2019, Vol. 43
文章信息
- 杨静明, 卢虹玉, 谢慧风, 刘亚月, 聂影影, 张永平, 宋采, 秦邦伟, 张翼. 2019.
- YANG Jing-ming, LU Hong-yu, Xie Hui-feng, LIU Ya-yue, NIE Ying-ying, ZHANG Yong-ping, SONG Cai, QIN Bang-wei, ZHANG Yi. 2019.
- 海参酶解物中抗老年痴呆相关活性及成分初步研究
- Preliminary study on anti-Alzheimer's activity and composition in sea cucumber hydrolysate
- 海洋科学, 43(7): 41-52
- Marina Sciences, 43(7): 41-52.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190106001
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文章历史
- 收稿日期：2019-01-06
- 修回日期：2019-03-22
2. 广东海洋大学 深圳研究院, 广东 深圳 518120;
3. 山东圣洲海洋生物科技股份有限公司, 山东 威海 264211
2. Shenzhen Insititute of Guangdong Ocean University, Shenzhen, 518120, China;
3. Shandong Shengzhou Marine Biological Technology Co., Ltd. Weihai, 264211, China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年痴呆的主要类型, 也是目前医学领域研究的热点[1]。目前有关其发病机制众说纷纭, 包括Aβ-淀粉样肽级联假说、胆碱能损伤学说、免疫异常学说、氧化应激假说等[2]。随着人口老龄化的不断加剧, 老年痴呆的发病率逐年增加, 截至2017年, 我国老年痴呆患者人数约为780万, 居世界第一位[3]。因此, 寻找能够有效治疗老年痴呆症的药物已迫在眉睫。随着一系列基于主流的Aβ-淀粉样肽级联假说新药的失败以及科学界对Aβ生理作用的新认识, 传统的胆碱能假说仍然是现有临床药物的主要作用机制, 多功能的胆碱酯酶抑制剂的研究成为新的趋势[4]。另外, 神经炎症假说也愈来愈受重视[5], 近年来的研究表明, AD的发生伴随着慢性炎症反应。Aβ沉积是炎症的诱因, 在Aβ的影响下, 小胶质细胞可诱导炎症因子不断分泌, 这些炎症因子包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、干扰素γ(interferon γ, IFN-γ)等, 由于这些炎症因子既有神经毒性, 又能减弱胰岛素降解酶的降解能力, 而降解Aβ的关键酶是胰岛素降解酶[6], 故炎症反应能够间接促成Aβ的不断沉积, 进而引起神经元的丢失和认知功能障碍, 加快AD的发生发展[7]。故在AD发展进程中, 抑制炎症反应可以减少神经细胞的损伤, 提高学习记忆能力[8]。因此研发新型的胆碱酯酶抑制剂和抗神经炎症药物, 对于防治AD意义重大。
海参(Sea cucumber, Holothurian)属棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)生物。世界海参资源丰富, 全球约有海参1 100余种, 其中可食用者40余种[9]。海参自古以来即被我国人民视为滋补食品, 近年来, 随着人们保健意识的提高, 海参的营养保健价值越来越受到关注[10]。