2020, Vol. 44
文章信息
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- DUAN Hai-bao, MAO Shuang, DU Nan, ZHANG Min, GE Hong-xing, WEI Min, MENG Xue-ping, DONG Zhi-guo. 2020.
- 干露胁迫对青蛤呼吸代谢及抗氧化相关酶活力的影响
- Effects desiccation on respiratory metabolism and antioxidant enzyme activities of clam Cyclina sinensis
- 海洋科学, 44(3): 42-49
- Marine Sciences, 44(3): 42-49.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190730001
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文章历史
- 收稿日期：2019-07-30
- 修回日期：2019-08-27
青蛤(Cyclina sinensis)隶属软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、帘蛤目(Venerida)、帘蛤科(Veneridae), 俗称黑蛤, 铁蛤, 牛眼蛤等。青蛤属于广温广盐性双壳贝类, 广泛分布在中国、日本、韩国及东南亚各国的沿海滩涂地区及河口地区[1]。青蛤作为海产经济高蛋白贝类, 具有肉质鲜美、营养丰富、药用价值高等特点[2-3], 为人们所喜食。目前随着青蛤人工育苗技术的不断成熟, 加之消费者对高质量蛋白需求的日益增加, 青蛤等海产贝类市场潜力巨大。
贝类的养殖及运输过程中会时常经历离水干露的过程。干露会造成水产动物机体水失衡, 进而抑制其呼吸功能, 最终造成血液pH失调而窒息死亡[4-6]。近年来, 有关干露对贝类生长及活力影响的研究报道较多, 主要有干露胁迫对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)[7]、海湾扇贝(Argopecten irradias)[8]、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)[9-10]、魁蚶(Anadara broughtonii)[11-12]、文蛤(Meretrix meretrix)[13]、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)[14-15]、施氏獭蛤(Lutraria sieboldii)[16]、硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)[17]和毛蚶(Scapharca subcrenata)[18]等生理状态和生命活动的影响研究, 均表明双壳类的海洋经济贝类具有较强的耐干露能力。双壳贝类的耐干露能力受到诸多因素的影响, 除了个体差异、种类差异等之外, 也受到外界的温度、湿度以及干露时间的影响[7, 14, 19]。而关于干露胁迫下贝类呼吸代谢和抗氧化生理研究较少。本研究探索不同干露时间及干露温度对青蛤呼吸代谢和抗氧化能力的影响, 初步探索青蛤耐干露能力, 旨在为青蛤活体运输提供科学依据, 并进一步为贝类耐干露新品种的选育提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料本实验所用青蛤由国家贝类产业技术体系连云港综合试验站提供, 规格为:平均壳长(2.76±0.12) cm, 平均壳高(2.70±0.14) cm, 平均壳宽(1.65±0.10) cm, 平均湿质量(6.95±0.95) g。实验开始前2 d停止投饵, 养殖水温为(19±1)℃。
1.2 实验设计与方法 1.2.1 实验设计实验组通过恒温箱设置三个温度分别为3、10和20℃(记为T3、T10、T20), 对青蛤进行干露胁迫, 对照组为实验站正常养殖条件下的青蛤。每个温度实验组设置三个平行组, 每组均放置50粒青蛤。实验组分别于干露时间2、6、12、24、48 h取样, 每个青蛤取消化腺0.1 g左右, 浸润PBS洗去样本表面的体液及杂质, 然后放入1.5 mL离心管中于超低温冰箱中保存。在上述时间点分别记录各组青蛤死亡粒数。
1.2.2 样品处理冷冻保存的样品在高温灭菌过的研钵中, 用液氮研磨法进行研磨, 并根据实际的取样重量, 按质量(g)︰体积(mL)=1︰9的比例加入预冷PBS缓冲液, 4℃下10 000 r/min离心10 min, 取上清液即10%的匀浆上清液, 备用。
