2019, Vol. 43
文章信息
- 吴俊泽, 王艳艳, 李悦悦, 祝佳玄, 曲克明, 崔正国. 2019.
- WU Jun-ze, WANG Yan-yan, LI Yue-yue, ZHU Jia-xuan, QU Ke-ming, CUI Zheng-guo. 2019.
- 海水人工湿地系统脱氮效果与基质酶活性的相关性
- Enzyme activity in constructed marine wetlands
- 海洋科学, 43(5): 36-44
- Marina Sciences, 43(5): 36-44.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190121002
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文章历史
- 收稿日期：2019-01-21
- 修回日期：2019-04-16
2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071;
3. 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室山东省渔业资源与生态环境重点实验室 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 山东 青岛 266071
2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology(Qingdao), Qingdao 266071, China;
3. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Shandong Provincial Key Laboratory of Fishery Resources and Eco-Environment, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
近年来随着海水养殖业不断发展, 高密度和集约化海水养殖逐渐成为主流[1], 但养殖过程中残饵和粪便的分解会污染水质, 滋生致病微生物[2-3]。我国近岸海水养殖模式相对粗放, 部分养殖场存在着养殖规模超限、缺乏有效的水处理装置、高污染的养殖废水直接排放等违规操作[4]。这些违规操作一方面导致局部海域水体富营养化, 危害海洋生物, 破坏近岸生态平衡[5]; 另一方面, 随着近年来海洋环保督查力度的提升, 违规养殖被大规模整治和取缔。因此, 从生态环境保护和养殖业可持续发展两方面考虑, 通过技术手段净化海水养殖外排水, 减少海水养殖污染是非常必要的[6]。
人工湿地是模拟自然湿地生态系统构建而成的一种污水处理工程, 它利用植物、基质、微生物三者的协同作用, 通过物理、化学和生物反应去除水体中的污染物, 实现净化污水的目标[7]。人工湿地处理效果良好, 投入费用低, 能耗少, 便于管理, 具有较高的生态效益, 目前已被广泛应用于净化江河湖水和生活污水[8, 9], 但对于处理海水养殖外排水的应用尚处于起步阶段。
人工湿地基质酶在污水净化中起关键作用, 它主要来源于人工湿地微生物、动物和植物根系在土壤中的生命活动, 是一种具有生物功能的催化剂[10], 可参与许多有机物的反应和氧化还原反应, 提高人工湿地污染物的去除效率。其中脲酶是一种广泛存在于自然界微生物和植物中的水解酶, 能够水解线性酰胺键C-N, 和污水中氮去除有关[11]; 脱氢酶在有机质脱氢反应中起到传递氢的作用, 能够加速污染物的去除[12], 是探究人工湿地去污能力的有效指标之一; 硝酸还原酶是一种诱导酶, 可直接将硝态氮还原为亚硝态氮, 在氮代谢反硝化步骤中起关键作用[13]。