现已证实海参体壁中含有海参多糖、胶原蛋白、磷脂、海参皂苷、脑苷脂、神经节苷脂等多种生物活性物质[11], 而进一步的研究证明其具有免疫调节[12]、抗肿瘤[13]、抗癌[14]、抗真菌[15]、镇痛[16]、抗凝血[17]、抗氧化[18]抗神经炎症[19]等生理药理活性, 其中与抗AD相关的生物活性包括抗氧化活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性和抗神经炎症活性等, 已有一些相关报道, 如刘程慧等[20]从海参酶解产物中分离制备分离得到海参肽Ⅰ, 对DPPH自由基的清除率达56.3%(1 g/L); Lin等[21]发现冰岛刺参(Cucumaria frondosa)的酶解多肽可导致老化小鼠大脑乙酰胆碱酯酶活性降低; Song等[22]采用Griess反应, 评估NO的释放和RT-PCR以确定1L-6和TNF-α在LPS刺激的RAW 264.7鼠巨噬细胞中的1L-4 mRNA表达水平, 结果显示, 刺参提取物具有抗外周炎症的活性。由此可见, 从海参的提取物中寻找和开发抗AD相关活性的物质具有一定的可行性, 将其开发成为干预AD的新型功能性食品乃至药物已经成为海参深度开发利用的重要方向。
脂溶性小分子物质具有更好的血脑屏障透过性, 然而迄今为止, 对海参生物活性的相关研究主要集中在肽类物质, 尚未见到海参脂溶性成分抑制乙酰胆碱酯酶及缓解神经炎症的报道。本研究基于胆碱能缺失假说和神经炎症假说, 主要针对海参酶解原液中的脂溶性小分子成分, 追踪其具有良好乙酰胆碱酯酶抑制活性的组分, 同时对其脂溶性成分也进行了的抗炎活性的探究, 为防治老年痴呆海洋药物与营养保健品的研究提供依据。
1 材料与仪器 1.1 材料与试剂 1.1.1 材料与细胞株海参酶解原液, 由山东圣洲海洋科技生物股份有限公司提供; BV-2细胞株, 购自昆明细胞库。
1.1.2 试剂碘化乙酰硫代胆碱(Acetylthiocholine iodide, ATCI)、5, 5′-二硫代二硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB)、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)、牛血清白蛋白(BSA); Silica gel 60 F254(Merck公司); 大茴香醛, 纯度≥98%, (上海麦克林生化有限公司); 正相硅胶(青岛海洋化工厂); 反相硅胶填料ODS-AQ (日本YMC株式会社); 凝胶填料Sephadex LH-20(瑞士GE-Healthcare Bio-sciences公司); 高糖培养基(DMEM)、0.25% Trypsin-EDTA胰酶、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、磷酸盐缓冲液(Gibco公司)、胎牛血清(Fetal bovine serum, 上海双洳生物科技有限公司); 青霉素-链霉素溶液双抗(Penicillin-Streptomycin Solution, HyClone公司); MTT(苏云生物科技有限公司); 一氧化氮试剂盒(Promega公司); IL-6 ELISA试剂盒(达科为生物技术有限公司); 其他所用试剂及材料均为国产分析纯试剂。
1.2 仪器设备IKA RV10旋转蒸发仪(德国IKA集团); BiotekEpoch2全波长酶标仪(美国博腾仪器有限公司); HP Plus 50D全自动中高压制备液相色谱仪(江苏利穗科技有限公司); Aglient 1260 Ⅱ高效液相色谱仪-配二极管阵列检测器(DAD, 美国Aglient公司); CKX41- A32 PH倒置显微镜(奥林巴斯工业有限公司); Eppendorf 5804R/5810R高速冷冻离心机(德国EPPENDORF公司); SW-CJ-2FD超净工作台(上海博讯实业有限公司); IC1000细胞计数仪(北京伯辉生物科技有限公司); MCO-175 CO2培养箱(日本三洋电机株式会社); SHA-82A恒温振荡器(常州恒隆仪器有限公司)。
Agilent反相C18分析柱, 填料为Poroshell 120 EC-C18, 规格4.6 mm× 250 mm, 填料粒径4.0 μm。
2 实验方法 2.1 海参酶解液的制备 2.1.1 海参酶解每1 kg鲜海参洗净后, 切碎投入酶解罐, 加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶(加入量按照海参重量依次为0.2%、0.125%和0.1%), 料液比为1:1.5, 酶解温度为52℃, 酶解时间为4 h。
