2019, Vol. 43
文章信息
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- LI Du-wen, HUA Zhi-jie, ZHANG Wen-xiang, REN Hai, ZHANG Yu, JIN Xiao-min, GAO Gui-sheng, LI Pei-guo. 2019.
- 金属蛋白酶对大菱鲆血清抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响
- Effects of metalloprotease on antioxidant system enzyme activities and malondialdehyde content in the serum of Scophthalmus maximus
- 海洋科学, 43(4): 52-60
- Marina Sciences, 43(4): 52-60.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20180928006
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文章历史
- 收稿日期：2018-09-28
- 修回日期：2018-12-08
2. 内蒙古农业大学 动物科学学院, 内蒙古 呼和浩特 010000
2. The College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010000, China
大菱鲆(Scophthalmus maximus)是自然分布于大西洋东北部欧洲沿岸的一种大型底栖鱼类, 具有生长速度快及耐低温等优点[1]。自1992年被引入中国以来, 随着养殖业迅猛发展和集约化程度不断提高, 使得大菱鲆病害频发, 其中以细菌性疾病最为严重[2-3]。弧菌病是养殖大菱鲆的主要病原菌之一, 其中鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是危害最大的弧菌, 常给水产养殖业造成巨大的经济损失[4-5]。
大量研究证实鳗弧菌的致病性与其本身含有多种毒力因子(胞外蛋白酶、脂多糖、鞭毛和溶血素等)有关[6], 在上述诸多毒力因子中胞外蛋白酶具有很强的致病性[7], 且已经发现多种动物病原菌中均存在该蛋白酶(霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)以及哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)等), 鳗弧菌中的金属蛋白酶被证实是一种含锌离子的胞外蛋白酶[8-10]。池政豪[11]研究证实鳗弧菌胞外金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞具有明显的毒性作用, 透射电镜观察发现鳃细胞内出现凋亡小体并出现崩解现象。陈吉祥等[12]从花鲈(Lateolabrax japanicus)体内分离获得的鳗弧菌, 纯化后的金属蛋白酶能够引起鲈鱼组织损伤和死亡。Inamura等[13]从鳗弧菌胞外产物中分离纯化的金属蛋白酶对小鼠(Mus musculus)也具有致死作用。Lee等[14]从副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)中粗提的胞外蛋白酶A对HeLa、Vero及Caco-2等细胞都有很强的抑制效果, 纯化后腹腔注射小鼠能够引起小鼠死亡。由上可见, 病原菌的胞外蛋白酶作为细菌毒性因子, 能够对机体产生毒性和致病性, 该蛋白酶通过攻克宿主的防御系统, 引起组织损伤, 给病原菌的入侵及感染提供条件[15-16]。