氮元素是海水养殖外排水中的主要污染物之一, 氮的去除对水体净化起关键作用[14]。人工湿地氮去除的途径和效率、氮的迁移转化一直是国内外学者研究的热点[15-16], 李智等[17]研究发现人工湿地基质酶活性具有空间分布特性, 王艳艳等[18]研究了人工湿地对海水养殖外排水的脱氮效率, 但海水养殖外排水脱氮效果与人工湿地基质酶活性间的关系未见报道。为了探究人工湿地脱氮效果和基质酶活性的相关性, 本实验采用海水人工湿地系统, 以牙鲆海水养殖外排水作为人工湿地的处理对象, 探究了人工湿地对可溶性无机氮(Dissolved Inorganic Nitrogen, DIN)、可溶性有机氮(Dissolved Organic Nitrogen, DON)和总氮(Total Nitrogen, TN)的去除效果, 分析了基质中脱氢酶、硝酸还原酶和脲酶的酶活性变化、微生物多样性和群落结构与脱氮效果的相互关系。现将研究结果报道如下。
1 材料与方法 1.1 实验装置本实验采用海水人工湿地系统, 实验装置如图 1所示, 海水人工湿地系统由人工湿地和储水池两部分组成, 其中人工湿地由下行池和上行池构成, 规格(长×宽×高)为100 cm×50 cm×100 cm, 有效体积为145 L。海水人工湿地系统的处理对象是牙鲆海水养殖外排水, 水体盐度较高, 因此选取耐盐植物互花米草(Spartina alterniflora)作为人工湿地植物, 种植密度为160株/m2, 互花米草可以在高盐度水体中存活和生长[19]。使用三种基质进行填充, 自上而下依次为细砂(粒径1~2 mm)、煤渣(粒径2~4 cm)、珊瑚石(粒径3~5 cm), 基质粒径逐渐增大, 优化污染物去除效果; 每层基质分别设置一个排污口, 系统进水口略高于出水口, 以便防止堵塞, 提高系统水利效率。
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| 图 1 海水人工湿地系统原理图 Fig. 1 Schematic of the constructed marine wetland |
实验期间连续运行28 d, 共计4个周期, 每个周期为7 d。每个周期结束后将系统内海水全部排空, 补充未经处理的海水养殖外排水。在每周期补充海水后的第0、1、3、5 d采集储水池中的水样, 采样时间为上午9: 00, 调节水力停留时间约为1 h, 海水养殖外排水盐度约为30。将采集的水样过滤后储藏于–30℃冰箱中保存, 用于氨氮(NH4-N)、亚硝态氮(NO2-N)、硝态氮(NO3-N)和TN浓度的测定。
采集水样的同时, 在本实验的第0、2、4、6、8、12、16、20、24、28 d采集海水人工湿地系统下行池和上行池的表层基质。基质呈正方形排列, 使用5点取样法采样, 将基质中心点和4角采集的样品混合均匀, 同时采集1个平行样。采样时间为上午9: 00, 采样深度为0~5 cm, 采样质量约为5 g。采样结束后将样品储藏于4℃冰箱中, 用于测定脱氢酶、硝酸还原酶和脲酶的活性。
在实验运行结束后, 将系统内海水全部排空, 分别采集海水人工湿地系统下行池和上行池的表层基质细砂和植物根部组织。使用五点取样法采集0~5 cm的基质样品, 将样品混合均匀, 同时采集一个平行样。采样结束后将样品置于50 mL的离心管, 储藏于–80℃冰箱中, 用于测定海水人工湿地系统基质的微生物群落信息。
1.3 水质测定与数据分析本实验的海水养殖外排水取自实验室牙鲆养殖海水, 牙鲆养殖期间定期换水并投喂饲料, 海水养殖外排水中氮污染物NH4-N浓度为0.28~0.56 mg/L, NO2-N浓度为0.66~1.03 mg/L, NO3-N浓度为1.43~ 2.16 mg/L, DON浓度为2.13~5.36 mg/L, TN浓度为5.28~ 8.00 mg/L。海水养殖外排水的理化参数采用多参数水质测定仪测定, 如图 2所示, 实验期间温度(T)为17.55~23.53℃, 盐度为30.61~32.03, 溶解氧(DO)为7.05~8.96、pH为7.52~8.08。
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| 图 2 海水养殖外排水理化参数变化 Fig. 2 Changes in physical and chemical parameters in mari culture wastewater |