2.1.2 酶解液干燥将1 L酶解液经50℃以下减压浓缩至较小体积, 分装入浅盘中, 进行真空冷冻干燥至固体含水量低于5%。
2.2 海参酶解液成分的分析及氨基酸评分 2.2.1 海参酶解液成分的检测将海参酶解液送至广州分析测试中心进行成分检测, 检测采用国标方法, 详见表 1~表 3。
| 分析项目 | 检测结果 | 计量单位 | 检测方法 |
| 总糖 | < 0.5 | g/100 g | GB/T 5009.8-2008/第二法 |
| 灰分 | 1.3 | % | GB 5009.4-2010 |
| 粗脂肪 | < 0.5 | g/100 g | GB/T 5009.6-2003/第一法 |
| 蛋白质(N×6.25) | 2.51 | g/100 g | GB 5009.5-2010/第一法 |
| 钾 | 38.1 | mg/100 g | GB/T 5009.91-2003 |
| 钠 | 402 | mg/100 g | GB/T 5009.91-2003 |
| 钙 | 31.4 | mg/100 g | FAAS(GB/T 5009.90-2003) |
| 镁 | 62.5 | mg/100 g | GB/T 5009.90-2003 |
| 锌 | 1.4 | mg/kg | GB/T 5009.14-2003/第一法 |
| 铁 | 0.23 | mg/100 g | GB/T 5009.90-2003 |
| 锰 | < 0.1 | mg/100 g | GB/T 5009.90-2003 |
| 铬 | < 0.1 | mg/kg | GB 5009.123-2014 |
| 镉 | 0.079 | mg/kg | GB 5009.15-2014 |
| 铅 | < 0.1 | mg/kg | GB 5009.12-2010/第一法 |
| 砷 | 0.48 | mg/kg | GB 5009.11-2014/第一篇第二法 |
| 硒 | 0.145 | mg/kg | GB 5009.93-2010/第一法 |
| 分析项目 | 检测结果 |
| 豆蔻酸(C14:0) | 2.9 |
| 豆蔻一烯酸(C14:1) | 1.5 |
| 十五烷酸(C15:0) | 0.27 |
| 十五碳一烯酸(C15: 1) | 0.37 |
| 棕榈酸(C16:0) | 16.3 |
| 棕榈一烯酸(C16:1) | 11.1 |
| 十七烷酸(C17:0) | 1.8 |
| 十七碳一烯酸(C17: 1) | 0.65 |
| 硬脂酸(C18:0) | 5.3 |
| 油酸(C18:1) | 17.0 |
| 亚油酸(C18:2) | 5.2 |
| 亚麻酸(C18:3) | 5.5 |
| 花生酸(C20:0) | 2.3 |
| 花生一烯酸(C20:0) | 7.1 |
| 花生二烯酸(C20:2) | 1.4 |
| 花生三烯酸(C20:3) | 1.1 |
| ARA(C20: 4) | 6.7 |
| 芥酸(C22:1) | 2.5 |
| EPA(C20: 5) | 6.3 |
| 二十二碳四烯酸(C22: 4) | 2.0 |
| 二十四碳一烯酸(C24: 1) | 0.60 |
| DHA(C22: 6) | 2.0 |
| 注:检测方法GB/T 17377-2008 | |
| 分析项目 | 检测结果 | 分析项目 | 检测结果 | |
| 天冬氨酸ASP | 0.24 | 异亮氨酸ILE | 0.093 | |
| 苏氨酸THR | 0.13 | 亮氨酸LEU | 0.13 | |
| 丝氨酸SER | 0.11 | 酪氨酸TYR | 0.065 | |
| 谷氨酸GLU | 0.36 | 苯丙氨酸PHE | 0.082 | |
| 甘氨酸GLY | 0.28 | 组氨酸HIS | 0.045 | |
| 丙氨酸ALA | 0.15 | 赖氨酸LYS | 0.11 | |
| 缬氨酸VAL | 0.11 | 精氨酸ARG | 0.17 | |
| 蛋氨酸MET | 0.044 | 脯氨酸PRO | 0.17 | |
| 以上水解氨基酸的总和2.3 | ||||
