2019, Vol. 43
文章信息
- 肖懿哲, 姚成杰, 朱友芳, 孙玉龙, 张子平, 王艺磊. 2019.
- XIAO Yi-zhe, YAO Cheng-jie, ZHU You-fang, SUN Yu-long, ZHANG Zi-ping, WANG Yi-lei. 2019.
- 真蛸FAXDC2基因的克隆及其表达分析
- Cloning and expression of FAXDC2 in Octopus vulgaris
- 海洋科学, 43(8): 56-63
- Marina Sciences, 43(8): 56-63.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190419003
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文章历史
- 收稿日期：2019-04-19
- 修回日期：2019-06-25
2. 集美大学 水产学院, 福建 厦门 361021;
3. 福建农林大学动物科学学院, 福建 福州 350002
2. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China;
3. College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
真蛸(Octopus vulgaris)别名母猪章、章鱼、八爪鱼, 隶属于软体动物(Mollusca)、头足纲(Cephalopods)、八腕目(Octopoda)、蛸科(章鱼科, Octopodidae)、蛸亚科(章鱼亚科, Octopodinae)、蛸属(章鱼属, Octopus), 属世界暖水性种, 广泛分布于日本以南太平洋、印度洋、大西洋和地中海海域[1-2]。真蛸肉质鲜美、营养丰富、生长速度快[3], 已成为一种极具养殖潜力的种类。研究人员在真蛸分子生物学方面开展了部分研究:采用分子生物学的方法对野生真蛸幼体所摄食的食物进行种类鉴定[4]; 对真蛸谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶基因克隆、序列特性进行分析[5]等。
脂肪酸羟化酶结构域蛋白2(Fatty Acid Hydroxylase domain-containing protein 2: FAXDC2)是脂肪酸羟化酶家族的成员, 与机体相关脂肪代谢途径相关, 同时它们具有完整的膜蛋白结构[6-8]。目前己克隆了几种软体动物的FAXDC2基因, 如加州双斑蛸(O.bimaculoides)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)、霸王莲花青螺(Lottia gigantean)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、美洲牡蛎(C. virginica)等, 但这几种软体动物FAXDC2基因的结构特征及真蛸的FAXDC2基因(OvFAXDC2)序列尚未见报道。为了研究真蛸幼体在饥饿的情况下脂肪代谢情况, 为今后的真蛸幼体培育提供一些基础数据, 本研究从真蛸转录组数据库中筛选获得OvFAXDC2序列, 采用从头至趾的方法验证序列的准确性, 进行了生物信息学分析, 研究了OvFAXDC2在真蛸不同组织中的表达及刚孵岀的真蛸幼体在不同的饥饿时间OvFAXDC2表达量的变化。
1 材料与方法 1.1 实验用的真蛸样品用于验证OvFAXDC2序列的准确性及测定OvFAXDC2在真蛸不同组织中的表达情况的真蛸样品采集于福建省莆田南日海区, 体质量1.5 kg~2.0 kg, 共6只, 解剖取消化腺、肌肉、鳃、鳃心、胃和唾液腺等组织储存于液氮中, 随后进行RNA提取。用于不同的饥饿时间对OvFAXDC2表达量的影响的幼体培育水温22.5±0.5℃, 试验在100 L的水体中进行, 每组放入刚孵出的真蛸幼体1 000只, 从真蛸幼体孵出时开始计时, 不投喂任何饵料, 设置3个平行组, 采集不同时相的样品, 每个时相各3份样品储存于液氮中。
1.2 实验方法 1.2.1 真蛸总RNA的提取及模板制备用Omega(上海)总RNA试剂盒提取真蛸消化腺、肌肉、鳃、鳃心、胃、唾液腺等组织及不同时相幼体的RNA, 采用ND-1000超微量紫外分光光度计及凝胶电脉系统检测RNA质量, 逆转录用的M-MLV酶从Promega公司采购。
