2020, Vol. 44
文章信息
- 赵雨, 孙典荣, 单斌斌, 刘岩, 杨长平, 周文礼. 2020.
- ZHAO Yu, SUN Dian-rong, SHAN Bin-bin, LIU Yan, YANG Chang-ping, ZHOU Wen-li. 2020.
- 基于微卫星标记的真鲷放流群体与增殖海域群体遗传变异比较分析
- Comparison and analysis of genetic variation between the released population and the population in the breeding area of Pagrus major based on microsatellite markers
- 海洋科学, 44(10): 66-73
- Marina Sciences, 44(10): 66-73.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20191118005
-
文章历史
- 收稿日期：2019-11-18
- 修回日期：2020-03-09
2. 中国水产科学院 南海水产研究所农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东 广州 510300
2. Key Lab of South China Sea Fishery Resources Exploitation&Utilization, Ministry of Agriculture;South China Sea Fisheries Research Institute, China Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China
真鲷(Pagrusmajor)隶属于鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Percoidei)、鲷科(Sparidae), 俗称红加吉(RedSeabream), 分布于印度洋和太平洋西部近海, 在中国由北至南近岸海域均有分布, 是中国名贵经济鱼类和海水养殖的重要对象[1]。
20世纪50年代, 由于中国对真鲷资源的不合理开发与利用, 且缺乏对真鲷资源的有效保护, 导致资源严重匮乏且短时间内难以恢复[2]。为增加真鲷资源, 满足市场需求, 中国在20世纪80年代末开始进行真鲷的增殖放流活动[3]。20世纪70年代~90年代真鲷苗种人工繁育与养殖的成功也为增殖放流提供了极大的便利[4]。1990年, 中国与日本合作, 在山东省5处放流地点共放流真鲷苗种73 024尾[5]。1991年~1995年间, 在渤海放流真鲷苗种90多万尾[6]。此后放流量不断增加, 改善了真鲷资源状况[7-8]。近年来, 中国真鲷的增殖放流也在不断进行。东山县在2018年6月和2019年6月分别放流真鲷苗种25.8621万尾和23.2558万尾[9-10]。石狮市于2018年在深沪湾梅林码头附近海域放流真鲷31万尾[11]。嵊泗县也于2019年6月进行了真鲷的增殖放流[12]。
然而, 将大量人工繁育的苗种投入自然海域中, 可能会对自然群体造成一定程度的遗传学影响[13-14]。放流群体不仅会与野生群体争夺食物与生存空间[15], 还因其与野生群体存在的遗传差异, 与自然群体产生的后代发生基因交流, 进而影响其遗传多样性和遗传结构[16]。有研究表明, 增殖放流会对自然群体造成遗传学影响, Perez-Enriquez[17]等利用3个微卫星对日本四国岛周边7个地点的真鲷群体开展研究, 以探究真鲷增殖放流对自然群体造成的遗传学影响, 结果显示放流后增殖海域内的自然群体与邻近海域的自然群体存在一定程度遗传差异。Kitada[18]等通过遗传监测结合40a时间的渔获数据, 评估了长期的增殖放流对日本鹿儿岛湾的真鲷野生种群的大小和遗传多样性造成的影响, 其分析发现, 增殖放流降低了该地真鲷种群的遗传多样性, 但随着野生种群规模的增大, 遗传效应逐渐减弱, 并提出, 除非采取有效的措施控制捕捞量并恢复自然栖息地, 否则从长远来看, 为加强和保护种群而进行的增殖放流的作用十分有限。Gonzalez[19]等通过研究广岛湾5个地点的黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)发现, 最高放流强度地点的黑鲷拥有最少的等位基因且与其中3个地点的群体遗传分化显著, 表明增殖放流对广岛湾黑鲷的遗传多样性造成了重要影响。