2020, Vol. 44
文章信息
- 张小华, 刘东艳. 2020.
- ZHANG Xiao-hua, LIU Dong-yan. 2020.
- 温度与溶解态有机磷源对中肋骨条藻生长的影响
- Effects of temperature and dissolved organic phosphorus on the growth characteristics of Skeletonema costatum
- 海洋科学, 44(11): 36-44
- Marina Sciences, 44(11): 36-44.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20200225001
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文章历史
- 收稿日期：2020-02-25
- 修回日期：2020-07-20
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 滨州医学院 药学院, 山东 烟台 264003;
4. 华东师范大学 河口与海岸学国家重点实验室, 上海 200241
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Department of pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China;
4. State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, East China Normal University, Shanghai 200241, China
溶解态无机磷(Dissolved inorganic phosphorus, DIP)是海洋浮游植物生长的必需营养元素, 然而, 很多海域存在季节性磷限制的现象[1-2]。已有研究表明, 在DIP限制的条件下, 部分浮游植物可以利用溶解态有机磷(Dissolved organic phosphorus, DOP), 大量繁殖生长, 甚至形成赤潮[3]。DOP是近岸海域中广泛存在的一种重要磷源, 在海洋总溶解态磷(Total dissolved phosphorus, TDP)中占有很大比例[4-6]。例如, 有调查表明, 黄河口及邻近海域DOP的含量大约贡献了TDP的85%左右[7], 是导致水体富营养化的重要因素之一[8]。DOP结构复杂, 由众多复杂混合物组成。根据其所含C、P键型不同, 基本可分为两大类有机化合物:含有C-O-P键的磷酸酯和含有C-P键的膦酸酯[9]。大量研究表明DOP需要先被转化为DIP才能被浮游植物吸收利用[10-11], 其转换利用能力一方面受到DOP的结构影响, 另一方面受到海洋环境因子的影响。例如, 海洋中痕量金属元素(铝、锌等)的存在可以促进浮游植物对DOP的利用[12-13]; 较高的海水温度也会促进浮游植物对DOP的转化吸收速率[14]。
有研究表明, 海洋变暖会加剧海水的富营养化效应, 促进浮游植物对营养物质的吸收利用, 加剧赤潮的爆发频率和规模[15-16]。DOP是富营养化海域的重要磷源, 浮游植物在海水暖化条件下, 对不同结构DOP的吸收利用能力可显著影响到生物生产量, 乃至赤潮的发生, 因此, 有必要深入探讨温度与DOP对浮游植物生长的影响效应。本研究选取我国东部沿海的一种常见赤潮藻-中肋骨条藻(Skeletonema costatum)[17-18]为研究对象, 在四个不同的温度条件下(20、23、26、29℃), 分别添加三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)、6-磷酸葡萄糖(Glucose 6-phosphate, G-6-P)、甘油磷酸钠(Sodium glycerophosphate, SG-P)和草甘膦(Glyphosate, G-P)四种不同形态的DOP, 通过分析藻细胞生长特征, 以及培养液中TDP、DIP浓度和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)活性变化, 探讨了升温与不同DOP对中肋骨条藻生长的影响特征, 研究结果将为揭示海水暖化条件下DOP丰富海区浮游植物的生长状态提供一定的科学依据。
