2020, Vol. 44
文章信息
- 夏苏杭, 全艳玲, 周艳文, 陈东旭, 康宏伟, 吕哲, 陈爽, 高乙宁, 李娜, 解生权, 高鹏. 2020.
- XIA Su-hang, QUAN Yan-ling, ZHOU Yan-wen, CHEN Dong-xu, KANG Hong-wei, LV Zhe, CHEN Shuang, GAO Yi-ning, LI Na, XIE Sheng-quan, GAO Peng. 2020.
- 海洋污损细菌分离纯化及金属离子抑菌研究
- Separation and purification of marine fouling bacteria and inhibition of metal ions
- 海洋科学, 44(1): 75-80
- Marine Sciences, 44(1): 75-80.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190620001
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文章历史
- 收稿日期：2019-06-20
- 修回日期：2019-08-08
2. 海洋装备用金属材料及其应用国家重点实验室, 辽宁 鞍山 114000;
3. 辽宁经济职业技术学院, 辽宁 沈阳 110122
2. State Key Laboratory of Marine Equipment Steel and its Application, Anshan Iron and Steel Research Institute, Anshan 114000, China;
3. LiaoningVocational Institute of Economics, Shenyang 110122, China
海洋生物污损给海洋产业、海洋工程以及海洋装备造成了一系列不利的影响[1]。生物污损一般分为污损微生物和大型污损生物[2], 过程如下:材料表面被一些有机物和无机物吸附, 改变材料表面特征, 如电荷的电性、亲水疏水性等形成生物膜的条件, 从而形成条件膜[3]。条件膜起到了促进细菌、微型藻类的附着的作用[4]。黏附污损微生物附着后, 不断生长繁殖, 黏附污损微生物表面分泌出胞外聚合物(EPS), EPS是大分子黏性物质, 能够改变细胞表面的物理化学性质, 这些大分子黏性物质对黏附污损微生物细胞之间的吸附、聚集等起有利作用[5], 最终形成一层具有一定厚度的微生物膜[2, 6]。微生物膜为大型污损生物提供了丰富的营养物质和良好的生长环境, 它们的幼虫或孢子黏附在微生物膜上, 并不断地发育生长, 分泌各种高强度黏附胶附着在物体表面, 最终发展形成大型生物污损层[7]。拟分离鉴定模拟海水环境中镀钴基、镍基及含铜氧化钛基膜的船用厚钢板试样片在海水中吸附的早期污损细菌[8], 研究钴、镍及铜金属离子浓度对早期污损细菌的影响, 对研究一种新型防污涂层具有重要意义[9]。
1 材料与方法 1.1 试验材料钢样:来自海洋装备用金属材料及其应用国家重点实验室, 钢片基体是AH32海工钢, 采用等离子喷涂技术处理钢样[10], 在钢样表面镀钴基、镍基及含铜氧化钛基涂层, 圆柱体钢片直径24 mm, 厚度8 mm。正方体钢片边长20 mm, 厚度为5 mm。
药品:分离细菌采用的营养琼脂、生理生化鉴定实验所用培养基试剂主要来自国药集团化学试剂有限公司和北京奥博生物技术有限责任公司。
仪器: HZQ-F160振荡培养箱, JD3000-3电子天平, LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器, SW-CJ-2FD双人单面垂直洁净工作台, LRH-250A生化培养箱, BM1000数码生物显微镜。
1.2 钢片吸附早期污损细菌分离纯化将钢样放入250 mL锥形瓶内, 倒入足以没过钢样的海水, 塞紧棉塞, 放入振荡培养箱内, 调节振荡培养箱内温度为25℃、振荡频率为120 rpm, 以此模拟海水中的温度和振荡频率, 分别培养10、20、30、40 min、1、5、9、13、16、20、24 h, 培养结束后, 将锥形瓶取出, 无菌滤纸吸钢样表面海水, 将钢样放入无菌水中, 冲洗干净吸附细菌, 菌悬液倾倒营养琼脂平板, 37℃培养2 d, 将培养好的细菌按照菌落的颜色、大小、形状进行分离纯化[11-13]。
1.3 早期污损细菌的鉴定将分离纯化的细菌进行革兰氏染色, 糖类分解实验, V-P实验, 甲基红实验, 柠檬酸盐利用实验, 硝酸盐还原实验, 淀粉水解实验, 吲哚实验, 接触酶实验, 记录结果[14]。
1.4 金属离子对早期污损细菌生长的影响采用滤纸片法实验[15], 配置不同浓度的CuSO4、CoCl2、NiCl2溶液, 确定金属离子溶液对一株早期海洋污损细菌抑菌效果[16]。含铜氧化钛基膜模拟海水中振荡10 min, 分离吸附1株革兰氏阳性杆状菌作为待测菌株。
