紫菜隶属于红藻门红毛菜科紫菜属(Porphyra), 广泛生长于全球海岸带。其具有多种生物活性^[1], 以及较高的营养价值和药用价值。作为我国重要的经济栽培物种, 常见的有属暖温性的坛紫菜(P. haitanensis Chang et Zheng)和属冷温性的条斑紫菜(P. yezoensis Ueda)^[2]。尤其坛紫菜, 在我国东南沿海广泛栽培, 其产量约占全国紫菜产量的75%^[3]。从2008年至2016年, 我国紫菜总产量达到了13万吨^[4], 其增长率为60%以上。据2011年的文献报导, 其年产值达到了13亿美元^[5]。

对紫菜属的研究发现, 绝大多数紫菜生活史中具有大型叶状体和微型丝状体两个世代^[6-7]; 有三种孢子, 即与有性生殖相关的果孢子和壳孢子, 以及与无性生殖相关的单孢子。坛紫菜生活史的两个世代具有明显不同的形态和生物学特征^[8]。其配子体为单层细胞(局部为两层细胞)的叶状体, 孢子体为单列细胞的丝状体。在紫菜的栽培生产中, 孢子体可作种苗用于栽培生产, 丝状体可作种质用于筛选优质种苗, 两者对紫菜的育苗生产都十分关键。

根据分析总结现有资料, 坛紫菜生活史可划分为2个阶段: (1)叶状体阶段——壳孢子萌发成叶状体至产生果孢子时期; (2)丝状体阶段, 即壳斑藻阶段——果孢子脱离母体、萌发成丝状体至放散出壳孢子时期。

我国紫菜的遗传育种成果显著, 截至2018年已培育出6个紫菜良种, 其中包括4个坛紫菜新品种^[9]。紫菜新品种的培育与其生殖和生活史密切相关, 品质优良的新品种在一定程度上能促进紫菜行业的发展。自1921年^[10]至今, 在紫菜生活史中, 减数分裂的发生时期与位置成为了研究焦点, 这也是紫菜生殖研究中关注和争论最多的地方之一^[11-13]。由于紫菜细胞较小, 染色体也相应较小, 导致在染色过程中染色体分散程度较差, 且染色期间细胞质也染上颜色, 致使细胞核的细微结构较难区分, 因此在没有较好的光学显微镜和染色体制片技术情况下很难清楚地观察到紫菜减数分裂发生的过程, 所得结果也有差异^[10]。对于坛紫菜生活史中是否存在单孢子, 也一直存在着争论^[14-16]。研究坛紫菜的生活史主要是为了在坛紫菜育种方面得到进一步的应用, 以解决紫菜苗源问题。为此, 本文总结了坛紫菜的生殖及生活史的研究现状和存在的问题, 目的是为我国坛紫菜的种质选育等提供理论参考。

1 生殖和生活史

生命体繁衍后代的基体特征为生殖, 它是指由亲代个体产生子代个体的现象。据报道, 紫菜的生殖方式多样且复杂, 即使同一物种, 其生殖方式往往也存在差异, 能够以多种生殖方式繁殖后代^[17]。

1.1 无性生殖

营养细胞和单孢子是紫菜进行无性生殖的两种形式。梅俊学等^[18]发现条斑紫菜叶状体离体组织在一定培养条件下, 其营养细胞经过一系列的变化可产生出幼苗; 方宗熙等^[19]对紫菜营养细胞进行了酶法分离并将其应用于水产养殖。何培民等^[20]发现紫菜可以在较小的育苗室中通过细胞悬浮培养的方式培育出可观的细胞苗种, 这为紫菜体细胞育苗技术的发展提供了可能。紫菜叶状体阶段可产生单孢子, 它是由营养细胞在一定情况下转变而成的。单孢子是紫菜生活史中一种重要的无性繁殖孢子, 它的产生对紫菜苗种数的增加、收获期的延长和产量、品质的提高具有十分重要的意义^[21-23]。李世英等^[24]发现用冷冻紫菜采单孢子苗可以作为紫菜栽培中的苗源。王素娟等^[25]对条斑紫菜成功进行了单孢子二次采苗的实验。张聪等^[26]发现Pyropia churharii单孢子的过量放散会抑制叶状体的增长, 影响其产量。

此外, 藻体的部分细胞会因其受到损伤或者是在其他不利情况下, 如藻体不健康而将要死亡时, 转变为静孢子或内生孢子, 其细胞或原生质体的生命力强大, 即使离开了母体仍可继续萌发, 但这与单孢子有着本质的区别^[27]。