1.2.3 测定指标及方法超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)测定方法参考南京建成科技有限公司试剂盒说明书; 参照Bradford的方法用考马斯亮蓝检测待测样本蛋白浓度[20]。
死亡率计算公式如下:
死亡率=(死亡个体数/总个体数)×100%
干露过程中, 青蛤机体水分及体腔液会有一定损耗, 失水量占初始重量的比值为失水率。失水率计算公式如下:
式中: R为干露时青蛤的失水量占青蛤初始重量的比; W1为干露前青蛤的质量; Wn为每个时间点测量青蛤的质量。
1.3 数据处理与分析实验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示, 采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理和分析。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)结合Duncan多重比较, 以P < 0.05时为差异显著; 利用Excel 2010进行数据处理和作图。
2 结果 2.1 不同温度条件下干露胁迫对青蛤死亡率的影响在不同温度条件下, 干露胁迫对青蛤的死亡率影响如表 1所示。T3和T10组在干露48 h内未出现死亡青蛤。T20组干露24 h出现死亡个体, 死亡率为3.33%, 且死亡率有升高趋势, 干露48 h死亡率达到5.33%。对照组未出现死亡情况。
| 温度/℃ | 干露时间/h | ||||
| 2 | 6 | 12 | 24 | 48 | |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 20 | 0 | 0 | 0 | 3.33% | 5.33% |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
不同温度条件下, 干露胁迫对青蛤失水率影响如图 1, 各温度组均随着干露时间的增加失水加剧。T20组失水最为严重, T3组的失水率最低。干露2 h时, T10组和T20组的失水率均显著大于T3组(P < 0.05)。干露6、12、24和48 h时, 失水率结果均为T20组 > T10组 > T3组(P < 0.05)。
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| 图 1 不同温度和不同干露时间下青蛤的失水率 Fig. 1 Water loss under different desiccation times and temperatures 注:图中同一干露时间下不同字母表示数据间有显著性差异(P < 0.05), 下同 |
不同温度条件下干露胁迫对青蛤LDH活力的影响如图 2所示。随着干露时间的增加, T3组、T10组和T20组青蛤LDH活力在总体上呈下降趋势, T10组LDH活力大于T3组和T20组。对照组LDH活力变化不明显。T3和T10组随着干露时间的增加, 青蛤LDH活力呈现先下降后短暂上升再下降的趋势, 且均在干露12 h至24 h出现上升的趋势。
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| 图 2 不同温度和不同干露时间下青蛤的乳酸脱氢酶(LDH)活力变化 Fig. 2 LDH activities under different desiccation times and temperatures |
干露2 h时, T3组、T10组和T20组LDH活力均低于对照组(P > 0.05)。干露2 h至6 h时, T20组青蛤LDH活力下降幅度最大, 且干露6 h LDH活力显著低于T3组、T10组和对照组(P < 0.05)。干露12 h和24 h时, T3组和T20组的LDH活力显著低于对照组(P < 0.05), T10组LDH活力与对照组无明显差异(P > 0.05)。干露48 h时, 实验组青蛤LDH活力均显著低于对照组(P < 0.05), 且T3组LDH活力大于T10组和T20组(P > 0.05)。
2.3.2 不同温度条件下干露胁迫对青蛤SDH活力的影响不同温度条件下干露胁迫对青蛤SDH活力的影响如图 3所示。随着干露时间的增加, 各温度组的青蛤SDH活力在整体上呈下降趋势, 其中T3组和T10组青蛤SDH活力呈现先下降后上升再下降的趋势, 且均在干露12~24 h时SDH活力呈现上升的趋势。对照组青蛤的SDH活力整体变化不大。