Shan[20]等基于线粒体控制区的序列对珠江口的黑鲷增殖放流进行了研究, 结果显示放流后珠江口种群的遗传多样性低于其他野生种群, 黑鲷的放流可能影响了珠江口野生种群的遗传多样性。相反, Katalinas[21]等利用微卫星对1999年~2011年间在南卡罗莱纳进行的美国红鱼(Sciaenops ocellatus)的增殖放流进行了评估, 结果显示放流并未对美国红鱼野生群体遗传多样性产生影响。Ozerov[22]等也利用微卫星和SNPs评估了16 a间因增殖放流对芬兰湾和波罗的海的大西洋鲑鱼(Salmo salar)野生种群的遗传影响, 结果表明大西洋鲑鱼的增殖放流增加了野生种群的等位基因丰富度, 但改变了其种群结构。遗传学分析可以帮助划定鱼类种群的边界、了解种群的健康和大小, 并向管理人员提供放流的参考信息[23], 因此应对野生群体进行遗传监测, 以为渔业管理和增殖放流提供科学依据。
微卫星以其广泛分布、含量丰富, 多态性高等优点, 现已发展成为一种被广泛应用的分子标记技术[24-26]。本研究利用微卫星序列作为分子标记, 对在防城港沿岸海域开展的真鲷增殖放流进行遗传监测, 以期阐明其群体遗传多样性和遗传结构现状, 为真鲷的资源保护及合理的开发提供基础资料和科学依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集真鲷亲体采自北海广西海洋研究所养殖基地;放流群体(子代群体)为真鲷亲体繁育后所得后代;2017年5月, 在防城港沿岸海域(108°05'E, 21°55'N)进行增殖放流, 共放流体长为3.7~5.8cm的真鲷苗种12.27万尾;放流后, 于2017年9月~2018年1月进行采样调查, 回捕真鲷样品(表 1)。所有样品经传统形态学测量后, 取鱼体背部肌肉组织于95%乙醇中保存, 以备后续实验。
| 时间(年.月) | 地点 | 数量(条) | 全长(mm) | 体质量(g) |
| 2017.09 | 江平近海(108°22′E, 21°58′N) | 51 | 120~156 | 37.9~72.1 |
| 2017.10 | 东兴万尾(108°17′E, 21°52′N) | 71 | 114~170 | 30.4~93.1 |
| 2017.11 | 东兴万尾(108°19′E, 21°51′N) | 70 | 122~228 | 40.8~210.7 |
| 2017.12 | 东兴万尾(108°08′E, 21°53′N) | 60 | 128~240 | 48.8~242.1 |
| 2018.01 | 东兴万尾(108°13′E, 21°52′N) | 67 | 136~261 | 55.2~285.5 |
取276尾真鲷亲体、98尾放流真鲷以及294尾回捕真鲷样品肌肉组织, 严格按照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司, 北京)中的说明书操作步骤进行DNA提取。
1.3 PCR扩增及测序分型选取多态性较高的7对微卫星引物进行扩增, 每对引物的5’端分别用TAM、FAM和HEX 3种荧光标记, 具体引物信息见表 2。PCR反应总体积为25µL, 其中包括10×PCR Buffer2.5µL, dNTPs2 µL, 双向荧光引物各1µL, Taq DNA聚合酶0.15µL, 去离子水17.5µL。PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性50s, 在引物特定的退火温度下退火50s, 72℃延伸1min, 循环35次;最后72℃延伸10min。制备1.5%琼脂糖凝胶(含DuRed染料)对PCR产物进行电泳检测, 筛选出扩增成功的产物送至生物公司进行毛细管电泳检测, GeneMarker2.2.0软件收集各位点等位基因数据, 然后进行人工校正。
| 位点 | 重复单元 | 引物序列 (5′-3′) | 产物长度范围(bp) | 退火温度(℃) | 参考文献 |
| Kpm7 | (GT) | F-TGGGACTGGAGAGAGGAAAA | 178~233 | 57 | [45] |
| R-GGTGCTGCTAGGGTCAGCTA | |||||