NH4-N、NO2-N、NO3-N浓度依据《海洋监测规范》(GB12763 4-2007)进行测定: NH4-N浓度采用靛酚蓝分光光度法测定; NO2-N浓度采用萘乙二胺分光光度法测定; NO3-N浓度采用锌镉还原法测定; TN浓度使用岛津TOC测定仪进行测定。脱氢酶、硝酸还原酶和脲酶活性采用南京建成试剂盒和分光光度法进行测定。采用PCR-DGGE方法对基质和植物根部样品微生物的16s rDNA序列进行分析。使用Origin 8.5软件作图, 用Excel 2010和SPSS 19软件进行数据处理与分析。
2 结果与分析 2.1 无机氮去除效果海水人工湿地系统无机氮浓度变化如图 3所示。每个周期NH4-N和NO2-N浓度下降极为显著, 进水NH4-N浓度为0.28~0.56 mg/L, NO2-N浓度为0.66~ 1.03 mg/L。系统处理海水养殖外排水1 d后, 出水NH4-N和NO2-N浓度远低于0.10 mg/L, 去除率达到95%以上; 系统处理2 d后, NH4-N和NO2-N浓度保持稳定, 二者去除率均高达99%, 去除效果非常显著。海水人工湿地系统对NO3-N去除效果同样良好, 进水NO3-N浓度为1.43~2.16 mg/L, 处理海水养殖外排水1 d后, 出水NO3-N浓度最高为0.24 mg/L, 最低低至2.0×10–3 mg/L; 系统处理外排水2 d后, NO3-N浓度保持平缓, 除第3周期以外, NO3-N去除率均高于95%, 第3周期NO3-N去除速率低于其余周期。海水人工湿地系统对DIN处理效果优异, 进水DIN浓度为2.63~3.48 mg/L, 系统处理1 d后, 出水DIN浓度降至0.10 mg/L以下, 处理2 d后浓度基本保持稳定。
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| 图 3 无机氮浓度变化 Fig. 3 Concentration changes of NH4-N, NO2-N, NO3-N, and DIN |
海水人工湿地系统NH4-N、NO2-N和NO3-N在无机氮中所占比例如图 4所示。每个实验周期进水1 d后NH4-N和NO2-N比例迅速减少, 低至5%以下; NO3-N在系统内积累, 在无机氮中占比高达90%以上, 此时硝化反应在无机氮去除中发挥主要作用。每个周期进水3 d时, 硝态氮所占比例减少, 亚硝态氮所占比例增加, 此时反硝化作用在无机氮去除中起主要作用。
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| 图 4 各种形态的无机氮所占百分比 Fig. 4 The proportion of each form of inorganic nitrogen |
海水人工湿地系统TN和DON浓度变化如图 5所示, 进水TN浓度为5.28~8.00 mg/L, 处理海水养殖外排水1 d后, 出水TN浓度为0.34~0.94 mg/L, 去除率显著升高; 系统处理2 d后, TN浓度基本保持稳定, 除第3周期外, 其余周期TN去除率均高于90%, 实验连续运行期间TN的平均去除率为(92.6±1.5)%, 去除效果良好。海水人工湿地系统对DON的去除效果稍差, 4个周期进水DON浓度为2.13~5.36 mg/L, 处理海水养殖外排水1 d后, 出水DON浓度为0.34~0.70 mg/L, 除第2周期外, 其余周期DON去除率达到80%以上, 4个周期平均去除率为(86.1±4.8)%。
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| 图 5 TN和DON浓度变化 Fig. 5 Concentration changes of TN and DON |
海水人工湿地系统DON和DIN在总氮中的所占比例如图 6所示。在海水养殖外排水进入人工湿地时, DON在TN中所占比例为40.3%~67.1%, 与DIN占比相当。随着实验天数的增长, 海水养殖外排水在人工湿地中循环, DIN所占比例迅速减少, DON在总氮中的比例迅速升高, 最高达到99%以上。
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| 图 6 DON和DIN所占百分比 Fig. 6 Proportions of DON and DIN |