1 材料与方法 1.1 藻种培养及实验设计中肋骨条藻(S. costatum)分离自我国黄海海域。实验所用玻璃器皿均使用10% HCl浸泡24 h, 纯净水冲洗干净后, 放于烘箱烘干备用。培养所用海水为人工海水, 参照Harrison等[19]的方法配制, pH值为8.0±0.1, 盐度为30±1, 经121℃高压湿热灭菌30 min, 室温冷却后备用。实验室中肋骨条藻的培养条件光照为55 μmol/(m2· s), 光暗周期为12 h/12 h, 温度为20℃, 培养液为f/2营养盐配方[20]。
实验选择4种不同类型的DOP, 分别代表海洋中存在的两种P键类别: G-6-P、ATP和SG-P代表含有C-O-P键的磷酸酯, G-P代表含有C-P键的膦酸酯。参照f/2培养基中NaH2PO4的浓度(36 μmol/L), 分别添加36 μmol/L G-6-P、12 μmol/L ATP(约为36 μmol/L P)、36 μmol/L SG-P和36 μmol/L G-P配制不同类别磷源的培养液, 其他各种元素依旧按f/2配方添加; 对照组使用f/2培养基。中肋骨条藻生长最适温度在20~30℃之间[21-22], 因此本次实验在此区间设定4个温度条件, 分别为20、23、26、29℃。接种指数生长期的中肋骨条藻到各含有600 mL不同磷源培养液的1 L锥形瓶中(表 1), 起始藻细胞密度为5×104 cell/mL, 然后分别置于预设4个温度条件的恒温光照培养箱中, 连续培养7 d, 每个处理组合均设3个重复。每天固定时间从各组中取50 mL样品, 用于藻细胞计数、培养液中TDP、DIP浓度以及细胞AP活性的测定。
| DOP实验分组 | 添加浓度/(μmol/L) | 培养温度/℃ |
| ATP | 12 | 20、23、26、29 |
| SG-P | 36 | 20、23、26、29 |
| G-6-P | 36 | 20、23、26、29 |
| G-P | 36 | 20、23、26、29 |
取100 μL样品用于藻细胞计数, 取样前混匀藻液, 将卢戈氏液加入取样样品中固定藻细胞, 使用0.1 mL浮游植物计数框(20 mm×20 mm)于显微镜下对每个样品进行计数, 计算每mL样品中含有的藻细胞个数。
1.3 生长速率计算根据每天获得的藻细胞密度, 采用下列公式[23]计算本实验中肋骨条藻的生长速率:
式中, N2和N1分别代表时间T2和T1的细胞密度。
1.4 培养液中DIP与TDP浓度的测定50 mL的培养液离心后, 上清经醋酸纤维膜过滤, 用于测定培养液中DIP和TDP的浓度。DIP采用以抗坏血酸为还原剂的磷钼蓝比色法测定(海洋调查规范第4部分:海水化学要素调查GB17378.4- 2007)。TDP根据Jeffries等[24]的方法进行测定, 过滤培养液加入50 g/L的过硫酸钾, 121℃消解30 min, 冷却至室温, 再采用以抗坏血酸为还原剂的磷钼蓝比色法进行测定。
1.5 胞内AP活性的测定离心收集的藻细胞用于胞内AP活性的测定。参照Lin等[25]的方法, 以对硝基苯磷酸二钠(4-Nitrophenyl phosphate, pNPP)为底物测定AP活性变化。收集到的藻细胞加入1 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl (pH=9)的缓冲液, 在冰浴条件下匀浆1~2 min, 匀浆后离心取上清, 与50 μL 20 mmol/L的pNPP混匀, 对应培养温度条件下黑暗中放置2 h, 随后将样品放置冰上终止酶反应, 10 000 g离心2 min, 取上清于405 nm处测定胞内AP活性。酶活计算单位为单个藻细胞含有的AP 1 h降解pNPP所产生对硝基苯酚(p-nitrophenol, pNP)的fmol数。
1.6 数据处理与分析所有实验测定结果均表示为平均值±标准方差(n=3)。采用三因子方差分析DOP(ATP、G-6-P、SG-P和G-P)、温度(20、23、26、29℃)和取样时间对藻细胞密度、TDP、DIP浓度和AP活性的影响, 如果交互作用因子P < 0.05, 则使用单因素重复方差分析来确定差异性。重复测量方差分析时, 如果重复性方差分析的方差-协方差矩阵的球形假设被违反, 则对自由度(df)进行Greenhouse-Geisser校正。所有统计分析均采用SPSS 17.0软件进行。