2 结果与分析 2.1 早期污损细菌生长特征依据菌落形态, 细胞形态, 革兰氏染色, 糖类分解实验, V-P实验, 甲基红实验, 柠檬酸盐利用实验, 硝酸盐还原实验, 淀粉水解实验, 吲哚实验, 接触酶实验结果, 3种膜上分离纯化出42株细菌, 经伯杰手册查证[17], 共分为6类: G+芽孢杆菌、G+芽孢乳杆菌、G+葡萄球菌、G+诺卡氏菌、G-假单胞菌、G+无芽孢杆菌类, 分离到代表性细菌鉴定结果见表 1、图 1。
| 钢样分离到 代表性细菌 | 糖类发酵 产酸 | 糖类发酵 产气 | 淀粉水解 实验 | 柠檬酸盐 利用实验 | 硝酸盐 还原实验 | 吲哚实验 | V-P实验 | 甲基红 实验 | 接触酶 实验 |
| 1(Ni 20 min①) | + | – | – | – | + | – | – | + | + |
| 2(TiO2 10min③) | + | – | + | – | + | – | – | + | – |
| 3(Ni 40min④) | + | – | – | – | + | – | – | – | + |
| 4(TiO2 16h ③) | + | – | – | – | – | – | – | – | + |
| 5(Ni 30min④) | + | – | + | + | – | – | – | + | + |
| 6(Co 30min⑥) | + | – | – | + | + | – | – | + | + |
| 1(Ni 20 min①):杆状, 革兰氏阳性菌, 菌落较大, 呈白色不规则状、表面干燥褶皱、边缘不整齐、呈半透明状; 2(TiO2 10min③):杆菌, 革兰氏阳性菌, 菌落表面粗糙边缘不规则, 呈白色, 干燥有褶皱, 菌落较小; 3(Ni 40 min④):球状, 革兰氏阳性菌, 菌落小, 呈灰色规则状、表面光滑湿润、边缘整齐; 4(TiO2 16 h③):丝状, 革兰氏阳性菌, 菌落大, 呈白色不规则状, 表面干燥褶皱、边缘整齐; 5(Ni 30 min④):杆状, 革兰氏阴性菌, 菌落较小, 呈白色规则状、表面光滑湿润、边缘规则; 6(Co 30 min⑥):杆菌, 革兰氏阳性菌, 菌落表面光滑湿润且边缘规则, 菌落呈白色小点状; “+”.阳性, “–”.阴性 | |||||||||
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| 图 1 代表性细菌形态 Fig. 1 Representative bacterial morphology 1-1. G+芽孢杆菌; 1-2. G+芽孢乳杆菌; 1-3. G+葡萄球菌; 1-4. G+无芽孢丝状菌; 1-5. G–假单胞菌; 1-6. G+无芽孢杆菌(BM1000数码生物显微镜1 000倍) 1-1. G+ Bacillus, 1-2. G+ Sporolactobacillus, 1-3. G+ Staphylococcus, 1-4. G+ no spore filamentous bacteria, 1-5. Pseudomonas, 1-6.G+bacilli (BM1000 biomicroscopy 1000 times) |
表 2表明, 革兰氏阳性细菌最先出现在钢样上, 30 min后, 在Ni基膜发现革兰氏阴性菌。应与细菌细胞壁结构有关, 革兰氏阳性细菌的细胞壁由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸两种单糖相互间隔连成长链聚糖, 磷壁酸结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上, 一种与肽聚糖分子进行共价结合, 另一种是跨越肽聚糖层与细胞膜的脂质层共价结合, 而革兰氏阴性菌的细胞壁厚度比革兰氏阳性细菌薄, 肽聚糖层很薄, 埋藏在外膜脂多糖(LPS)内[18], 革兰氏阴性细菌不含有磷壁酸。磷壁酸的主要成分甘油磷酸和核糖醇磷酸使革兰氏阳性细菌细胞表面整体带负电, 而钢片中铁离子带正电, 利于和金属膜结合, 故革兰氏阳性细菌先附着在金属表面(图 2)。
| 镀膜钢样与时间 | G+芽孢杆菌 | G+芽孢乳杆菌 | G+葡萄球菌 | G+无芽孢丝状菌 | G–假单胞菌 | G+无芽孢杆菌类 |
| Ni 10 min | * | * | * | |||
| TiO2 10 min | * | * | * | * | ||
| Co 10 min | * | |||||
| Ni 20 min | * | |||||
| TiO2 20 min | * | |||||
| Co 20 min | * | |||||
| Ni 30 min | * | * | * | * | * | |
| TiO2 30 min | * | * | * | |||
| Co 30 min | * | * | * | |||
| Ni 40 min | * | * | * | * | ||
| TiO2 40 min | * | * | * | * | ||
| Co 40 min | * | * | * | * | ||
| Ni 1 h | * | |||||
| TiO2 1 h | * | |||||
| Ni 5 h | * | * | ||||