| Kpm11 | (GT) | F-TTCATGTGCCTGTGTGTGTG | 162~216 | 57 | |
| R-TGCACAGCATCTCTTTGACC | |||||
| Kpm23 | (GT) | F-CAGAGCTGTGTGGAGTCTGTG | 202~226 | 60 | |
| R-CCCAGTGAAACGTCCTTGAT | |||||
| Kpm25 | (CA) | F-TCTCTTGGCAATCTCGGTCT | 143~241 | 57 | |
| R-TAGACTGGTGGGGGTTTCAG | |||||
| Kpm28 | (CA) | F-GGGCAAAAACAAAAGGAACA | 189~258 | 58 | |
| R-GTGGGTGCGTGTGAAGTAAA | |||||
| Pma4 | (CA) | F: GTIGGCTCGGTCTAAAGTC | 173~230 | 60 | [46] |
| R: TCTCCACTCCGTATTGCFC | |||||
| Pma5 | (CT) | F-TCGGATTGAGTATCTGTGGG | 113~179 | 60 | |
| R-AGGTTCTCCGTCACTGTCC |
使用PopGene[27]软件统计每个微卫星位点的等位基因数(Na)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、有效等位基因(Ne)。使用FSTAT 2.9.3[28]软件获得其等位基因丰富度(RS), 计算两两群体间遗传分化指数FST并通过1000次随机抽样检验显著性。通过GENEPOP4.0[29]检验各位点是否符合Hardy-Weinberg平衡检验。使用Micro-Checker[30]软件检测各位点是否存在无效等位基因。此外, 使用Population1.2计算3个真鲷群体之间的遗传距离[31]。
2 实验结果 2.1 群体遗传多样性本研究的3个真鲷群体在7个微卫星位点上总等位基因数分别为115、115和151个等位基因(表 3), 平均等位基因数为(16.429~21.571)。3个群体的有效等位基因数为(1.952~17.970), 均不同程度地低于其对应的等位基因数。3个群体在7个位点的平均观测杂合度为(0.778 4~0.793 0), 除真鲷亲体群体外, 均低于其平均期望杂合度, 说明群体中发生了杂合子缺失。真鲷亲本群体与真鲷放流群体的等位基因丰度(13.525 3, 16.428 6)和期望杂合度(0.792 7, 0.814 5)没有明显的差异, 表明在苗种繁育过程中, 没有出现遗传多样性丢失的现象。真鲷放流群体和放流后混合群体的期望杂合度(0.814 5, 0.822 8)、等位基因丰度(16.428 6, 16.755 5)相似, 表明真鲷放流群体和放流后混合群体处于相同的遗传多样性水平。真鲷放流群体和真鲷亲本群体分别在Pma4位点和Kpm7位点存在无效等位基因, 同时放流后混合群体在这两个位点均存在无效等位基因。3个群体的多态信息含量为0.768 8~0.805 5, 表明3个群体均具有较高的遗传多样性。使用GENEPOP4.0对3个群体的7个位点逐个进行Hardy-Weinberg平衡检验的结果显示, 真鲷亲本群体与真鲷放流群体在7个微卫星位点均符合Hardy-Weinberg平衡, 而放流后混合群体中有4个位点显著偏离平衡。
| 数量(条) | 参数 | 位点 | 平均值 | |||||||
| Kpm25 | Pma5 | Pma4 | Kpm28 | Kpm11 | Kpm23 | Kpm7 | ||||
| 亲体 | 276 | Na | 12 | 20 | 28 | 24 | 7 | 12 | 12 | 16.429 |
| Ho | 0.761 | 0.877 | 0.942 | 2.971 | 0.616 | 0.819 | 0.565 | 0.793 | ||
| He | 0.790 | 0.880 | 0.937 | 0.935 | 0.575 | 0.782 | 0.651 | 0.793 | ||
| PIC | 0.756 | 0.865 | 0.930 | 0.927 | 0.533 | 0.747 | 0.625 | 0.769 | ||
| RS | 10.071 | 16.309 | 22.931 | 20.592 | 6.099 | 9.286 | 9.289 | 13.525 | ||