2 结果与分析 2.1 中肋骨条藻生长特征比较中肋骨条藻在不同温度与DOP组中表现出不同的生长特征(图 1;表 2)。在ATP组中, 藻细胞在4 d后快速生长, 最大藻细胞密度与平均生长率出现在29℃条件下(图 1a;表 2); SG-P和G-6-P组的藻细胞生长变化趋势相似, 5 d后快速生长, 最高藻细胞密度与平均生长率均出现在26℃条件下(图 1b, c; 表 2)。相比之下, G-P组的藻细胞密度维持在较低水平, 没有出现显著生长, 生长速率明显低于其它组, 29℃条件下的生长略高于其他温度条件(图 1d;表 2)。NaH2PO4组随着温度的升高细胞密度显著上升, 29℃生长最好(图 1e)。以上结果可以看出, 含有C-O-P键的磷酸酯(ATP, SG-P和G-6-P)表现出与NaH2PO4组相似的生长趋势, 较高的温度条件可以显著促进中肋骨条藻的生长; 而含有C-P键的膦酸酯(G-P)对中肋骨条藻生长的影响不显著。
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| 图 1 不同温度和DOP条件下中肋骨条藻的生长特征 Fig. 1 Growth characteristics of Skeletonema costatum under different temperature and dissolved organic phosphorus (DOP) conditions |
| DOP组别 | 生物量/生长速率 | 20℃ | 23℃ | 26℃ | 29℃ |
| ATP | 最高生物量 | 75.5±5.47d | 134.2±6.41c | 153.9±10.74b | 176.7±6.93a |
| 平均生长速率 | 0.45±0.009d | 0.55±0.008c | 0.57±0.011b | 0.59±0.006a | |
| SG-P | 最高生物量 | 73.2±5.15d | 136.9±8.51c | 218.8±7.25a | 151.5±1.89b |
| 平均生长速率 | 0.44±0.013c | 0.54±0.010ab | 0.6±0.010a | 0.57±0.002b | |
| G-6-P | 最高生物量 | 79.0±0.86d | 127.6±7.54c | 178.0±17.43 a | 153.7±2.51b |
| 平均生长速率 | 0.44±0.012d | 0.54±0.010c | 0.6±0.016a | 0.57±0.003b | |
| G-P | 最高生物量 | 30.6±1.83b | 13.9±0.93c | 33.6±1.96b | 40.7±6.41a |
| 平均生长速率 | 0.25±0.007c | 0.11±0.014d | 0.27±0.011b | 0.32±0.001a |
三因子方差分析表明, 温度与DOP类型均对中肋骨条藻生长有显著影响, 并且两者之间存在显著的交互效应(表 3)。单因素重复性方差分析发现, 在相同的DOP类型下, 温度对藻细胞生长均有显著影响(P < 0.01);在相同的温度下, SG-P和G-6-P组之间的生长差异不显著外(P > 0.05), 其余各DOP组之间均具有显著差异(P < 0.01)。
| 参数 | 细胞密度 | TDP浓度 | DIP浓度 | AP活性 | |||||||
| F | P | F | P | F | P | F | P | ||||
| DOP | 1 415.71 | 0.000 | 288.20 | 0.001 | 1 538.11 | 0.000 | 29 647.31 | 0.000 | |||
| 温度 | 524.83 | 0.000 | 32.73 | 0.021 | 39.62 | 0.023 | 117.73 | 0.001 | |||
| DOP×温度 | 142.99 | 0.003 | 33.49 | 0.000 | 34.47 | 0.005 | 123.03 | 0.003 | |||
| 时间 | 4 927.31 | 0.000 | 404.58 | 0.000 | 1 203.36 | 0.000 | 73.48 | 0.001 | |||
