文章信息
- 阎波, 张欣, 张轲, 陈莉, 田丹. 2021.
- YAN Bo, ZHANG Xin, ZHANG Ke, CHEN Li, TIAN Dan. 2021.
- 菲和Cd2+单一及复合污染对毛蚶氧化胁迫效应的比较
- Comparison of single and combined pollution effect of phenanthrene and cadmium on the oxidative pressure of Anadara Subcrenata
- 海洋科学, 45(1): 44-53
- Marina Sciences, 45(1): 44-53.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20200720006
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文章历史
- 收稿日期:2020-07-20
- 修回日期:2020-08-21
2. 天津市海洋资源与化学重点实验室, 天津 300457;
3. 天津市海洋环境保护与修复技术工程中心, 天津 300457
2. Tianjin Key Lab of Marine Resource and Chemistry, Tianjin 300457, China;
3. Tianjin Marine Environmental Protection and Restoration Technology Engineering Center, Tianjin 300457, China
我国沿海地区的环境污染主要表现为有机物和重金属污染, 多环芳烃(PAHs)菲和Cd2+作为有机物和重金属污染的典型代表, 在渤海湾海域的生物体内均有较高浓度的检出[1-3]。如郑关超等[4]采用高效液相色谱法分析环渤海地区养殖水产品中PAHs含量, 其中菲的平均含量最高为6.53 μg·kg-1, 检出率高达88.5%。庞艳华等[5]采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)分析大连近岸海域双壳经济贝类体内重金属的含量, 并采用单因子评价模式对重金属蓄积程度进行评价, 发现部分样品Cd2+含量超标。已有大量研究表明, 菲和Cd2+污染会对海洋生物产生一系列有害的化学作用, 包括通过增加生物体内活性氧或自由基类物质的浓度[6], 导致机体氧化系统和抗氧化防御系统失衡, 从而使之产生氧化应激反应, 甚至造成显著的毒性影响[7-8]。目前, 单一污染物或同种污染物在海洋生物体中的富集及毒性机理研究已较为深入[9-10], 但随着环境毒理学研究的不断深化, 传统的作用机制不能用于解释多种污染物的复合作用, 对于多种污染物的影响研究愈加引起广泛关注, 阎波等[7]通过室内半静态双箱动力学模型研究了菲和Cd2+单一和复合污染条件下在毛蚶体内的富集动力学, 发现在两种污染物同时暴露时, 毛蚶对菲和Cd2+的吸收富集均有所增强。李定龙等[11]认为四溴双酚A(TBBPA)和镉对蚯蚓和斑马鱼的死亡率均表现为协同作用。由此可见, 复合污染有其特殊的毒性机制。并且复合污染模式的研究更能解决实际环境问题, 广泛地开展这方面的研究是大势所趋。
毛蚶(Anadara subcrenata)是重要的海产经济贝类, 普遍生活在我国渤海海域潮间带地区。因其生活在沙质淤泥底部、移动性差、特殊的滤食特性使它们易受污染物的长期影响, 并能有效富集海洋中的污染物, 是一种监测海洋污染物生物有效性的指示生物[12]。而毛蚶作为一种美味的海产品, 其生物安全性与人类健康息息相关。本实验选用毛蚶为研究对象, 通过半静态染毒实验, 观察不同浓度菲和Cd2+单一污染和复合污染情况下毛蚶体内活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量和谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione-S-transferase, GST)活性的变化规律。以期为揭示海洋生物暴露于复合污染中而导致的氧化应激毒性提供线索, 并为生态风险评价提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料毛蚶购于天津市滨海新区金元宝大型海鲜市场, 在实验室中用海水晶配制的人工海水(盐度为26)驯养7 d以上用于染毒实验。驯养在水族箱(60 cm×30 cm× 35 cm)中进行, 间断性曝气充氧, 水温控制在(18.0 ± 0.5℃), 用虹吸法每日更换一次养殖用水, 并定时投喂角毛藻作为食物来源。驯养期间及时检查毛蚶的生命状态, 取出死亡个体。毛蚶死亡标准:两壳长久张开、用探针多次刺激无张合反应。驯养结束后选择个体健康、大小均匀的毛蚶进行正式实验, 本次实验选用的毛蚶壳长3±1 cm、壳高2±1 cm、软组织湿重5.00±1.00 g。
菲(Phenanthrene)为分析纯(购于美国Sigma公司, 纯度 > 98%), 用N, N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解, 配制浓度为5 g·L-1的储备液。重金属镉为CdCl2·2.5 H2O固体, 分析纯(购买于天津市风船化学试剂科技有限公司), 配制浓度为50 g·L-1的镉储备液。DMF为分析纯(购于天津市风船化学试剂科技有限公司), 蛋白质、ROS、GSH和GST测试试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
