星虫96 h内能耐受的最低盐度为7.0, 与曾海祥的研究结果相近, 偏差可能是由统计时间点以及实验温度不同造成的。3.0~7.0盐度范围内, 可口革囊星虫96 h的死亡率与盐度变化密切相关, 但是同一盐度下随着时间的延长, 可口革囊星虫死亡率基本不变, 这说明可口革囊星虫对盐度的适应能力很强, 24 h内能够耐受住低盐, 之后死亡的可能性较小。

环境盐度改变后, 水产动物先是由于渗透压的作用被动吸水或失水引起自身渗透压改变, 自身渗透压改变再激活机体渗透压相关调节过程, 如Na+/K+- ATP酶活力改变等, 最终使机体渗透压趋于稳定[29]。本研究中, 可口革囊星虫在低盐环境中迅速吸水膨胀, 最后经过调节, 体质量和体壁含水量均趋于稳定。多数水产动物在低盐度环境下, Na+/K+-ATP酶活力都表现为升高的趋势。低盐度对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)幼鱼的急性胁迫试验表明, 各低盐度试验组幼鱼鳃丝的Na+/K+-ATP酶活力均在1h时达到最高值, 随后下降, 至6 h达到稳定且均显著高于对照组[16]; 盐度突降胁迫下, 魁蚶(Anadara broughtonii)稚贝鳃Na+/K+-ATP酶活力12 h后显著升高, 24 h分别达到最大值, 随后快速回落并稳定在高于对照组水平[17]; 吴庆元等[18]的研究结果表明, 0~15的低盐度环境能够激活和提高鲻鱼(Mugil cephalus)幼鱼Na+/K+-ATP酶活力, 增强其对低盐度环境的适应能力, 随着试验时间延长, 试验组Na+/K+-ATP酶活力降低并趋于稳定, 与对照组之间的差异减小。类似的, 还有紫石房蛤(Saxidomus purpurata)[19]、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)[20]、多鳞四指马鲅(Eleutheronema rhadinum)[21]等。本研究中可口革囊星虫Na+/K+-ATP酶活力变化同以上研究结果一致, 6 h内Na+/K+-ATP酶活力显著升高至最大值, 之后迅速降低, 最后稳定在高于对照组水平。低盐度环境导致动物机体短时间内被动吸收过多水分以及体内离子流失, 为了从外界转运更多的离子来维持体内渗透压, 机体组织的Na+/K+-ATP酶活力升高, 经过一段时间的调节后体内渗透压趋于稳定, Na+/K+-ATP酶活力也随之降低最后趋于稳定。然而灰海马(Hippocampus erectus)[30]、仿刺参(Apostichopus japonicus)[31]、赤鲷(Pagrus pagrus)[32]等在盐度突降的情况下Na+/K+-ATP酶活力却表现为下降的趋势, 说明不同物种对渗透调节的能力和方式存在很大的种间差异, 需进一步进行比较和研究。此外, 试验所处环境如温度、pH等同样也影响着试验结果。

ACP和AKP是机体免疫调节体系的重要组成部分[33], 也参与机体能量的收支平衡。当机体处于耗能状态时, ACP和AKP参与机体能量代谢并释放能量, 来满足生命活动的需要[23]。研究表明, 盐度变化过程中水生动物ACP和AKP活性会随之改变[34]。本研究中可口革囊星虫ACP和AKP活性的变化趋势大致相同, 均是先显著升高后显著降低最后趋于稳定但高于对照组水平。这与对刺参的研究结果类似, 研究者认为各盐度组的ACP、AKP活力呈现短期升高而后出现下降的原因可能是机体通过消耗ATP去调节渗透压来适应外界环境中盐度变化影响, 而ATP合成所需的无机磷酸可由ACP、AKP催化磷酸酯类水解产生, 从而造成了ACP、AKP活力的升高[35]。本文结果与此相同, 盐度骤降后可口革囊星虫ACP和AKP活性立即升高, 不仅增强了可口革囊星虫机体的免疫防御能力, 同时其代谢释放的能量也可以用于机体的渗透调节过程, 这可能是水生动物自我保护的应激反应, 随着机体逐渐适应环境盐度, ACP和AKP活性逐渐降低最后稳定。

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