不同种的紫菜叶状体(配子体)单孢子放散的条件不同。Mizuta等^[28]发现了一定剂量的尿囊素可促使条斑紫菜提早形成和放散单孢子。林珠英等^[29]的研究也得出了相同的结果。之后, 孙迪等^[30]在研究中也验证了尿囊素对印度产紫菜Pyropia chauhanii单孢子的放散有促进作用, 并且还发现了尿囊素可以促进紫菜叶状体体细胞分化为生殖细胞。而有些紫菜品种, 包括东亚大量栽培的品种, 可以产生无性孢子或中性孢子^[10], 这两种孢子与单孢子类似。由单孢子形成的叶状体只有单倍体阶段。在条斑紫菜生活史中存在单孢子, 由单孢子萌发形成的苗又可产生第二代、第三代单孢子。因此, 条斑紫菜生长群体中的许多个体实际上都是由单孢子形成的。目前条斑紫菜单孢子细胞工程化育苗已在实际生产中应用^[31]。

在紫菜的栽培生产过程中, 无性生殖对其丝状体的增殖作用明显。紫菜丝状体无性增殖方式^[32]主要有以下3种: (1)丝状体断裂形成藻丝段, 继续生长形成新的丝状体; (2)通过产生单孢子萌发成新的丝状体; (3)以孢子囊枝的形式萌发成丝状体。有学者在坛紫菜的研究中也发现了丝状体在断裂之后形成的藻丝段可以发生增殖现象^[33]。此外, 通过从单藻落、藻丝段获得基因型一致的丝状体无性繁殖系及从单孢子叶状体获得纯合的丝状体无性繁殖系也是解决紫菜育种困难的一种方法^[34]。

1.2 有性生殖

紫菜属有性生殖一直是藻类学家关注的焦点。Berthol首次提出了P. leucosticta存在有性生殖方式^[35]。后来, 相关学者也报道了其他紫菜的有性生殖现象^[36]。目前, 大多数研究者认为紫菜属中大多数种类的主要繁殖方式为有性生殖。

坛紫菜进行有性生殖的方式较复杂, 最初是由叶状体上的营养细胞转化为精子囊细胞和果胞细胞, 而后精子囊细胞经过不断地分裂形成小而无色的精子^{[7-8, 37]}, 最后再与果胞细胞结合完成受精过程。受精果胞(合子)再经过分裂成为果孢子, 成熟的果孢子在一定条件下可离开母体钻入贝壳萌发, 从而开始生活史的另一阶段, 即丝状体阶段。随着丝状体的不断生长, 在合适的条件下逐渐形成膨大的藻丝, 之后转化成壳孢子囊并释放壳孢子, 壳孢子再萌发长成紫菜叶状体, 即紫菜阶段。壳孢子在紫菜的栽培生产中作为种子而存在, 其放散量和附着程度与紫菜的产量和质量是密切相关的^[38-40]。

紫菜藻体的性别多样, 可依据藻体上的雌雄生殖细胞的分布情况划分为以下4种类型: (1)雌雄异体, 如P. dentata和P. pseudolineatis^[41]; (2)雌雄同体, 其雌雄生殖细胞又可分为两种情况, 一种为藻体上的雌雄生殖细胞混杂分布, 称为雌雄同体混杂分布型, 另一种为雌雄生殖细胞在叶状体纵轴两侧分布, 称为雌雄同体分区分布型, 如P. yezoensis (条斑紫菜)^[42]和P. variegate^[43]; (3)雌雄异体为主, 兼有雌雄同体, 如P. haitanensis (坛紫菜)^[44], 其叶状体绝大部分为雌雄异体^†; (4)雌雄同体兼有雄体, 如P. katadai var. hemiphylla (半叶紫菜华北变种)^[45]。

†  严兴洪教授报道坛紫菜在实验条件下主要是雌雄同体(2012年3月10 日在“紫菜研究新进展”研讨会上的口头报告)。

目前文献所报道的坛紫菜性别普遍为雌雄异体, 只有少部分为雌雄同体。雌雄同体的坛紫菜, 其果胞卵囊群和精子囊器(雄性生殖器官)在藻体上一般是以直线或曲线的形式分别在藻体的一定区域集中分布, 有的则是在藻体上对半等分。

1.3 单性生殖

单性生殖是指雌性个体可以在未受精的情况下通过复制自身的DNA繁衍新个体的现象。目前, 紫菜的单性生殖在其生活史中是否存在仍然有争议。由于紫菜的适应性强, 在许多环境下仍可存活, 甚至可不经过受精作用而形成单性的果孢子^[46]。目前至少有2种紫菜(P. gardneri和P. umbilicalis)报道了存在单性生活史^[47-52]。