| 注:检测方法GB/T 5009.124-2003 | ||||
氨基酸评分(amino acid score, AAS)也即蛋白质化学评分(chemical score), 该指标是指用被测试蛋白质的必须氨基酸评分模式和推荐的理想模式或参考蛋白的模式进行比较的得分。本文参照成年人的氨基酸需求模式, 对海参酶解液的氨基酸进行评分[23]。
将海参酶解原液冻干粉(617.4 g)依次按极性从小到大用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水五种溶剂按料液比1:1浸泡24 h, 超声提取3次, 每次30 min, 用布氏漏斗抽滤, 合并3次滤液, 用旋转蒸发仪浓缩干燥, 转移至样品瓶, 称重, 得到五部分粗提物。其中正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯粗提物用于接下来活性组分的分离, 甲醇相粗提物与水相粗提物置于4℃隔氧保存。
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| 图 1 海参酶解液提取物分离流程 Fig. 1 Sea cucumber enzymatic hydrolysate extract separation process 注: a:减压柱(玻璃柱, 填料:正相硅胶100~200目), 依次用氯仿、1%甲醇、2%甲醇、4%甲醇、8%甲醇、15%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、纯甲醇梯度洗脱; b:减压柱(玻璃柱, 填料:正相硅胶200~300目), 依次用石油醚:乙酸乙酯=50:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1:1梯度洗脱; c:正相常压柱(玻璃柱, 填料:正相硅胶200~300目), 依次用石油醚:丙酮=50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1梯度洗脱; d:凝胶柱(玻璃柱, 填料Sephadex LH-20), 用氯仿:甲醇=1:3等度洗脱; e:反相硅胶柱(玻璃柱, 填料: C18), 用甲醇:水= 20:1等度洗脱; f:反相硅胶柱(玻璃柱, 填料: C18), 用丙酮:甲醇:水=3:1:1等度洗脱; g:反相液相制备(不锈钢柱, 填料: SinoChrom ODS-AP, 填料粒径15 μm, 规格: 20.0 mm×250 mm)依次用45%、60%、70%、100%乙腈-水梯度洗脱 |
根据化学显色结果及生物活性自显影结果, 将海参粗提物的正己烷相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相进行合并(以下称为“总脂溶性组分”, TLF)。依次通过减压硅胶柱、常压正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、C18反相硅胶柱层析、制备型HPLC用适宜的洗脱体系逐级分离纯化。通过各组分TLC板的紫外特征、茴香醛显色与乙酰胆碱酯酶抑制生物活性自显影斑点等特征, 区分差异组分, 合并相似组分, 定位目标活性化合物, 实现目标活性化合物的追踪分离, 得到具有较好乙酰胆碱酯酶抑制活性的精细组分。
2.4 提取物的乙酰胆碱酯酶抑制生物活性自显影此部分方法参照本实验室之前报道方法[23]。
2.5 目标精细组分的HPLC分析将精细组分用色谱甲醇配成浓度为1 g/L的样品溶液, 进样量为10 μL, 洗脱条件为: 0~5 min, 60%~ 100%的甲醇-水; 15~20 min, 100%纯甲醇; 20~25 min, 100%~60%的甲醇-水。流速1 mL/min。DAD检测器信号采集波长为: 190~500 nm, 监测波长: 254 nm及210 nm。
2.6 目标精细组分的IC50值的测定此部分方法参照本实验室之前报道方法[24]。