| TiO2 5 h | * | * | ||||
| Co 5 h | * | |||||
| Ni 9 h | * | * | ||||
| TiO2 9 h | * | * | * | |||
| Co 9 h | * | |||||
| Ni 13 h | * | * | ||||
| TiO2 13 h | * | |||||
| Co 13 h | * | * | ||||
| Ni 16 h | * | |||||
| TiO2 16 h | * | |||||
| Co 16 h | * | * | ||||
| Ni 20 h | * | * | ||||
| TiO2 20 h | * | * | ||||
| Co 20 h | * | * | ||||
| Ni 24 h | * | * | ||||
| TiO2 24 h | * | * | ||||
| Co 24 h | * | * | ||||
| 注: *代表有细菌出现 | ||||||
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| 图 2 细菌吸附机制图 Fig. 2 Diagram of bacterial adsorption mechanism |
Cu、Co、Ni 3种金属离子对海洋污损细菌生长的影响见表 3、图 3。
| 3种离子抑菌圈(cm) | ||||||||||||||||||
| 金属溶液质量浓度(g/L) | ||||||||||||||||||
| 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 70 | 80 | 90 | 100 | 110 | 120 | 130 | 140 | 150 | |
| Cu/d | 1.0 | 1.2 | 1.8 | 2 | 2.8 | 2.5 | 1.2 | 1.8 | 0.6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Co/d | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.0 | 1.9 | 0.9 | 1.3 | 1.4 | 1.5 | 1.7 | 1.6 | 1.6 |
| Ni/d | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.8 | 0.9 | 1.2 | 1.3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
 |
| 图 3 3种金属离子抑菌圈趋势图 Fig. 3 Trends in the bacteriostasis circles of three metalions |
由图 3可见: Cu2+溶液质量浓度为10 g/L~30 g/L, 抑菌圈的直径慢慢变大, 当质量浓度达到30 g/L时, 抑菌圈的直径达到最大, 此时的抑菌圈直径2.8 cm, 30 g/L之后抑菌圈的直径开始变小, 当质量浓度> 50 g/L之后无抑菌圈。当Co2+溶液浓度 < 60 g/L时, 没有抑菌圈, 当质量浓度在60 g/L~80 g/L时抑菌圈的直径逐渐变大, 在80 g/L达到最大, 抑菌圈直径为1.9 cm, 在80 g/L之后抑菌圈的直径逐渐变小, 最后趋于平稳。当Ni2+溶液质量浓度 < 70 g/L时, 抑菌圈的直径为0, 当浓度>70 g/L时, 开始出现抑菌圈, 质量浓度110 g/L时, 抑菌圈直径达到最大, 抑菌圈直径为1.3 cm, 当质量浓度>110 g/L后抑菌圈消失。
3 结论分离纯化出早期海洋污损细菌, 依据伯杰手册第八版, 10 min~20 min, 吸附细菌为G+芽孢杆菌属、G+芽孢乳杆菌属、G+无芽孢杆菌中乳杆菌、G+葡萄球菌属、G+无芽孢丝状菌。30分钟, 出现G-假单胞菌属、G+无芽孢利斯特菌属, 1 h芽孢杆菌出现荚膜, 9 h后荚膜加厚。革兰氏阳性细菌中磷壁酸携带负电荷, 与金属离子所携带的正电荷相结合, 率先附着在金属表面, G+细菌表面的磷壁酸更容易与金属离子吸附。Co基膜在10 min~9 h之间对细菌的抑制能力逐步降低, 到9 h时对细菌的抑制力最弱, 9 h之后抑制能力逐步增强。Ni基膜在10 min~5 h之间对细菌的抑制能力逐步减小, 到5 h时抑制能力最弱, 5 h~ 9 h之间细菌的抑制能力基本不变, 9 h~16 h抑制能力逐步提高, 16 h之后抑制能力变开始变强。TiO2基膜在10 min~5 h之间对细菌的抑制能力逐步减弱, 5 h~9 h细菌的抑制能力保持不变, 9 h~16 h抑制能力增加, 16 h之后对细菌的抑制能力再次减弱。24 h抑制污损细菌生长能力监测, Ni基膜>TiO2基膜>Co基膜。Cu2+溶液达到30 g/L时, Co2+溶液浓度在80 g/L, Ni2+溶液浓度110 g/L时, 抑菌圈直径分别达到最大, 相同浓度下铜离子对污损细菌影响显著。
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