至今为止, 对坛紫菜单性生殖的研究多集中在表观观察上, 很少涉及其发生机理的研究。付阳阳等^[53]在对坛紫菜单性生殖研究中发现在光强增加、高温和N缺乏或富N的条件下可促使坛紫菜单性生殖的发生。钟晨辉等^[54]发现蓝光源可促使坛紫菜单性生殖提早发生, 而绿光源却起到抑制的结果。总之, 单性生殖发生机理仍需要更进一步研究。

1.4 生活史

紫菜生活史, 亦称紫菜生命周期, 包括生长、发育和繁殖等完整阶段, 通过细胞分裂、体积增大和数量增加以及形态功能的分化, 产生与父母本基本相同的子一代, 周而复始地延续生命周期。

紫菜P. umbilicalis的壳斑藻生活阶段的发现是紫菜生活史研究取得的突破性进展^[55]。随着对栽培紫菜生活史研究的深入, 发现了紫菜的其他生殖方式。张学成等^[56]根据紫菜生活史是否放散孢子对其进行了大致的分类: (1)以P. yezoensis和P. oligospermatangia(少精紫菜)为代表的有单孢子型生活史; (2)以P. haitanensis和P. katadai var. hemiphylla为代表的无单孢子型生活史; (3)以P. tanuipedalis (贝壳紫菜)为代表的无壳孢子型生活史。有报道认为, 紫菜生活史可划分为4种类型, 即无性型、有性型、有性与无性混合型和单倍核相型^[17]。最近Varela-Á lvarez等^[57]在染色体多倍性的研究中提出了三种紫菜生活史的新推测, 即: (1)生活史1 (P. linearis, P. umbilicalis和P. dioica):三倍体和四倍体两种谱系共存, 但彼此分离; (2)生活史2(P. linearis, P.umbilicalis和P. dioica):三倍体和四倍体两种谱系共存, 但所释放的配子具有不同的倍性, 可相互交叉, 基因流从四倍体到三倍体; (3)生活史3(P. umbilicalis):三倍体、四倍体和混合倍体三种谱系共存, 混合倍体谱系充当三倍体和四倍体之间的桥梁。此外, 还有不同学者试着从不同角度对紫菜生活史进行了分类^[58-60], 但总的来说都存在一定的局限性。

过去普遍认为坛紫菜叶状体的生殖方式仅存在有性生殖, 直到紫菜叶状体营养细胞再生为叶状体的发现才打破了这种错误的认识^[15]。目前认为坛紫菜和条斑紫菜生活史同时存在有性生殖和无性生殖两种方式, 它们均属于混合型生活史。

2 存在问题

虽然对坛紫菜的生殖和生活史方面已经有了一定的研究进展, 但仍存在一些问题亟待解决, 如单孢子是否存在等。

2.1 坛紫菜生活史中是否存在单孢子

对于坛紫菜生活史中单孢子是否存在的问题, 一直存在争议。一些学者认为坛紫菜叶状体不能产生单孢子^{[14, 61]}。据报道, 藻体较薄且由单层细胞构成的物种可以产生单孢子, 而藻体为双层细胞或具有双色素体的物种不能自然形成单孢子^{[59, 62]}。也有学者报道在坛紫菜上观察到了单孢子的存在, 并可培养成苗^[15]。项文钰^[63]观察到坛紫菜有类似单孢子形态的细胞出现, 他认为不能断定坛紫菜是不存在单孢子无性生殖途径。李勇斌等^[64]在诱变坛紫菜原生质体后发现一些类似单孢子的颗粒状细胞。潘光华^[16]报道坛紫菜存在单孢子无性繁殖方式。王娟^[17]发现坛紫菜小苗稍部的营养细胞或藻段在特定条件下能够脱离母体而生长成幼苗。

实际生产应用中, 相对于大量放散单孢子成苗的条斑紫菜而言, 坛紫菜的海上自然补苗作用并不明显, 其在海上生产过程中并未观察到明显的新生苗的发生和生长, 其巨大的产量主要依赖于个体比较大的藻体及其生长条件。

2.2 坛紫菜减数分裂发生的位置

1955年曾呈奎^[65]将甘紫菜的丝状突起称为原始受精丝; 1978年Hawkes在研究中发现P. gardneri的精子囊内容物能够通过原始受精丝进入果胞^[46], 这一结果为揭示紫菜生活史中的有性生殖过程提供了强而有力的证据。紫菜受精过程得到证实^[4], 其生活史中也必然会发生减数分裂。