2.7 海参总脂溶性组分抗炎活性研究 2.7.1 MTT法检测细胞活性采用MTT法检测海参酶解液TLF对BV-2细胞的生长影响。参考Wang等[25]的方法, 选择处于对数生长期的BV-2细胞制成单细胞悬液, 调节细胞密度为5.04×104个/mL, 接种于96孔板, 每孔体积为100 μL, 培养24 h后, 需换一次培养基, 每孔加新的无血清培养基100 μL, 根据实验情况而定, 设空白对照组、模型组和实验组, 每组设5个平行孔, 空白组加入50 μL DMEM, 模型组加入含0.5%DMSO的DMEM培养基50 μL, 实验组加入各浓度样品50 μL。置CO2培养箱中孵育24 h后, 往每个孔中加入20 μL的MTT(5 g/L)溶液, 继续放入培养箱培养4 h后, 弃去培养液的上清部分。再往每个孔中加入100~150 μL DMSO溶液, 震荡10 min, 待蓝紫色结晶充分溶解后, 在波长490 nm下测定OD值, 按照下面的计算公式进行计算细胞存活率。
计算公式:
采用Griess法检测TLF对LPS诱导的BV-2细胞中NO的含量。在BV-2细胞到达对数生长期时, 将其分散为单细胞悬液, 调节其密度为1.14×105 /mL, 均匀接种于96孔板, 每孔100 μL, 待细胞生长至贴壁后, 更换一次培养液, 每孔加入新的培养液(不含血清)100 μL, 根据实验情况而定, 设置空白对照组、模型组和实验组, 每组分别设置5个平行, 其中空白对照组和模型组每孔加入50 μL DMEM, 实验组加入不同浓度的样品各50 μL。将96孔板放置于培养箱中继续培养24 h后, 在空白对照组的孔中加入50 μL DMEM, 模型组和实验组则分别加入50 μL的LPS(1 μg/mL), 诱导刺激细胞17 h后, 收集细胞上清液, 按照一氧化氮试剂盒说明书操作, 在波长540 nm下测定OD值, 根据标准曲线求出NO的浓度。
2.7.3 ELISA法检测IL-6采用ELISA法检测TLF对LPS诱导的BV-2细胞中IL-6的水平。在BV-2细胞到达对数生长期时, 将其分散为单细胞悬液, 调节其密度为1.23×105个/mL, 均匀接种于96孔板, 每孔100 μL, 待细胞生长至贴壁后, 更换一次培养液, 每孔加入新的培养液(不含血清)100 μL。实验分为空白对照组、DMSO组(浓度为0.5%)、LPS组(1 μg/mL)和实验组(加入样品的终浓度依次为80、120、160、200 μg/mL), 每组分别设置5个平行, 空白对照组和LPS组每孔加入50 μL DMEM, DMSO组加入含0.5% DMSO的DMEM培养基50 μL, 实验组加入各浓度的样品50 μL。置于培养箱中继续培养24 h后, 空白对照组加入50 μLDMEM, DMSO组、LPS组和实验组分别加入1 μg/mL LPS 50 μL, 诱导刺激细胞19 h后, 收集细胞上清液, 2 000 r/min离心20 min。详细步骤按照试剂盒说明书进行操作, 在波长450 nm下测定OD值, 计算细胞上清液中IL-6的含量。
2.7.4 统计学分析实验结果用均数±标准差x±s表示, 应用SPSS17.0软件进行数据处理以及分析, 对各组数据进行单因素方差分析和LSD检验, 以P < 0.05表明有显着性差异, 具有统计学意义。
3 结果 3.1 海参酶解液固形物含量及基本成分分析及氨基酸评分 3.1.1 海参酶解液成分分析海参酶解液成分分析结果显示(表 1~表 3), 其主要成分为:矿物质占24.3%(如含钙31.4、铁0.23、锌1.4、硒0.145 mg/kg), 总糖占1.48%, 粗脂肪占2.4% (其中亚油酸占比5.2%, 亚麻酸5.2%, ARA 6.2%, EPA 5.4%, DHA 1.9%), 蛋白质总含量占55.2% (含多种必需氨基酸, 如植物性食物中缺少的限制性氨基酸-赖氨酸2.33%、苏氨酸2.01%)。
从表 2可看出海参酶解液中含有大量不饱和脂肪酸, 2011年, Lou等[26]采用GC-MS对海参体壁脂肪酸进行分析, 发现其含有C20: 4, 而它具有改善记忆力和视力、调节血脂和血糖、神经功能调节等作用; 海参酶解液中含有大量的(6.7%)C20: 4, 因此其可能具有潜在的神经保护作用, 其也可能成为C20: 4的重要膳食来源。