鱼类与其他有氧生物一样具有完善的抗氧化系统, 该系统是需氧生物体内非常重要的活性氧清除系统, 主要用于抵御外界氧化胁迫因子产生的活性氧自由基[17]。当体内活性氧自由基增加时, 机体的抗氧化系统依靠相应的抗氧化酶的活性和抗氧化剂的合成量会受到影响[18]。在鱼类抗氧化系统中, 抗氧化酶对氧化胁迫的清除起着决定性作用, 抗氧化酶活力的变化在一定程度上能反映鱼类在不同环境条件下的生理状况, 可作为衡量鱼类是否受到外界环境胁迫的一个重要生理指标, 具体表现为总抗氧能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶类在免疫调节中发挥的重要作用[19-21]。其中, T-AOC主要分解和清除体内代谢过程中产生多余的活性氧, 保护机体免受损伤, 是衡量机体抗氧化防御系统功能状况的综合性指标。而体内的SOD、CAT和GSH-Px能够相互协同清除各种氧自由基, 当超氧自由基增加时, 可以诱导增加生物体内SOD的活性, 催化超氧自由基发生歧化反应, 生成H2O2, 进而被CAT与GSH-Px联合还原成H2O与O2, 最终达到保护机体的目的[22]。丙二醛(MDA)作为机体脂质过氧化作用的终产物, 其含量可间接反映机体的脂质过氧化水平以及生物细胞受活性氧自由基攻击的程度[23]。本实验通过分析上述指标在体内的变化, 探讨大菱鲆抗氧化系统抗金属蛋白酶的能力, 本研究结果将有助于阐明金属蛋白酶的致病机制, 为防治大菱鲆弧菌病提供基础理论数据。
1 材料与方法 1.1 实验动物实验用大菱鲆购自秦皇岛昌黎县某养殖场, 挑选健康活泼、平均体长为14.6 cm±0.4 cm, 平均体质量为42.8 g±3.6 g的大菱鲆暂养于80 cm×40 cm×50 cm的玻璃缸中, 每3 d换水1次, 每次换水量为总水量的一半, 养殖过程中盐度为19, 温度16±1℃, 试验期间不投饵。
1.2 实验设计实验用大菱鲆随机分为4组, 即对照组(0 mg/mL)、低质量浓度组(0.037 mg/mL)、中质量浓度组(0.073 mg/mL)和高浓度组(0.147 mg/mL)。对照组肌肉注射100 μL无菌生理盐水, 实验组分别注射等体积不同浓度的金属蛋白酶, 该蛋白酶制备方法参考文献[24, 25], 具体方法略作修改。每组3个平行, 每个平行10尾鱼, 每个时间点随机取3尾鱼, 分别于注射后3、6、12、24、48、72 h于尾静脉用1 mL一次性注射器取血并转移至1.5 mL离心管中(不加任何抗凝剂), 4℃冷箱内放置3 h后4 000 rpm离心10 min, 将血清转移至新的离心管内, –20℃冰箱保存备用。
1.3 样品测定过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)均按照南京建成生物工程研究所试剂盒附带的说明书进行, 其中规定每分钟分解1 μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位(U)。0.1 mL血清在37℃反应5 min, 排除非酶促反应作用, 使反应体系中使GSH反应浓度降低1 μmol/L, 定义为1个GSH-Px活力单位。每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U); 每分钟每毫克组织蛋白在37℃, 使反应体系的吸光度值(OD)每增加0.01时, 定义为1个T-AOC活力单位(U); MDA含量测定采用TBA法。
1.4 数据统计分析实验数据用“平均值±标准差”表示, 利用SPSS 20.0进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析各组间差异, P < 0.05表示差异显著。
2 结果分析 2.1 不同浓度金属蛋白酶对大菱鲆血清CAT活力的影响由图 1可以看出, 低浓度组的CAT活力在3 h~ 72 h呈现先下降再上升再下降的波浪式变化趋势, 并在3 h时出现最大值且显著高于对照组(P < 0.05), 其余时间点均与对照组无显著性差异(P > 0.05)。中浓度组CAT活力在3 h~72 h呈现先下降再上升再下降的波浪式变化趋势, 且在12 h~72 h均显著低于对照组(P < 0.05)。而金属蛋白酶高浓度组在整个试验期间也呈现波浪式的变化趋势, CAT活力在3 h~72 h内受到不同程度的抑制, 均显著低于对照组(P < 0.05), 且在72 h活力迅速下降, 出现最低值。