海水人工湿地系统表层基质脱氢酶、硝酸还原酶和脲酶的酶活性变化如图 7所示。实验周期内下行池脱氢酶和脲酶的酶活性均高于上行池, 分别具有显著差异(P < 0.05)和极显著差异(P < 0.01), 这与李智等[17, 20]研究结果保持一致。除第1周期外, 其余周期下行池硝酸还原酶的酶活性同样高于上行池(P < 0.05)。一方面下行池进水污染负荷较大, 氮污染物的去除首要发生在下行池[21], 下行池对污染物的分解作用更强, 微生物数量和酶活性更高; 另一方面, 下行池进水中氮磷含量丰富, 植物生长繁密, 根系比上行池发达, 土壤有机质丰富, 因此下行池对污染物的去除作用大于上行池。
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| 图 7 脱氢酶、硝酸还原酶和脲酶活性 Fig. 7 Dehydrogenase, nitrate reductase, and urease activities |
海水人工湿地系统中脱氢酶活性远小于硝酸还原酶与脲酶, 脱氢酶活性在第3和第4周期中后段呈现稳定增长, 与此同时, 氨氮在17 d和24 d后显著增加(图 4), 这是由于脱氢酶参与了有机氮的反应, 有机氮在氨化细菌的作用下转化为氨氮。硝酸还原酶活性变化起伏较大, 系统进水时酶活性平稳或略有下降, 随着实验天数的延长酶活性迅速上升。在第2、12、16和24 d硝酸还原酶活性增加, 此时硝态氮占比减少, 亚硝态氮比例增加(图 4), 硝酸还原酶参与微生物的反硝化作用, 将硝态氮还原为亚硝态氮[13]。
脲酶活性变化趋势明显, 前两个周期的脲酶活性显著高于后两个周期(图 7所示), 这是由于脲酶活性受到温度的影响, 温度通过影响微生物的数量和活性来影响脲酶的活性[22], 前两个实验周期海水养殖外排水温度高于后两个周期(图 2), 基质脲酶活性与外排水温度间具有显著相关性(r=0.969, P < 0.05)。硝酸还原酶和脲酶活性均表现为变化趋势较大且稳定性差, 对二者进行相关性分析发现, 硝酸还原酶和脲酶下行池酶活性之间具有显著相关性(r=0.7624, P < 0.05), 而上行池酶活性间无明显相关关系。
2.4 人工湿地微生物群落信息海水人工湿地系统微生物的物种多样性指数(香农指数[23])如图 8所示, 表层基质和植物根部微生物多样性指数高, 微生物种类丰富, 其中表层基质的微生物多样性下行池高于上行池, 微生物的数量和物种丰富度与人工湿地氮的去除具有相关性[24], 下行池去污染能力比上行池强, 海水人工湿地系统下行池净化污染物的能力更强, 这与人工湿地基质酶活性在下行池和上行池中的分布趋势保持一致。下行池植物根部处微生物多样性指数为7.09, 高于下行池表层基质的微生物多样性; 上行池植物根部的微生物多样性指数为6.93, 同样高于上行池表层基质。海水人工湿地系统中植物根部处微生物多样性和丰富度较高, 植物在人工湿地除氮中发挥着重要作用, 发达的根系为微生物提供了生存的空间和养分, 丰富了微生物的数量和种类, 从而提高人工湿地系统的除氮效率[25]。
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| 图 8 微生物多样性比较 Fig. 8 Comparison of microbial diversities |
在微生物的群落结构组成上, 海水人工湿地系统植物根部与表层基质的微生物群落组成相似, 具备丰富的脱氮菌群, 这与海水人工湿地系统脱氮效率良好有着密切关系。从微生物的分类上来看, 海水人工湿地中优势菌种是变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes), 两者广泛分布于人工湿地植物根部和基质中。变形菌门的丰富度最高, 含有固氮功能的菌种如硝化菌等, 在海水人工湿地脱氮中发挥了关键作用。
3 讨论人工湿地除氮主要依靠微生物的硝化与反硝化作用[26], pH能够影响微生物的活性进而影响除氮效果, 反硝化细菌适宜生长的pH为6.5~7.5[16]。第3周期pH高于8, 其余周期pH在7~8之间, 第3周期反硝化作用受到抑制。水体pH值还与氨挥发的显著程度密切相关, pH低于7.5时, 氨挥发不显著; 当pH高于9时, 氨挥发尤为显著[27], 人工湿地氨挥发一般在pH大于8的情况下发生[28], 第3周期的氨挥发限制了硝化和反硝化反应的速率。