3.1.2 海参酶解液氨基酸评分参照成人所需氨基酸的标准, 对海参酶解液中的各人体必需氨基酸进行评分, 从表 4可以看出:海参酶解液中的需氨基酸含量可满足成人所必须的氨基酸。
| 氨基酸 | 成人所需蛋白质中必需氨基酸含量/(mg/g) | 海参酶解液蛋白质必需氨基酸含量/(mg/g) | 氨基酸评分 |
| 异亮氨酸 | 13 | 40.4 | 311 |
| 亮氨酸 | 19 | 56.5 | 297 |
| 赖氨酸 | 16 | 47.8 | 298 |
| 苯丙氨酸+酪氨酸 | 17 | 63.9 | 375 |
| 苏氨酸 | 9 | 56.5 | 627 |
| 缬氨酸 | 13 | 47.8 | 367 |
| 最终氨基酸评分 | 297 | ||
为探讨海参经酶解后脂溶性物质的抗老年痴呆相关活性, 本文采用不同极性溶剂提取其脂溶性成分, 对其进行了乙酰胆碱酯酶抑制活性和抗炎活性的研究。
将正己烷相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相粗提物, 用合适的展开剂在TLC薄层层析板上展开(图 2)。从展开结果来看, 正己烷相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相提取物三相的组分均较为丰富, 且通过茴香醛-硫酸显色可以看出此三相具有多个相似组分, 且都具有乙酰胆碱酯酶抑制活性, 故将三相粗提物合并为总脂溶性组分(total liposoluble fraction, TLF)。
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| 图 2 脂溶性组分活性自显影及化学显色对比 Fig. 2 Comparison of the bioautography and chemical coloration of the liposoluble fractions 注:正:正己烷; 二:二氯甲烷; 乙:乙酸乙酯; A: 254 nm紫外图像; B: 365 nm荧光图像; C:茴香醛硫酸化学显色; D:乙酰胆碱酯酶抑制活性自显影 |
一次减压柱后, 将洗脱下来的组分用合适的展开剂在TLC薄层层析板上展开, 采用薄层生物活性自显影追踪其AChE抑制活性成分(图 3)。由于HS-1~HS-3洗脱的组分极性较小, 前三个洗脱梯度洗脱下来的组分极性较小, TLC展开效果不理想; HS-4~HS-8都有AChE抑制活性, HS-10~HS-17的AChE抑制活性很明显且较集中。
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| 图 3 中等级性洗脱组分的薄层层析图及活性自显影图 Fig. 3 Thin layer chromatograms and bioautographies of medium elution fractions 注: A: 254 nm紫外图像; B: 365 nm荧光图像; C:乙酰胆碱酯酶抑制活性自显影 |
经过正相硅胶柱、凝胶柱逐级纯化过的精细组分, 继续利用制备液相进行反相制备, 将相似组分C4-2~C4-2-6合并利用制备型液相采取截峰收集模式, 洗脱体系为:乙腈-水梯度洗脱, 得到的9个精细组分进行薄层层析和生物活性自显影, 结果表明, C4-4-E、C4-4-F6、C4-4-F9有较强乙酰胆碱酯酶抑制活性。从图 4薄层化学显色及活性结果可知, 组分C4-4-F6和组分C4-4-F9具有相似组分, 且乙酰胆碱酯酶抑制活性斑点位置相同, 可以推测两者可能具有相似活性组分。对这三个组分分别进行高效液相分析, 进一步检测其纯度。
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| 图 4 C18反相制备柱洗脱组分的薄层层析图及活性自显影图 Fig. 4 Thin layer chromatograms and bioautography of elution fractions from C18 reversed-phase preparative column 注: A: 254 nm紫外图像; B: 365 nm荧光图像; C:茴香醛硫酸化学显色; D:乙酰胆碱酯酶抑制活性自显影 |