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| 图 2 金属蛋白酶对大菱鲆血清GSH-Px活力的影响 Fig. 2 Effects of metalloproteinases on the activity of GSH- Px in the serum of S. maximus |
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| 图 3 金属蛋白酶对大菱鲆血清T-SOD活力的影响 Fig. 3 Effects of metalloproteinases on the activity of T-SOD in the serum of S. maximus |
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| 图 4 金属蛋白酶对大菱鲆血清T-AOC活力的影响 Fig. 4 Effects of metalloproteinases on the activity of T-AOC in the serum of S. maximus |
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| 图 5 金属蛋白酶对大菱鲆血清MDA含量的影响 Fig. 5 Effects of metalloproteinases on the activity of MDA content in the serum of S. maximus |
由图 2可见, 低浓度组的GSH-Px活力在3 h~72 h内呈现相对平稳的变化趋势且与对照组相比无显著性差异(P > 0.05)。而中浓度组GSH-Px活力在整个试验阶段呈波浪形变化趋势, 除6 h和72 h外, 其余时间点均与对照组差异显著(P < 0.05)。金属蛋白酶高浓度组GSH-Px活力在3 h~72 h呈现先下降后上升再下降的变化趋势, 除3 h略低于对照组外(P > 0.05), 其余时间点均显著低于对照组(P < 0.05)。
2.3 不同浓度金属蛋白酶对大菱鲆血清T-SOD活力的影响由图 3可见, 在整个试验过程中, 金属蛋白酶低浓度组和中浓度组血清的T-SOD活力均呈现波浪形变化趋势, 且在3 h显著高于对照组(P < 0.05), 之后逐渐下降, 在48 h时恢复到对照组水平, 在72 h时略高于对照组, 但无显著性差异(P > 0.05)。高浓度组T-SOD活力在3 h~48 h呈现逐渐下降的变化趋势, 而在48 h~72 h有上升的趋势, 且整个试验过程中均与对照组差异显著(P < 0.05)。
2.4 不同浓度的金属蛋白酶对大菱鲆血清T-AOC活力的影响如图 4所示, 金属蛋白酶低浓度组T-AOC活力在3 h~48 h趋于平稳, 但在72 h有上升的趋势, 整个试验过程中与对照组无显著性差异(P > 0.05)。中浓度组T-AOC活力在整个试验过程中呈波浪式变化, 在12 h和72 h出现低值, 且均显著低于对照组(P < 0.05)。而高浓度组T-AOC活力在3 h~72 h均显著低于对照组(P < 0.05)且在12 h后呈现逐渐下降的变化趋势。
2.5 不同浓度金属蛋白酶对大菱鲆血清MDA含量的影响从图 5可以看出, 低、中浓度组MDA含量在3 h~ 72 h内总体呈现平稳的变化趋势, 略高于对照组, 与对照组无显著性差异(P > 0.05)。但是整个试验过程中高浓度组MDA含量均显著高于对照组(P < 0.05), 且在24 h~72 h内MDA含量大致呈现缓慢上升的趋势。