据归纳总结, 关于紫菜的核相与减数分裂发生的时期主要有4种代表性观点: (1)受精果孢的首次细胞分裂期间进行减数分裂, 产生单倍体的果孢子^{[11, 66-67]}; (2)在孢子囊枝中形成壳孢子期间进行减数分裂, 产生单倍体的壳孢子, 后者萌发后产生叶状体细胞, 其基因型相同^{[12, 68-70]}; (3)壳孢子萌发时期发生减数分裂, 分裂所产生的细胞其基因型不同, 但都分布在同一个紫菜个体, 即紫菜的叶状体为嵌合体^{[13, 36, 71-75]}; (4)在孢子囊枝形成与成熟期发生减数第一次分裂, 在减Ⅰ分裂期间有双分孢子的产生和壳孢子的放散, 壳孢子萌发分裂标志着减数第二次分裂的开始^[76]。

关于紫菜减数分裂还有一些其他观点: (1)减数分裂可能是不固定的, 不同种类紫菜其减数分裂发生的时间和位置不同^[77]; (2)壳孢子萌发过程中进行减数分裂, 主要包括雌雄同体各半的种类和藻体上混杂分布有性生殖细胞的雌雄同体种类^[78]; (3)壳孢子形成时期发生了减数分裂, 主要为雌雄异体种类^[78], 即壳孢子作为单倍体而存在。

目前, 藻类学家普遍接受紫菜在壳孢子萌发时期发生了减数分裂的观点, 但这只在个别紫菜物种(P. tenera, P. torta, P. yezoensis和P. purpurea等)中得到了证实。曾呈奎^[79]认为坛紫菜在壳孢子萌发时期发生减数分裂的可能性最大, 但没有确凿的证据。严兴洪等^[80-81]通过对坛紫菜色素突变体与野生型进行杂交试验发现减数分裂发生在壳孢子萌发时最初进行的两次细胞分裂。黄秋^[82]判断在壳孢子萌发成叶状体期间发生了减数分裂, 壳孢子萌发初期进行的两次细胞分裂为减数分裂。严兴洪等^[83]的研究仍然支持坛紫菜在壳孢子萌发时期发生了减数分裂。严兴洪等^[84]又对坛紫菜生活史的各阶段进行了细致的细胞学观察, 再次表明了在坛紫菜(雌雄异体)生活史中, 减数分裂发生在壳孢子萌发的初始分裂时期。之后, 杨秀文等^[85]通过对圆紫菜色素突变体的杂交试验也认为在壳孢子萌发的最初两次细胞分裂发生了减数分裂, 即壳孢子萌发初期发生了减数分裂。

坛紫菜减数分裂的具体发生时期的确定仍需要进一步的证据来加以证实。首先, 坛紫菜在生活史的不同阶段其形态变异较大, 尤其是在丝状体阶段, 仅仅通过形态学的判断难以确定减数分裂发生的时期; 然后, 在显微镜下观察细胞核染色体的变化较困难, 难以通过核相的变化来推测减数分裂发生的具体时期; 其次, 获得理想的色素突变体也比较困难, 因此利用色素突变体的方法来验证减数分裂也相对困难。最后, 通过目前的仪器(如流式细胞仪)达到准确分离某一分裂期的细胞难度系数较大, 直接观察坛紫菜的减数分裂难以实现。因此, 减数分裂发生于坛紫菜生活史的具体时期仍难有定论。

2.3 坛紫菜是否存在单性生殖

野生坛紫菜性别大多数为雌雄异体, 其生殖方式一般为有性生殖。坛紫菜的性别表现是否会受到人为单性培养的影响, 性别表现的改变又是否影响其生殖方式, 这在坛紫菜单性生殖的研究中是值得思考的问题。这不仅涉及坛紫菜遗传育种方面的研究, 还极可能对遗传学的理论研究提供新的见解。曾庆国等^[86]利用隔离培养的方式把坛紫菜的单个体细胞(单倍体)培育出了无性纯合系(二倍体), 并且对其进行了生活史探讨, 但对紫菜的单倍体细胞如何加倍和单性生殖存在的问题并未给予讨论。近年来有研究报道, 紫菜的单性营养细胞或组织培养在一定条件下可以通过性逆转的方式转变为雌雄两种不同性别产物。姜红霞^[87]的研究发现, 对半叶紫菜华北变种的单性营养组织的离体培养可以形成类果孢子囊和类精子囊器, 或形成与果孢子囊功能相似的细胞团。潘光华^[16]对坛紫菜叶状体无性繁殖系的研究也得到相似结果。许璞^[88]在对坛紫菜的性别特征研究中发现其雌雄性别比例具有1︰1的关系, 且在对野外成熟的藻体进行培养中, 发现两种性别植株都表现出了相反性别性状的个体, 并出现雌性同株个体。王娟^[17]在对坛紫菜单性生殖时也发现了相同的现象, 认为坛紫菜在单种性别的情况下启动异性基因的表达, 促使藻体某些细胞转变为异性生殖细胞, 从而保证生命体的繁殖。严兴洪等^[89]发现, 坛紫菜的遗传纯系可单性生殖。王娟等^[90]的研究发现, 坛紫菜并非完全通过单性生殖途径产生单性营养细胞后代。潘光华等^[91]认为由坛紫菜单性组织发育形成丝状体的繁殖方式不属于单性生殖, 原因: (1)单性组织通过性逆转方式产生两性生殖细胞发生在丝状体形成之前; (2)由丝状体所产生的某些单性叶状体后代是通过性逆转形成的, 因此单性叶状体并非全部为单一性别个体。