1.2.2 OvFAXDC2序列准确性验证在本课题组完成的真蛸转录组高通量测序数据中筛选获得OvFAXDC2全长序列, 引物设计采用Primer Premier5软件, 采用的验证引物为: OvFAXDC2-F: AAGCACATCGGAGCATCT, OvFAXDC2-R: CAGGA CTGGCACGGAACA, 实验用的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.2.3 OvFAXDC2生物信息学分析参照李文辉等[9]方法进行序列的多重比对、三维结构和系统进化树构建。采用ExPASy软件预测蛋白质的等电点及分子量。采用NetPhos 2.0 Server预测磷酸化位点。三级结构的预测所用软件为SWISS- MODEL。序列的多重比对采用BioEdit软件, 系统进化树的构建采用MEGA5.0软件。
1.2.4 OvFAXDC2的荧光定量RT-PCR采用罗氏公司LightCycler 480实时定量PCR仪进行样品表达检测, 每个测定样品均设定3个平行, 使用真蛸β-actin作为内参基因(β-actin-qPCR–F: TGATGGCCAAGTTATCACCA, β-actin-qPCR-R: TG GTCTCATGGATACCAGCA), 目的基因正反向引物为: OvFAXDC2-qPCR-F: TTCTGCATCACCCAGCCTTA, OvFAXDC2-qPCR-R: GGTGATGGGAGAAAGGGGAA。参照肖懿哲等[10]测定方法进行测定, 采用SPSS 20.0软件进行显著性检验, P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 真蛸总RNA的提取及OvFAXDC2序列准确性验证提取的真蛸总RNA样品利用1%的琼脂糖凝胶电泳和ND-1000超微量紫外分光光度计测OD值, 电泳检测结果表明该RNA提取质量好, 满足后续试验的需要。采用验证引物所得到ORF序列与高通量转录组测序时所得到ORF序列完全相符。
2.2 OvFAXDC2序列分析OvFAXDC2 cDNA全序列长度为1 384 bp(图 1), 其中包含1 056 bp的开放阅读框(ORF), 编码351个氨基酸, 100 bp的5′非编码区(UTR), 228 bp的3′UTR, 3′UTR含有一个AATAA多聚核苷酸化信号序列。预测的蛋白质的相对分子量(MW)为3.98 kDa, 理论等电点(pI)为8.93。在该序列中发现了17个丝氨酸磷酸化位点, 10个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点。有2个糖基化位点, 无信号肽。多重序列比对显示OvFAXDC2有4个跨膜螺旋区域(37 aa~59 aa, 87 aa~109 aa, 145 aa~164 aa, 244 aa~266 aa)。且由SEG程序检测到在88 aa~101 aa范围内存在1个低组合复杂性的区域。
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| 图 1 OvFAXDC2基因全长cDNA及氨基酸序列 Fig. 1 The full-length cDNA and the deduced amino acid sequence of OvFAXDC2 注: 5′和3′非编码区序列分别用大写英文字母表示, 小写碱基代表开放阅读框, 丝氨酸的17个磷酸化位点用三角形标记, 苏氨酸的10个磷酸化位点用圆圈标记, 酪氨酸的4个磷酸化位点用箭头标记; 起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)以粗体表征。4个跨膜螺旋区域(37 aa~59)(aa, 87 aa~109)(aa, 145 aa~164)(aa, 244 aa~266)(aa)分别用灰色背景, 下划线, 单波浪线, 双波浪线标记。多聚核苷酸化信号序列(AATAA)以下划线和粗体标示。 |
图 2为OvFAXDC2推导的氨基酸构建的三维结构, 预测OvFAXDC2由2个α螺旋组成, 1个β折叠以及1个无规则卷曲组成。
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| 图 2 OvFAXDC2空间结构模拟 Fig. 2 The predicted three-dimensional structure of OvFAXDC2 |