3 讨论研究证实将鳗弧菌中的金属蛋白酶进行灭活处理后, 其致病性会大幅度降低, 因此认为金属蛋白酶是鳗弧菌重要的致病因子[15-16]。有研究发现, 外界胁迫因子(水体温度、毒素、氨氮等)变化能够诱导机体产生多余的氧自由基。在一定范围内, 氧自由基的产生与机体抗氧化防御过程处于动态平衡中, 当外界胁迫因子浓度的增加和胁迫时间的延长, 活性氧自由基在体内不断积累进而引起细胞结构和功能的破坏。为了避免细胞损伤, 机体的抗氧化防御系统在清除组织细胞内过多的活性氧自由基以及保证机体正常生理功能方面发挥了重要的作用[26]。体内有许多清除自由基的抗氧化酶, 如SOD、CAT、GSH-Px及T-AOC等是机体抗氧化系统中主要的酶, 上述酶指标的活性和含量的变化将最终影响体内活性氧水平。而当体内蓄积的自由基超过了机体的清除能力时, 过多的自由基会攻击生物细胞膜, 生成脂质过氧化物(LPO), 并最终分解为MDA, 而MDA可改变生物膜结构, 降低细胞膜的流动性, 造成对细胞膜的脂质过氧化损伤, 通过检测MDA的含量能够间接反应出机体脂质过氧化的程度[27-28]。基于此, 本试验通过分析上述指标在大菱鲆血清中的变化来反映其抗金属蛋白酶的能力。
3.1 不同浓度金属蛋白酶对大菱鲆血清的CAT和GSH-Px活力的影响CAT是生物体内酶系统防御体系中的关键酶之一, 其主要功能是清除体内的H2O2, 保护生物体防止氧化损伤毒害作用, 保护机体细胞内环境的稳定[29]。本试验中, 在整个试验期间低、中浓度组仅在3 h与对照组有显著性差异(P < 0.05), 而其他时间点无显著差异。分析原因可能是由于金属蛋白酶的毒性诱导大菱鲆体内活性氧增加, 其免疫系统反馈性增强抗氧化酶活力以清除体内多余的活性氧, 这可能与低浓度下毒物短暂的增益效应作用相关, Stebbing等[30]把该效应称之为“毒物的兴奋效应”。与对照组相比较, 随着胁迫时间的延长, 中浓度组CAT活性呈现逐渐下降的趋势且在12 h~72 h有显著性差异(P < 0.05), 而高浓度组CAT活力在3 h~72 h内均受到不同程度的抑制且显著低于对照组水平(P < 0.05)。出现上述结果的原因可能是随着金属蛋白酶浓度的升高以及胁迫时间的延长, CAT酶活性逐渐被抑制, 使得过氧化氢逐渐累积, 对组织损伤增加, 导致体内的CAT活力下降。牟海津等[31]研究发现副溶血弧菌胞外产物可以破坏对虾血淋巴中凝血系统的酶活性, 影响对虾的体质。本试验中也发现金属蛋白酶对大菱鲆血清CAT活力具有一定抑制作用, 这可能与该蛋白酶能够破坏大菱鲆体内的酶活力有关。呼光富[32]等研究了Cu2+对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)急性毒性作用, 结果发现较低浓度Cu2+对对虾组织CAT活力具有一定的激活作用, 而高浓度具有明显的抑制作用。
GSH-Px是体内普遍存在的一种过氧化物分解酶, 能催化GSH生成氧化型谷胱甘肽(GSSG), 使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物, 对各种外源(重金属)和内源性物质(活性氧)对细胞的损害都有保护作用, 该酶具有保护细胞膜的结构、功能以及防止过氧化物的损害[33]。本试验中金属蛋白酶中浓度组GSH-Px在3 h~72 h内呈现波浪形变化趋势, 且在72 h恢复到对照组水平。韩春艳等[34]认为低浓度胁迫因子短时间内能诱导GSH-Px活性增强来消除过多的自由基, 但是随着时间推移, 其活力恢复到正常组水平。但是随着金属蛋白酶浓度的增加, 高浓度组GSH-Px在6 h~72 h均受到显著抑制(P < 0.05), 分析原因可能是由于高浓度刺激导致机体产生的活性氧超出了抗氧化系统所能调节的范围, 造成组织器官的氧化损伤, 导致不可逆的结果。有研究认为鱼类在长时间受到胁迫的过程中, 一些组织会一直处于氧化应激状态, 产生的自由基会持续聚集, 轻则是细胞生物膜脂质过氧化, 酶失活和DNA损伤, 重则引起病变[35]。
3.2 不同浓度金属蛋白酶对大菱鲆血清的T-SOD和T-AOC活力的影响SOD能够清除机体内产生的活性氧自由基, 保护细胞免受氧化损伤, 是最先与活性氧自由基作用的酶, 一直被认为是生物体内最重要的抗氧化酶, 属于需氧生物体内的防御系统酶类[36]。本试验结果显示, 低、中浓度组的T-SOD活力在3 h均显著高于对照组(P < 0.05), 之后逐渐下降至对照组水平, 原因可能是由于外界毒性因子胁迫导致体内活性氧增加, 提高T-SOD活力以清除自由基, 维持组织的抗氧化水平, 表现出机体应对外界胁迫的生理性调节, 短时间内表现出积极的作用[37], 进一步说明低浓度金属蛋白酶可能对机体并没有产生不可逆的毒害作用。姚志峰等[38]认为造成这种变化趋势的原因可能是低浓度胁迫对机体的影响相当于其在无毒作用下的应激反应, 刺激增强血清中的T-SOD活力, 清除过量的活性氧自由基, 随着作用时间的延长, 活力逐渐恢复至对照组水平。本试验中金属蛋白酶高浓度组T-SOD活力在3 h~72 h均显著低于对照组(P < 0.05), 原因可能是由于高浓度长时间胁迫下体内产生的活性氧过多, 超出了机体清除的能力, 因此T-SOD活性呈下降的变化趋势。潘鲁青等[39]研究也发现Cu2+对鱼体的伤害与铜离子的浓度和作用时间密切相关。