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| 图 3 不同温度和不同干露时间下青蛤琥珀酸脱氢酶(SDH)的活力变化 Fig. 3 SDH activities under different desiccation times and temperatures |
干露2 h时, 实验组和对照组青蛤的SDH活力之间无显著性差异(P > 0.05)。干露6 h和12 h时, 实验组青蛤SDH活力均显著低于对照组(P < 0.05), 且T10组青蛤SDH活力显著大于T3组和T20组(P < 0.05)。干露48 h时, 各温度组的SDH活力都显著低于对照组(P < 0.05), 而各温度组之间差异不显著(P > 0.05)。
2.4 不同温度条件下干露胁迫对青蛤抗氧化能力的影响 2.4.1 不同温度条件下干露胁迫对青蛤SOD活力的影响不同温度条件下干露胁迫对青蛤SOD活力的影响如图 4所示。随着干露时间的增加, T3组、T10组和T20组SOD活力均呈现先下降后上升再下降的趋势, 干露48 h内整体呈下降趋势。
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| 图 4 不同温度和不同干露时间下青蛤超氧化物歧化酶(SOD)活力的变化 Fig. 4 SOD activities under different desiccation times and temperatures |
干露2 h时, T3组和T10组SOD活力低于对照组(P > 0.05), T20组SOD活力显著低于对照组(P < 0.05)。干露6 h时, T20组SOD活力最高, T3组、T10组和对照组均显著低于T20组(P < 0.05)。干露12 h时, T3组和T20组SOD活力显著高于T10组和对照组(P < 0.05)。干露24 h时, SOD活力显著表现为:对照组 > T10组 > T3组 > T20组(P < 0.05)。
2.4.2 不同温度条件下干露胁迫对青蛤CAT活力的影响不同温度条件下干露胁迫对青蛤CAT活力的影响如图 5所示。随着干露时间的增加, T3组、T10组和T20组CAT活力总体上呈现显著下降的趋势。
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| 图 5 不同温度和不同干露时间下青蛤过氧化氢酶(CAT)活力的变化 Fig. 5 CAT activities under different desiccation times and temperatures |
干露2 h时, 各温度组CAT活力差异显著, T3组 > 对照组 > T10组 > T20组(P < 0.05)。干露6 h时, T3组和对照组CAT活力无显著性差异(P > 0.05), T10组和T20组CAT活力均显著低于对照组(P < 0.05)。干露12 h、24 h和48 h时, 各温度组CAT活力均显著低于对照组(P < 0.05)。
3 讨论 3.1 干露胁迫对青蛤死亡率和失水率的影响青蛤属于潮间带埋栖贝类, 经常会面临各种环境因子的改变, 干露是其必须面临的重要环境变化之一。干露于贝类而言, 本来就是一种环境胁迫, 贝类无法滤食, 而温度又会影响水产动物的代谢速率[21]。实验证明, 随着干露时间增加失水率逐渐增加, 这一结果也与刘旭绪研究干露胁迫对魁蚶幼贝失水率的研究结果较为相似[11]。相同干露时间, 温度越高, 其失水率也越高。干露胁迫下青蛤的死亡率主要表现为:在干露时长48 h内, 3℃和10℃均未出现死亡情况, 在20℃条件下干露时长在24 h及以后出现死亡情况。研究发现, 随着温度的升高, 青蛤死亡率也随之增加, 这与王文文和杨凤等在菲律宾蛤仔干露实验所得结论相似[9-10]。而低温干露条件, 能够有效保障青蛤的存活率, 这与于瑞海等[8]在海湾扇贝耐干露研究中所得结果相一致。另外, 对西施舌稚贝的研究表明, 随着干露温度的升高, 死亡时间显著提前[22]。而对太平洋牡蛎的研究结果表明, 低温干露下贝类的成活率显著高于高温条件[15]。但是, 也有研究表明施氏獭蛤稚贝对低温干露的耐受性较差[16], 这可能由于青蛤属广温性贝类, 适应的温度范围广, 可以适应低温干露条件, 而低温环境属于施氏獭蛤生存海区温度变化范围之外, 导致其死亡率高。
青蛤遭受干露胁迫时, 其双壳紧闭, 以减少体内水分的流失, 从而提高其耐干露能力。在干露期间, 青蛤借助体内的水分可维持短时间机体的存活, 因此青蛤在遭受干露胁迫时其死亡率与失水率密切相关。我们认为, 青蛤24 h内的运输基本可以常温进行, 更长时间的运输则最好能在低温条件下运输, 这样会降低青蛤的死亡率。