| DOP×时间 | 290.00 | 0.000 | 148.76 | 0.000 | 272.03 | 0.000 | 92.34 | 0.002 | |||
| 温度×时间 | 204.15 | 0.000 | 6.88 | 0.000 | 10.08 | 0.030 | 26.81 | 0.006 | |||
| DOP×温度×时间 | 54.66 | 0.002 | 4.29 | 0.000 | 13.78 | 0.019 | 19.73 | 0.009 | |||
| 注: P表示这些因素或其相互作用的显著性, P < 0.05时表示差异显著. | |||||||||||
培养液中TDP与DIP的浓度变化在不同DOP组中显著不同(图 2)。ATP组的培养液中, TDP在实验过程中迅速下降, 29℃下降最为显著(图 2a); 培养液中DIP浓度在实验前5 d显著上升, 随后下降至实验结束(图 2b)。SG-P和G-6-P组培养液中的TDP均在29℃条件下下降最为显著(图 2c, e); 两组培养液中DIP浓度变化相似, 均在实验后期有少量DIP产生(< 10 μmol/mL)(图 2d, f)。相比之下, G-P组培养液中TDP浓度到实验结束时均呈现上升趋势(图 2g); 整个实验过程均难以检测到DIP(图 2h)。三因子方差分析发现, 温度和DOP类型对TDP与DIP浓度均有显著影响(表 3), 且DOP类型对TDP和DIP浓度的影响较温度更为显著。在相同温度条件下, G-P组的TDP浓度与其他各DOP组之间差异显著(P < 0.01); ATP组的DIP浓度与其他各DOP组之间差异显著(P < 0.01)。
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| 图 2 不同温度和DOP条件下培养液中TDP和DIP浓度变化特征 Fig. 2 Dynamic characteristics of total dissolved phosphorus and dissolved inorganic phosphorus concentrations under different temperature and DOP conditions |
不同温度条件与DOP组中, 中肋骨条藻胞内AP活性表现出显著不同的变化特征(图 3)。AP活性在ATP组中不活跃(< 10 fmol pNP/(cell·h)), 仅在26℃条件下培养的第6, 7 d出现峰值(图 3a); SG-P和G-6-P组中, AP活性的变化特征相似(图 3b, c), 培养期间变化不显著。各温度条件下G-P组的AP活性均显著升高, 其中酶活最高值出现在20℃第5 d(83 fmol pNP/ (cell·h))(图 3d)。三因子方差分析结果表明, 温度和DOP类型均对AP活性有显著影响(表 3)。相同温度条件下, G-P组AP活性与其他各DOP组之间均存在显著差异(P < 0.01);此外G-P组AP活性在26℃与29℃条件下差异不显著(P > 0.05), 其余各温度条件下的AP活性均有显著差异(P < 0.01)。
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| 图 3 不同温度和DOP条件下中肋骨条藻AP酶活性变化特征 Fig. 3 Dynamic characteristics of alkaline phosphatase activity in Skeletonema costatum under different temperature and DOP conditions |
DOP是富营养海岸水域存在的重要磷源之一, 其中, 磷酸酯类DOP可以占到总DOP类型的75%左右[26-28]。目前已有多种磷酯化合物被鉴定出来, 其中, 核酸、游离核苷酸(如ATP)、甘油磷酸脂(如SG-P)、糖类衍生物(如SG-P)等是其主要组成成分[29-30]。ATP、G-6-P、SG-P都属于小分子磷酸酯, 含有C-O-P键, 易于被降解, 因此常被用来作为研究浮游植物对海水DOP利用的代表性对象。已有研究表明东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)[31-32]、球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)[33]、具槽帕拉藻(Paralia sulcata)[34]、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)[35]等可利用ATP、G-6-P、SG-P等DOP化合物维持生长。