将OvFAXDC2的氨基酸序列与NCBI中已有的其他物种FAXDC2蛋白进行多重序列比对分析, 发现OvFAXDC2蛋白与头足类动物加州双斑蛸的FAXDC2蛋白有最高的同源性, 一致性为97.6%, 与虾夷扇贝、霸王莲花青螺、海蜗牛(Aplysia californica)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus)、切叶蚁(Acromyrmex echinatior)的一致性为53%~63% (图 3)。
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| 图 3 OvFAXDC2和其他物种OvFAXDC2氨基酸序列多重比对 Fig. 3 Multiple alignment of the FAXDC2 amino acid sequence between O. vulgaris and other species *.一致的氨基酸 *. The same amino acid |
根据已在NCBI上注册的FAXDC2氨基酸序列信息, 使用MEGA7.0软件以N-J法构建12种生物的FAXDC2系统进化树(图 4), 具体多重比对及系统发育分析所用到的各物种名称及序列号见表 1, 结果为:爬行类与鱼类聚为一大支同属于脊椎动物, 真蛸和加州双斑蛸聚为一支而后和同为软体动物的虾夷扇贝、美洲牡蛎、太平洋牡蛎聚为一支, 而与其他无脊椎动物分开。
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| 图 4 FAXDC2系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of the FAXDC2 amino acid sequences between O. vulgarisand other species |
| 物种名称 | 基因登录号 |
| 热带爪蟾(Xenopus tropicalis) | XP_002932361.1 |
| 金毛鼹(Chrysochloris asiatica) | XP_006863977.1 |
| 小马岛猬(Echinops telfairi) | XP_004696805.1 |
| 墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus) | XP_007232192.2 |
| 黄鳝(Monopterus albus) | XP_020467607.1 |
| 美洲牡蛎(Crassostrea virginica) | XP_022321751.1 |
| 太平洋牡蛎(Crassostrea gigas) | XP_011422523.1 |
| 虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis) | XP_021339048.1 |
| 造纸胡蜂(Polistes dominula) | XP_015172058.1 |
| 切叶蚁(Acromyrmex echinatior) | EGI67593.1 |
| 真蛸(Octopus vulgaris) | |
| 霸王莲花青螺(Lottia gigantea) | XP_009065425.1 |
| 海蜗牛(Aplysia californica) | XP_005105015.1 |
| 尾叶蜂(Priapulus caudatus) | XP_014665690.1 |
| 加州双斑蛸(Octopus bimaculoides) | XP_014786293.1 |
实时荧光定量PCR结果显示, OvFAXDC2在所有检测的组织中均有表达, 在消化腺中表达水平最高, 在鳃和鳃心中表达量次之, 在肌肉、唾液腺和胃中的表达量较低(图 5)。
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| 图 5 OvFAXDC2基因在各组织相对表达量 Fig. 5 Distribution pattern of OvFAXDC2 in different tissues of O. vulgaris 字母不同表示有显著性差异(P < 0.05), n=6 Different letters showed significant difference (P < 0.05), n=6 |
由图 6可看出幼体在饥饿过程中, 随着时间的推移, OvFAXDC2表达量先升后降, 在第三天达到最高。在试验第三天幼体发白, 活力下降。