T-AOC表示各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶促体系的抗氧化能力总和, 是衡量生物体内抗氧化防御系统功能状况的综合性评价指标, 能够反映出机体抗氧化防御系统的状态[40]。本试验结果发现, 金属蛋白酶中浓度组的T-AOC活力在整个胁迫过程中呈现波浪式变化趋势, 在12 h和72 h出现低值, 且均显著低于对照组(P < 0.05)。分析可能是由于金属蛋白酶毒性作用诱导机体产生过多的活性氧对体内抗氧化系统产生短暂的抑制作用, 反馈性地激活了体内各种抗氧化酶, 使其恢复到正常水平。但是随着金属蛋白酶作用时间的延长, 机体积累大量的活性氧导致体内T-AOC活性受到抑制。高浓度组T-AOC在3 h~72 h均显著低于对照组(P < 0.05), 同前面几种抗氧化酶变化趋势相似, 可能是由于金属蛋白酶浓度过高导致体内活性氧产生太多, 使得抗氧化酶完全被抑制, 形成不可逆的结果。有研究发现, 活性氧在体内大量积累时, 除了破坏细胞电子传递链、影响线粒体膜电位以及能量ATP的产生外, 还会导致细胞呼吸障碍, 进一步会导致细胞凋亡甚至坏死[41]。本试验中长时间金属蛋白酶胁迫是否导致大菱鲆组织细胞凋亡或坏死, 将在后续试验中给予证实。
3.3 不同浓度金属蛋白酶对大菱鲆血清MDA含量的影响MDA是机体脂质过氧化反应的最终产物之一, 可引起生物膜结构和功能异常, 因此检测其含量既可以衡量机体的抗氧化状态和脂质过氧化损伤的程度, 也可间接反映自由基产生侵害的程度、生物活性及其抗氧化能力的强弱[27-28]。本试验结果表明, 金属蛋白酶低、中浓度组的MDA含量均与对照组变化趋势相似, 无显著性差异(P > 0.05), 分析原因可能是由于上述浓度的金属蛋白酶并没有超过机体自身抗氧化系统的调节能力, 机体通过诱导大菱鲆血清中抗氧化酶消除体内产生过多的活性氧自由基, 从而减少了过氧化脂质产生, 表现为机体MDA含量变化差异不显著(P > 0.05)。顾海龙等[42]研究发现1 μg/L的Cd2+胁迫泥蚶在短期内MDA含量变化不显著, 强俊等[43]用氨氮胁迫尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)也发现较低浓度的氨氮不会影响MDA含量的变化, 与本试验得到的结果相类似。而金属蛋白酶高浓度组在3 h~72 h均显著高于对照组, 推测可能是高浓度金属蛋白酶引起机体产生氧化应激, 产生大量活性氧, 导致大菱鲆脂质过氧化作用增强和DNA的氧化损伤, 严重时会引起机体死亡。苏秀梅[44]研究结果显示鱼源嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)胞外蛋白酶对小鼠及斑点叉尾
本研究结果表明, 不同浓度组金属蛋白酶能够影响大菱鲆抗氧化酶活性, 并且高浓度组可以导致血清脂质过氧化产物MDA含量的增加, 表现出一定的时间量效关系。低、中浓度组金属蛋白酶胁迫初期能够诱导机体抗氧化酶系统酶活力增加, 机体可以通过自身的抗氧化系统中的各种酶进行调节, 消除机体过多的活性氧自由基, 表现出积极的作用。而高浓度组金属蛋白酶对机体抗氧化酶活性产生不同程度的抑制作用, 并且造成脂质过氧化程度加剧, 表现为MDA含量的增加。金属蛋白酶作为鳗弧菌主要致病因子对机体造成的损伤可能是通过抑制抗氧化酶活性和增加脂质过氧化作用来实现的。本试验结果可为大菱鲆应答鳗弧菌感染的免疫机制研究提供一定的理论参考。
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