| Ne | 4.688 | 8.128 | 15.013 | 14.510 | 2.342 | 4.532 | 0.844 | 7.437 | ||
| 放流子代 | 98 | Na | 12 | 18 | 23 | 26 | 7 | 12 | 17 | 16.429 |
| Ho | 0.755 | 0.857 | 0.837 | 0.980 | 0.612 | 0.714 | 0.694 | 0.778 | ||
| He | 0.765 | 0.866 | 0.936 | 0.948 | 0.570 | 0.812 | 0.804 | 0.815 | ||
| PIC | 0.724 | 0.844 | 0.922 | 0.935 | 0.525 | 0.786 | 0.774 | 0.787 | ||
| RS | 12.000 | 18.000 | 23.000 | 26.000 | 7.000 | 12.000 | 17.000 | 16.429 | ||
| Ne | 4.115 | 7.010 | 13.642 | 16.278 | 2.293 | 5.029 | 4.900 | 7.619 | ||
| 混合群体 | 294 | Na | 21 | 20 | 31 | 33 | 11 | 15 | 20 | 21.571 |
| Ho | 0.844 | 0.871 | 0.871 | 0.946 | 0.476 | 0.796 | 0.721 | 0.789 | ||
| He | 0.866 | 0.861 | 0.948 | 0.947 | 0.489 | 0.829 | 0.820 | 0.823 | ||
| PIC | 0.848 | 0.845 | 0.942 | 0.941 | 0.458 | 0.807 | 0.798 | 0.806 | ||
| RS | 14.757 | 15.540 | 26.617 | 27.178 | 7.095 | 12.001 | 14.101 | 16.756 | ||
| Ne | 7.273 | 7.041 | 17.970 | 17.778 | 1.952 | 5.767 | 5.461 | 9.035 | ||
使用FSTAT2.9.3计算的结果显示, 真鲷亲本群体、放流后混合群体与真鲷放流群体、真鲷亲本群体与真鲷放流群体的遗传分化指数FST为0.016 667, 表明两两群体间存在显著地微弱的遗传分化。计算真鲷群体间的遗传距离, 结果显示3个真鲷群体间遗传距离较小(0.265 375~0.301 915)(表 4)。
| 亲体 | 放流子代 | 混合群体 | |
| 亲体 | 0.270 | 0.302 | |
| 放流子代 | 0.017* | 0.265 | |
| 混合群体 | 0.017* | 0.017* | |
| *.P<0.05 | |||
遗传多样性关系到种群的进化与适应, 物种对环境变化的适应能力和进化的潜力与种内遗传多样性或变异性成正比, 并以此保持物种和整个生态系统的多样性[32-33]。物种遗传多样性丧失的问题不仅在增殖放流活动中至关重要, 更因其涉及生物体对环境变化的适应性和进化反应, 在保护遗传学中受到高度重视[34]。Romo[35]等利用微卫星标记对条斑星鲽(Verasper moseri)在日本增殖放流的效果进行了评估, 结果显示放流群体与自然群体并无明显遗传差异, 该项目中增殖放流未产生消极影响。Kitada[36]分析鹿儿岛真鲷的放流和日本北部的太平洋鲱(Clupea pallasi)的放流发现, 鲱群体中均出现稀有等位基因的丢失, 但放流群体对其产生的遗传影响远远小于由其生活史、环境和渔业选择压力造成的影响, 并提出增殖放流的遗传影响的大小应取决于种群的大小、放养强度、种群和放流后代的遗传多样性以及种群间的基因流动, 因此在增殖放流项目中保持种群的遗传多样性是非常重要的。Katalinas[21]等曾用微卫星研究增殖放流对南卡罗来纳河口美国红鱼(Sciaenops ocellatus)的遗传影响, 其结果并未出现遗传多样性的显著变化, 并推测可能是由于世代交叠、野生鱼类种群规模大、美国红鱼表现出相对较长的寿命等对放流产生的遗传影响起到一定的缓释作用。本文中, 有52个亲本个体在7个位点上共17个等位基因(Kpm25位点1个、Pma5点2个、Pma4位点8个、Kpm28位点2个、Kpm11位点1个、Kpm23位点2个, Kpm7位点1个)未在子代中出现, 因此这些亲本个体并未实际参与繁殖。在子代中有24个个体在7个位点上共21个等位基因(Kpm25位点2个、Pma4位点4个、Kpm28位点4个、Kpm11位点1个、Kpm23位点2个, Kpm7位点6个)未在亲本中出现, 推测是由于亲本未采集完全。虽然本研究的亲体样品并未包含全部亲体, 但由于样品数量充足, 可以代表亲体群体的遗传多样性与遗传结构。