海水养殖外排水进入系统后, 由于基质上层具有丰富的溶氧, 加上植物根部的泌氧作用, 氮去除反应以好氧的硝化作用为主, 氮污染物从NH4-N转变为NO2-N和NO3-N。此过程分为两步, 第一步是NH4-N在好氧的氨氧化细菌作用下转化为NO2-N, 第二步NO2-N在兼性硝化细菌作用下转化为NO3-N [29]。硝化作用受温度、pH、DO、无机碳和氨氮浓度等因素的影响, 通过改变硝化反应的速率直接影响人工湿地的脱氮效率。硝化反应的适宜温度为30~35℃, 适宜pH为7.0~8.2[28]。海水人工湿地系统采用喷洒式入水, 通过增加水体和空气的接触面积增大水中DO含量, 4个周期温度为15~25℃, pH为7~8, 保证脱氮反应高效稳定进行。
在系统硝化反应过后, 反硝化作用逐渐占主导作用, 在兼性反硝化细菌的作用下, 硝化反应生成的硝态氮以有机碳作为电子供体, 氮氧化物或氧气作为电子受体, 先被还原为亚硝态氮, 最终变为氮氧化物和氮气[27]。此外, 湿地植物也会吸收一部分硝态氮, 并且根系越发达的植物所需营养物质越多, 氮去除效果越好[30]。反硝化作用受温度、pH、DO和有机碳等因素的影响, 通过改变生成物中氮氧化物和氮气的比例影响人工湿地的脱氮效果。海水人工湿地系统运行稳定后, 由于水体内富含氮和磷, 人工湿地爆发藻类。一方面藻类可以通过同化吸收直接吸收含氮污染物[31]; 另一方面, 藻类死亡后可以释放大量有机物[32], 为反硝化作用提供了外源碳源, 加速了人工湿地的脱氮进程。
人工湿地DON的去除主要依靠氨化反应, 有机氮在氨化细菌的作用下转化为氨氮[29], 氨氮再通过硝化和反硝化反应转化为氮气。氨化反应是好氧反应, 它会与硝化反应竞争氧气[33], 因此充足的溶解氧可以保证反应的正常进行和氮去除效果良好稳定。本实验运行期间DO含量为7~8 mg/L, 氨化反应和硝化反应不受抑制, 但海水人工湿地除氮中DON的去除效果仍显著低于DIN。比较不同形态氮的去除效果(图 3和图 5)可以发现, TN与NO3-N浓度变化趋势基本一致, 都表现为第3周期去除速率较低, 这是因为在海水人工湿地系统脱氮以无机氮的去除为主, 主要依靠微生物的硝化和反硝化作用。
脱氢酶在有机质反应中起到传递氢的作用, 第3和第4周期脱氢酶活性增加, 加速有机氮转化为氨氮的反应进程, 氨氮占比增加, 脱氢酶活性影响着人工湿地中氨氮的去除效果, 这与靖玉明等[34]研究结果相似。人工湿地净化海水养殖外排水初期, 氮的去除以硝化作用为主, 随着硝酸还原酶活性增加, 反硝化作用增强, 硝酸还原酶加速人工湿地硝态氮的去除。脲酶活性在第3周期达到最低值, 与海水人工湿地系统NO3-N和TN浓度在第3周期下降缓慢的趋势保持一致, 脲酶活性影响着系统TN和NO3-N的去除效果, 二者存在明显相关趋势, 这与Kong等[35]研究结果一致。硝酸还原酶和脲酶对下行池进水中高污染负荷和污染物分解作用具有相似的影响; 上行池中污染负荷低, 污染分解作用较弱, 无明显相关关系, 这与吴属连[21]的研究结果保持一致。
4 结论(1) 海水人工湿地系统脱氮效果良好, NH4-N、NO2-N、NO3-N、TN和DON浓度显著降低, 平均去除率分别达到(99.6±0.7)%、(99.9±0.0)%、(98.2±2.0)%、(92.6±1.5)%和(86.1±4.8)%。海水养殖外排水中DIN和DON比例相当, 经海水人工湿地系统循环净化后, DIN比例迅速减少, DON比例显著升高, 人工湿地对DIN的去除效果更好。
(2) 海水人工湿地系统下行池酶活性大于上行池, 下行池对污染物的去除效果优于上行池。海水人工湿地系统表层基质脱氢酶活性影响着海水养殖外排水中氨氮的去除; 硝酸还原酶活性对硝态氮的去除具有促进作用; 脲酶活性与人工湿地TN和NO3-N的去除存在相关趋势。
(3) 海水人工湿地系统下行池微生物多样性高于上行池, 植物根部处微生物多样性最高; 植物发达的根部可提高微生物群落的丰富度, 进而提高系统脱氮的效率。人工湿地的优势菌群是变形菌门和拟杆菌门, 变形菌门微生物数量最多, 含有种类丰富的脱氮细菌, 有助于提高海水人工湿地系统的脱氮效率。
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