3.2 干露胁迫对青蛤呼吸代谢的影响LDH是无氧呼吸代谢的标志酶, 其可催化丙酮酸转化为乳酸, 乳酸分解为机体提供ATP[23], LDH活力的高低反映了机体无氧代谢的水平[10, 24-25], SDH是有氧呼吸的第一个酶, 有氧呼吸时其在三羧酸循环中可以将琥珀酸氧化成延胡索酸[26], SDH活力的高低反映了机体有氧代谢的水平[27], 本实验通过测定干露过程中, 青蛤LDH和SDH活力, 反映青蛤的呼吸代谢水平。48 h内, 各温度组LDH和SDH活力总体上呈下降趋势, 且低于对照组, 表明干露胁迫抑制了青蛤呼吸代谢酶活力。这与干露胁迫对日本囊对虾和三疣梭子蟹呼吸代谢酶的影响研究有所不同, 段亚飞认为, 干露胁迫下脊尾白虾有氧呼吸被抑制, 依靠无氧呼吸代谢维持生理活动, 所以SDH活力下降而LDH活力升高[28]。姜娜认为, 无氧呼吸的增加是三疣梭子蟹适应干露胁迫的表现[29], 而本研究在干露12 h和24 h之间, 3℃组和10℃组LDH活力均出现上升趋势, 这一结果不仅在一定程度上与上述实验结果一致, 无氧呼吸以减少对体内氧气的消耗也与干露胁迫对大竹蛏的呼吸代谢的影响研究较为一致[30], 究其原因, 可能是由于无氧呼吸出现乳酸的堆积, 激发了LDH活力, 从而将乳酸催化为丙酮酸, 为机体维持生命提供能量[31]。
不同温度条件下, 干露24 h, 3℃组与10℃组青蛤LDH与SDH活力均有一定程度的增加, 可能是因为该温度条件下青蛤在24 h内失水率较低, 机体保存了一定量的水分, 可以通过有氧呼吸和无氧呼吸共同维持其生命现象。而20℃组, 由于其失水量逐渐增加且失水较为严重, 青蛤LDH和SDH呈持续下降趋势, 且显著低于3℃、10℃和对照组, 表明20℃组遭受干露胁迫时, 生命活力逐渐下降, 这也可能是20℃组青蛤在24 h就开始出现死亡, 并死亡率逐渐升高的原因。另外, 3℃组和20℃组的LDH和SDH活力整体水平上低于10℃组, 10℃组呼吸代谢酶活力与对照组较为接近, 表明在10℃干露条件下, 青蛤呼吸代谢酶活力接近正常养殖情况, 青蛤能维持较强的生命活力, 所以, 该温度条件可作为长途活体运输参考温度。
3.3 干露胁迫对青蛤抗氧化能力的影响青蛤属于低等无脊椎动物, 缺乏免疫球蛋白, 其免疫活动基本是靠非特异性免疫来实现。SOD和CAT能够清除和分解体内O2–、H2O2等氧化物, 减少活性氧自由基(ROS)对机体造成的损伤, 在保护细胞免受过氧损伤中起着重要的作用[32-34]。在生物抗氧化系统中, SOD和CAT相互配合, SOD首先将O2–歧化为O2和H2O2, CAT继而将H2O2转化为H2O。实验通过测定SOD和CAT活力, 反映不同温度干露胁迫下, 青蛤抗氧化水平的高低情况。结果表明, 各实验组SOD活力的出现波动峰值顺序为20℃组 > 3℃组 > 10℃组, 且峰值为20℃组最高, 10℃组最低, 这可能由于10℃组青蛤, 在干露胁迫下机体受损程度较小, 在同样的时间刻需要依靠SOD消除的ROS没有另外两组[29]。还表明20℃组干露胁迫对青蛤机体的损伤程度高于3℃组和10℃组, 该结果也与呼吸代谢酶所得结果相一致。而各组SOD活力出现峰值之后, 均呈现出下降趋势, 这可能由于干露过程中, 机体能量持续消耗, 以至于能量不足以持续调控自身SOD活力, 以减少ROS对机体的损伤。三个实验组CAT活力总体水平为3℃组 > 10℃组 > 20℃组, 其中3℃组接近对照组水平, 20℃组与对照组差异较大, 表明高温干露胁迫对青蛤的损伤大于低温干露。实验组CAT活力, 在干露12 h以后, 均随着时间的增加而下降。
通过不同温度和干露时间青蛤SOD和CAT活力的变化表明, 干露初期, 青蛤是可以通过调节自身抗氧化能力的强弱来应对干露胁迫, 并且更接近养殖水温的20℃组, 表现出SOD活力的快速上升, 这可能是由于, 干露温度为20℃时, 青蛤机体还能依靠壳内保存的水分维持较高的生命活力和较强的非特异性免疫; 但是, 随着干露时间的延长, 三组青蛤抗氧化能力都有显著下降, 且明显低于对照组, 这可能是青蛤壳内水分不断消耗, 只能通过减少自身的生命活动, 来应对干露胁迫。
4 结论综上所述, 干露胁迫不仅会加剧青蛤失水, 而且会通过影响其呼吸代谢和抗氧化相关酶活性, 导致青蛤死亡。所以, 青蛤长途运输应选择在不超过10℃的环境温度下进行, 这样青蛤将会保持较好的呼吸代谢功能, 且干露胁迫所造成的机体损伤也会较小。而关于青蛤对干露的耐受机制的探讨, 还有待于后续实验从转录组, 代谢组以及基因组方面进行深入研究。
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