由图 5可知, 组分C4-2-E只有一个主峰, 保留时间为10.694 min, 该主峰峰面积占比85.3%。组分C4-2-F6主峰的保留时间为14.703 min, 峰面积占比29.3%; C4-2-F9主峰的保留时间为14.716 min, 峰面积占比30.7%;组分C4-2-F6与组分C4-2-F9两组分的主峰保留时间极为接近, 对照组分C4-2-F6在保留时间为14.703 min的紫外光谱和组分C4-2-F9在保留时间为14.716 min的紫外光谱, 两者紫外光谱很相似, 且都在波长280 nm下有最大吸收, 推测两者可能是同一系列物质。
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| 图 5 三个目标精细组分的HPLC图谱及主峰UV图谱 Fig. 5 HPLC chromatogram and UV map of three targeted fine components |
图 6显示:在同等浓度下, 三个目标组分中, C4-2-E对乙酰胆碱酯的抑制率最强, 在浓度为0.25 g/L时, 抑制率达91.04%。而C4-2-F6和C4-2-F9定量检测乙酰胆碱酯酶抑制活性较弱, C4-2-F6在最大浓度0.5 g/L时, 抑制率为28%。
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| 图 6 C4-2-E、F6、F9组分AChE抑制率 Fig. 6 Inhibition rates of samples C4-2-E、F6、F9 to AChE |
由图 7可见, TLF在75~150 g/mL的范围内, 对细胞没有抑制作用, 但超过300 g/mL, 会对细胞有明显的毒性作用, 会对细胞的生长造成影响, 原因在于样品的浓度过高, 其中对细胞有害物质的浓度的增加以至于影响到细胞的生长。设置正常组的细胞活性为100, 与空白组相比, DMSO(浓度为0.05%) 75~150 μg/mL的混合层分离组分作用BV-2细胞24 h, 其细胞活性差异均无统计学意义(P > 0.05), 表明无明显细胞毒性作用。而300 μg/mL的TLF有明显的抑制作用(P < 0.05), 说明300 μg/mL的TLF在这个实验剂量范围内有毒性作用, 因而选择这个剂量范围以内的浓度进行下一步检测。
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| 图 7 总脂溶性组分对BV-2细胞活性的影响 Fig. 7 Effect of mixed solvent soluble fraction on the activity of BV-2 cells 注:与空白组相比, *P < 0.05 |
在一定的浓度范围内, TLF能够明显的抑制LPS诱导BV-2细胞分泌NO, 均具有抑制效果(图 8a)。与空白组相比, BV-2细胞经1 μg/mL LPS处理17 h后NO分泌水平明显升高, 不同剂量(***P < 0.001), 说明LPS刺激小胶质细胞由静息状态转化为活化状态, 成功建立炎症细胞模型。不同浓度TLF处理BV-2细胞24 h, 可明显的抑制LPS刺激BV-2细胞释放NO, 具有统计学意义(###P < 0.001), 因此选择TLF进行进一步的抗炎检测。
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| 图 8 总脂溶性组分对LPS诱导BV-2细胞上清液中NO含量(a)和IL-6(b)分泌的影响 Fig. 8 Effect of the mixed solvent soluble fraction on the content of NO and secretion of IL-6 in the culture supernatants of BV-2 cells induced by LPS 注:与空白组相比, **P < 0.01, ***P < 0.001;与模型组相比, ##P < 0.01, ###P < 0.001 |