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| 图 6 不同的饥饿时间OvFAXDC2基因相对表达量 Fig. 6 Relative expression level of OvFAXDC2 gene at different starvation times 字母不同表示有显著性差异(P < 0.05), n=3 Different letters showed significant difference (P < 0.05), n=3 |
序列分析显示OvFAXDC2有四个跨膜螺旋区域(37 aa~59aa, 87 aa~109aa, 145 aa~164aa, 244 aa~ 266aa), 为真蛸和头足类动物加州双斑蛸共有的位点, 这些位点可能在真蛸中具有某种功能, 具体功能尚需进一步验证。OvFAXDC2蛋白与加州双斑蛸的FAXDC2蛋白有最高的同源性, 一致性为97.6%, 在其他物种中的相似性为53%~63%, 且在结构域范围内相似度最高, 这暗示着OvFAXDC2功能的保守。系统发育分析得出爬行类与鱼类聚为一大支同属于脊椎动物, 而真蛸和加州双斑蛸聚为一支而后和同为软体动物的虾夷扇贝、美洲牡蛎、太平洋牡蛎聚为一支, 而与其他无脊椎动物分开, 这些结果也充分表明本研究所得到的基因序列为OvFAXDC2并且OvFAXDC2蛋白进化与传统的物种进化系统一致。
在鱼类与脂肪代谢有关的基因如大黄鱼(Larimichthys crocea)PPARs9(过氧化物酶体增殖物激活受体)和LPL(脂蛋白脂肪酶)基因[11]、真鲷(Pagrus major)UCP2(解偶联蛋白)基因[12]等的研究中, 得出了在肝脏中其表达量最高的结论, 分析认为与鱼类肝脏是脂类合成与分解代谢的主要场所有关。本次试验结果表明: OvFAXDC2在真蛸6个组织中均表达, 在消化腺中相对表达量显著高于其他组织(P < 0.05), 在鳃和鳃心中次之, 在肌肉、唾液腺和胃中的表达量较低。这表明消化腺作为一个重要的代谢器官, 在脂肪酸代谢过程中扮演着重要角色, 参与了脂肪代谢与免疫相关的生理调节, 这为后续相关代谢研究提供了相应分子生物学基础。
已有研究表明, 饥饿胁迫会改变尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲鲶(Clarias gariepinus)等鱼类机体肌肉及肝脏等组织脂肪酸的组成模式, 降低机体脂肪含量、血清甘油三酯等[13, 14]。然而, 饥饿胁迫下的脂肪水平及生理生化物质的变化与基因层次的表达量上升或者降低的关系还有待深入研究。因此, 从分子层面探讨脂肪的分解利用及生物合成有助于阐明饥饿胁迫下脂肪代谢的过程。在虎龙斑(为斜带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)和棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)杂交种)[15]和瓦氏黄颡鱼[16] (Pelteobagrus vachelli)饥饿试验表明, 随着试验时间的延长, 与脂肪代谢相关的基因先上调后下降。真蛸中的OvFAXDC2同样也存在这一现象, 在饥饿过程中, 随着时间的推移, OvFAXDC2表达量先升后降, 在饥饿第三天时表达量最高, 随后逐渐降低, 这说明真蛸幼体在饥饿过程中大量消耗体内脂肪, OvFAXDC2表达量升高, 后因脂肪无法持续供应, OvFAXDC2表达量开始下降, 这也同样说明OvFAXDC2在真蛸发育早期的脂肪代谢过程中起到了重要作用。
在饥饿过程中, 多数水生动物首先动用糖原和脂肪, 如黑鲷(Acanthopagrus schlegeli) [17]、欧州鳗鲡(Anguillaanguilla) [18]及狗鱼(Esox lucius)[19]等, 但真蛸在饥饿时首先动用蛋白质后再消耗脂肪[20], 本次饥饿试验第三天苗体发白, 活力下降, 与OvFAXDC2表达量最高相吻合, 说明试验第三天苗体己动用了体内脂肪作为能量, 幼体开始因能量即将耗尽而衰竭, 因此OvFAXDC2表达量的变化趋势可作为幼体代谢是否正常的一个指标。
对小鼠的FAXDC2研究表明, FAXDC2是脂肪酸羟化酶家族中的成员之一, 脂肪合成在巨核分化中发挥重要功能, 其异常低表达可能与白血病的形成相关[21]; 在干姜附子肉桂汤引起大鼠溃疡的研究中, 发现大鼠口腔溃疡时FAXDC2表达量明显上调[22]。可见FAXDC2的上调或下降会引起机体相应的病理变化, 至于FAXDC2的表达异常会引起真蛸哪些病理变化有待于今后的进一步研究。
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