膦酸酯约占海洋中DOP的25%[30], 广泛分布于许多海洋生命形式中。近年来由于G-P的广泛应用导致其在沿海海域中积累, 成为水体膦酸盐的重要组成部分[36]。G-P属于小分子膦酸盐, 含有化学稳定的C-P键, 从能量上讲, 它比水解C-O-P键更困难, 因此, 只有少数细菌和海洋浮游植物被报道可以利用G-P作为磷营养源, 例如小定鞭藻(Prymnesium parvum)[37]、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)[38]以及丝状蓝细菌鱼腥藻(Anabaena sp.)[39]等。不同浮游植物对不同DOP的利用能力不同[35], 且易受环境因子影响。
本研究发现中肋骨条藻可以在ATP、G-6-P和SG-P条件下快速生长, 而在G-P条件下, 中肋骨条藻的生长显著低于其他DOP组。这表明中肋骨条藻对不同结构类型DOP的利用能力不同, 更易利用磷酸酯。在相同DOP处理条件下, 中肋骨条藻的生长响应了较高的温度条件, 这与Tian等[40]报道中肋骨条藻在较高温度下分裂更快, 更易引起赤潮的结果一致。通过监测藻细胞生长过程中培养液里TDP、DIP的变化, 进一步了解中肋骨条藻对不同DOP的利用过程。实验发现, 在ATP、G-6-P和SG-P培养液中TDP浓度迅速下降, 表明中肋骨条藻可以有效利用磷酸酯ATP、G-6-P和SG-P维持自身生长, 在较高温度培养液中的TDP消耗更为显著。G-P组培养液中TDP浓度没有下降反而略有升高, 表明中肋骨条藻不能直接利用G-P, 培养液中TDP浓度升高可能是由于部分细胞死亡后, 细胞破裂导致含磷内容物释放到培养液中。有研究报道表明, DOP的吸收利用是通过被酶水解成DIP的途径来进行的[11, 41], 但也有研究发现一些小分子DOP可以被藻类直接吸收利用, 例如, 米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)可以直接吸收利用G-6-P[42]。本研究发现ATP组培养液中有大量DIP, 而SG-P和G-6-P组中仅有少量DIP, 表明中肋骨条藻对ATP与SG-P和G-6-P的利用途径可能不同。温度对ATP组DIP浓度变化有显著影响(P < 0.01), 培养液中DIP浓度随温度的升高显著增多, 表明温度升高可能加速ATP水解产生更多的DIP, 从而促进了中肋骨条藻的生长。
AP被认为是最重要的DOP利用酶, 在DIP缺失的环境被诱导合成, 通过分解水体中的DOP为浮游植物提供磷源[10, 25]。本研究发现, 不同类型DOP条件下的藻细胞内AP活性存在较大差异, 其中ATP、SG-P和G-6-P组的AP活性均较低且各组间无显著差异(P > 0.05), 而G-P组的AP活性显著高于ATP、SG-P和G-6-P组的AP活性(P < 0.01), 表明在含有C-P键的DOP条件下中肋骨条藻的AP活性较高。有研究报道, 当环境中可利用磷匮乏时, 浮游植物会通过合成AP利用细胞内储存的多聚磷酸盐维持细胞较低水平的生长[31]。因为G-P较难被水解, 中肋骨条藻可能会通过合成较高AP利用胞内多聚磷酸盐, 这可能是本实验在G-P营养条件下, 中肋骨条藻细胞生长率较低及培养液中TDP没有降低现象的一种解释。ATP、SG-P和G-6-P组的AP活性均较低, 可能是小分子磷酸酯较易被水解, 藻细胞保持较低的AP水平就能维持较好生长, 也可能是藻细胞存在其他酶利用DOP维持生长[41, 43]。Healey等[44]研究表明温度会不同程度上影响浮游植物AP活性。本研究中, 温度变化对G-P条件下的细胞AP活性有显著影响, AP活性在20℃和23℃下活性更高。
4 结论1) 不同类型DOP会显著影响中肋骨条藻的生长。与G-P相比, ATP、SG-P和G-6-P能更为有效地被中肋骨条藻生长所利用。
2) 本实验温度范围内(20~29℃), 温度升高能显著促进中肋骨条藻在ATP、SG-P和G-6-P三种DOP条件下的生长, 但该效应可能并不依赖于AP活性。
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