在一定的浓度范围内, TLF抑制LPS诱导BV-2细胞中IL-6的表达, 为治疗炎症方面提供了理论依据(图 8b)。与空白相比, LPS诱导BV-2细胞内IL-6分泌明显增加, 具有统计学差异(***P < 0.001)。而在与LPS组相比, 80、120 μg/mL的TLF并没有抑制LPS刺激BV-2细胞中IL-6的表达, 不具有显著性差异(#P > 0.05), 160、200 μg/mL的TLF有效的抑制了LPS处理后BV-2细胞内IL-6水平, 具有统计学意义(##P < 0.01)。
4 讨论本研究采用酶解海参, 目的在于最大程度的使海参体内的小分子活性成分得到释放; 对海参酶解液成分进行分析, 结果显示其含有多种人类必须营养物质, 其中人体必需氨基酸的含量大大高于成人每日所必须的量。其中的营养成分如DHA等对老年痴呆具有改善作用。如:胡为民等[26]用富含DHA的饲料喂养AD小鼠共5个月, 其脑内的Aβ水平下降60%, 可能通过减少炎性细胞介质分泌, 减轻炎症反应; 恢复不饱和脂肪酸在脑磷脂中的正常比例, 维持正常的脑细胞膜稳定性, 防止脑细胞的退行性变, 减少了Aβ在脑内的沉积, 减轻其病理改变。故海参酶解液含有丰富的抗老年痴呆相关活性物质。
胆碱能假说表明导致AD患者失忆的直接原因是大脑内神经递质-乙酰胆碱(ACh)的缺失, 故用乙酰胆碱酯酶抑制剂抑制AChE的活性, 延缓ACh水解的速度, 提高突触间隙ACh的水平, 从而发挥对AD的治疗作用[27]。但现阶段尚未见到海参脂溶性成分抑制乙酰胆碱酯酶及缓解神经炎症的报道。故本文采用活性追踪引导的方法对海参酶解液进行提取分离, 并追踪其各级组分的乙酰胆碱酯酶抑制活性, 从而分离出具有良好乙酰胆碱酯酶抑制活性的组分。
1994年, Whitehouse等[19]发现SAMP8小鼠的记忆受损, 膳食海参葡萄糖脑苷脂(SCG)显著改善了这些小鼠的空间记忆缺, 因此, SCG在AD中具有潜在的改善作用, 并且外源性鞘脂摄入可能潜在地影响体内的鞘脂代谢; 2016年, Song等[28]测试了海参肽(SCP)在脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7鼠巨噬细胞中的抗炎作用, 结果表明, SCP通过抑制NF-κB和MAPK活化并在巨噬细胞中诱导HO-1表达而发挥抗炎功能; 2018年, Olivera等[29]发现, 来自尤卡坦半岛的冻干海参Isostichopus badionotus的提取物在体内表现出强大的抗炎活性, 它们减弱由炎症因子引起的组织学破坏, 抑制包括TNFα, iNOS, COX2, NFκB或IL-6在内的促炎基因的表达, 并略微增强抗炎或存活基因的表达。本文进一步对海参酶解液提取物的总脂溶性组分进行了抗炎活性的测定, 采用小胶质细胞BV2, 测试其对NO和1L-6表达产生的影响, 其异于以上文献报道中所采用的细胞, 结果表明, TLF能够明显抑制LPS诱导BV-2细胞分泌NO, 且能抑制BV-2细胞中IL-6的表达, 表明其小分子脂溶性组分具有潜在的抗神经炎症活性, 异于上述文献报道的海参肽, 对海参葡萄糖脑苷脂的改善记忆作用也是一个重要的补充。此研究为海参的抗老年痴呆相关活性药物的开发提供了理论依据。但是, 由于实验时间和条件的限制, 其具体的胆碱酯酶抑制、抗神经炎症等抗阿尔茨海默症的成分还需要更深入的研究。
5 结论海参酶解液能满足成年人日常身体所必须的蛋白质需求量, 且具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性和抗神经炎症活性, 通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性, 可延缓ACh水解的速度, 提高突触间隙ACh的水平, 从而发挥对AD的治疗作用; 通过抑制LPS诱导BV-2细胞分泌NO和抑制BV-2细胞中IL-6的表达, 从而起到神经保护作用。本研究是对现有海参抗老年痴呆相关活性成分研究的有益补充, 并为开发海参来源的新型抗老年痴呆相关活性药物及功能性食品的开发提供了一定的理论依据。
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