等位基因丰富度、位点杂合度以及多态信息含量是反映群体遗传多样性的重要参数[37]。本研究与Gonzalez[34]等对相模湾和东京湾的真鲷群体进行的研究采用了6对相同的微卫星引物。在Kpm7(0.710~0.892, 0.565~0.721), Kpm23(0.822~0.845, 0.714~0.819), Kpm25(0.787~0.870, 0.755~0.844), Pma5(0.891~0.92, 0.857~0.877), Kpm11(0.469~0.712, 0.476~0.616)这5个位点上, 本研究中真鲷群体的观测杂合度略低于日本学者的研究群体, 仅在Kpm28位点上略高于日本群体(0.87~0.947, 0.946~0.980)。本研究中的3个群体在各个位点上的平均观测杂合度(0.778~0.793)、平均期望杂合度(0.793~0.823)和平均等位基因丰富度(13.525~16.756)略低于Sawayama[38]等在日本濑户内海采集的野生群体(0.952, 0.939, 17.4)和Sawayama[39]等在日本爱媛县附近采集的研究群体(0.719~0.906, 0.714~0.938, 7.0~25.3), 但总体上无明显差异, 证明本研究中的真鲷群体与日本群体处于相同的遗传多样性水平。通常, 用于繁育增殖放流苗种的亲体数量有限, 人工繁育苗种的遗传多样性较野生群体低, 被投入自然海域的放流苗种通过与野生群体之间的基因交流从而降低野生群体的遗传多样性, 因此放流苗种应尽可能减小与野生群体之间的差异[34]。Gonzalez[40]等曾用6个微卫星标记比较了广岛湾放流黑鲷与野生黑鲷的遗传多样性, 结果表明虽然群体间观察到较微弱的遗传多样性差异, 但这种对广岛湾野生种群遗传组成潜在的有害影响, 使得有必要对增殖放流的遗传效应进行定期监测。在季晓芬[41]利用13对微卫星评估草鱼增殖放流对野生群体遗传多样性影响的研究中, 虽然在石首、监利两地的放流群体为人工养殖群体, 但草鱼放流群体仍保持较高的遗传多样性, 推测是由于其苗种来源于长江。胡新艳[42]等也利用微卫星对用于放流的养殖群体遗传多样性进行了分析, 结果显示可能是由于亲代的人工选择的干扰, 导致了杂合子的缺失和过剩。在本研究中, 真鲷亲本群体与真鲷放流群体的等位基因丰度(13.5253, 16.4286)和期望杂合度(0.7927, 0.8145)没有明显的差异, 推测可能本实验在苗种繁育过程中使用了足够数量的亲本, 使得放流苗种中未发生明显的遗传多样性丢失。
群体遗传分化指数FST是利用遗传信息反映群体之间遗传分化的指标, 数值越大表明两群体间的遗传分化水平越高[40]。Wright[43]提出遗传分化指数度量标准:0<FST<0.05表明种群遗传分化微弱, 0.05<FST<0.15表明种群遗传分化中等, 0.15<FST< 0.25表明种群遗传分化很大, FST﹥0.25表明种群遗传分化极大。在本研究中两两群体的遗传分化指数FST值显示:放流后混合群体与真鲷亲本群体、放流后混合群体与真鲷放流群体、真鲷亲本群体与真鲷放流群体之间均存在显著地微弱的遗传分化, 并未形成明显的遗传分化。这表明真鲷增殖放流活动并未造成明显的遗传影响, 保持了其遗传结构。2015年, Gonzalez[44]等为了研究密集的增殖放流活动对日本列岛沿岸真鲷种群遗传结构的影响, 曾利用15个微卫星位点对848个样本进行基因分型。其结果显示在不同地理位置同时对一个物种进行的大规模增殖放流可能会破坏其固有的遗传结构。结合前文和对真鲷群体间遗传距离的分析可推测, 本研究中放流群体并未对放流后混合群体产生明显遗传学影响。为保护自然群体的遗传多样性, 对自然群体的遗传监测应长期持续进行, 本研究为今后的增殖放流遗传监测提供了理论参考依据。
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