坛紫菜营养细胞和组织在发育过程中其单性生活史转变为“有性”生活史, 这极有可能通过性逆转方式产生。因此, 很难断定之前报道中通过单性生殖方式获得的丝状体纯系为单性生殖产物。由于紫菜雌配子较难获得, 以及难以判断果胞受精状况, 因此该方面的研究仍比较欠缺, 有待于更加深入的研究。

传统观点普遍认为, 单性生殖只能短期存在^[92], 因为长期的单性生殖不能够通过基因重组注入新基因和淘汰有害的突变, 使物种不能进化, 不能适应新的环境变化, 从而导致该物种的繁衍走到尽头。但事实表明, 许多单性物种的繁殖速度不仅快, 而且比两性物种具有更强的优越性。此外, 在研究中发现有大约50种单性生物不但没有因为基因重组的丧失而走向灭绝, 反而生命力更旺盛^[93]。这类似现象是否存在于紫菜单性生殖中仍然是一个有待验证的问题。尽管紫菜丝状体为单倍体和单性生殖的研究已有相关报道^[47-52], 但仍需要更多证据来支持。紫菜单性生殖是否与其他物种存在差异, 也仍需要进一步的研究来证实。

3 结语

目前, 国内外有关紫菜的研究工作大多数都集中在条斑紫菜上, 虽然人工栽培坛紫菜的技术日渐成熟以及对坛紫菜的基本生物学掌握较多, 但是对坛紫菜遗传规律的认识还有待加强。一方面是由于坛紫菜存在细胞较小、核的细微结构较难区分的特点, 另一方面在于观测仪器与制片技术, 使得观测的结果各不相同, 对坛紫菜减数分裂的位置问题仍然得不到肯定的结论。此外, 坛紫菜是否存在着单孢子, 也还存在争议。坛紫菜细胞发育中会经过有性生殖^[63]、无性生殖^[94]这两种生殖方式, 甚至会出现某些特殊的发育模式, 比如膨胀细胞、放散小孢子等^[63], 但它们能否被并入坛紫菜生活史循环中, 以及能否代替颇多争议的单孢子成为坛紫菜种苗的产生来源, 尚需进一步的跟踪研究。

近几年来, 紫菜行业的发展非常迅速, 但紫菜减数分裂的问题仍需要新技术和新方法的应用才能完善。朱家彦等^[95-96]已通过电子显微镜分别观察到了坛紫菜丝状体及壳孢子的超微结构, 合理运用该技术, 很有可能确定减数分裂的确切时期。利用流式细胞仪对紫菜各个生长阶段的DNA含量进行检测, 可对其生殖模式进行判断。利用DNA分子标记技术在遗传育种和基因定位等方面所具有的优势, 标记杂合丝状体同源位点, 跟踪其在子代叶状体中的分布情况, 有可能确定壳孢子是否发生减数分裂或发生时期。在纯系检验方面, 共显性的微卫星标记具有一定的优点^[97], 可以对紫菜叶状体进行纯合性和嵌合性的检测, 从而验证紫菜的减数分裂与壳孢子萌发是否有关系。不断发展的激光共聚焦显微术在细胞水平上可进行多种功能的测量和分析, 获得高分辨率的三维图像, 还可对细胞DNA含量或RNA含量进行精确的定性定量分析, 甚至还可对其进行定时、定位分析, 这对紫菜减数分裂和核相的研究也将会是有利的运用。随着现代分子生物技术手段的日新月异以及交叉学科的融合发展, 坛紫菜减数分裂时期与位置的定位和核相类型的确认等难题终将迎刃而解, 其遗传育种进程也将向深层次推进。

致谢: 作者感谢中国海洋大学的汤晓荣副教授和苏州大学的沈颂东教授在本文组织和撰写中给予的指导和提出的修改建议。