1.2 实验方法 1.2.1 半静态染毒实验本实验分为染毒(9 d)和清水释放(2 d)两个阶段。染毒阶段将配制的菲和Cd2+储备液分别稀释成浓度为菲50 mg·L-1和Cd2+ 500 mg·L-1的使用液。各染毒实验组的浓度设置如表 1所示, 包括空白对照组和DMF(最大体积比0.01%)对照组各1组, 菲和Cd2+的单一染毒共4组, 菲和Cd2+复合染毒1组。实验在2 L的玻璃烧杯中进行, 不同染毒组均设置3个平行。实验期间每24 h更换一次实验用水(按照设置浓度), 定时定量投喂角毛藻。释放阶段将配制的染毒溶液换成未染毒的人工海水进行2 d的清水恢复实验。
组别 | 组号 | 菲浓度/(μg·L-1) | Cd2+浓度/(μg·L-1) |
空白对照组 | 1 | 0 | 0 |
DMF对照组 | 2 | 0 | 0 |
单一染毒组 | 3 | 10 | 0 |
4 | 50 | 0 | |
5 | 0 | 100 | |
6 | 0 | 500 | |
复合染毒组 | 7 | 50 | 500 |
为确定半静态染毒实验的本底值以及染毒溶液的工作浓度, 分别对所配制的人工海水及各染毒组溶液中菲和Cd2+的含量进行测定, 其中菲的浓度采用GB/T26411-2010气相色谱法-质谱法进行测定, Cd2+的含量参照GB17378.4-2007火焰原子吸收分光光度法进行测定。
1.2.2 毛蚶生理指标的测定在半静态染毒实验的第1、3、5、7、9 d和清水恢复阶段的第2 d采集毛蚶样品。从各染毒组随机取出至少2只毛蚶, 迅速剥除外壳, 取出全部组织, 用生理盐水(0.86%)除去表层血渍, 沥干后称重、剪碎, 移至玻璃匀浆器中, 按质量(g)︰体积(mL)=1︰9的比例加入4℃预冷的生理盐水, 在冰浴中充分匀浆制备成10%的组织匀浆液。经冷冻离心机在4℃、3500 r·min-1下低温离心10 min, 取上清液置于-20℃待测。
蛋白质含量、ROS、GSH和GST的测定均参照试剂盒说明书进行。其中总蛋白质含量采用考马斯亮兰法进行测定; ROS含量通过加入DCFH-DA(2, 7-dishlorofuorescin diacetate)荧光探针测得, 用各样品的荧光度值与其蛋白含量的比值表示, 单位为FI·(mg·prot)-1。荧光度值由Synergy 4多功能微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)测定; GSH含量通过采用二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应产生的黄色化合物比色测得, 单位为mg·(g·prot)-1; GST活性通过1-氯-2, 4-2N基苯(CDNB)法测得, 以每毫克组织蛋白反应1 min使反应体系中GSH浓度降低1 μmol·L-1的量为一个GST活力单位(U), 单位为U·(mg·prot)-1。吸光度值由752型紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)测定。
1.3 数据分析实验测定数据以平均数±标准偏差(Mean ± SD)表示, 采用IBM SPSS Statistics 25统计软件对数据进行统计学分析, 采用单因素方差分析法(One-way ANOVA)和LSD法对不同染毒组和组间的平均值进行多重比较, 认为P < 0.05时存在显著性差异。用Origin 2018软件对所有统计结果进行绘图。
2 结果 2.1 各染毒组菲和Cd2+工作浓度测定结果所配置的人工海水中均未检出菲和Cd2+污染。各染毒组溶液中菲或Cd2+的工作浓度测定结果见表 2。将表中各浓度组菲和Cd2+的测定浓度与设计浓度进行比较, 其回收率均大于80%, 符合质量控制的要求。因此, 我们按照菲和Cd2+的设计浓度来进行后续的分析与讨论。
组号 | 菲浓度/(μg·L-1) | Cd2+浓度/(μg·L-1) |
3 | 8.33±0.86 | 0 |
4 | 48.08±1.46 | 0 |
5 | 0 | 97.50±6.10 |
6 | 0 | 477.33±22.59 |
7 | 44.76±0.94 | 472.18±12.59 |
对实验期间所有采样时间点空白对照组与DMF对照组毛蚶体内各指标测定结果进行比较, 发现在胁迫实验和清水释放实验结束后, 空白对照组和DMF对照组之间的ROS含量、GSH含量和GST活性均无显著性差异(P > 0.05, 表 3), 表明实验中用作助溶剂的DMF加入量对实验结果没有影响, 为保证数据的统一性, 因此我们仅采用空白对照组进行后续的统计与分析。
暴露阶段/d | 浓度组 | ROS/(mg·prot) | GSH含量/[mg·(g·prot)-1] | GST活性/[U·(mg·prot)-1] |
1 | 1 | 159.84±25.24 | 7.92±0.38 | 7.79±1.37 |
2 | 144.13±1679 | 5.96±1.02 | 8.39±1.51 | |
3 | 1 | 20556±14.16 | 9.01±1.00 | 12.12±2.00 |
2 | 211.11±6.50 | 8.87±0.80 | 13.50±1.12 | |
5 | 1 | 224.33±3.62 | 10.66±0.40 | 8.73±1.06 |
2 | 212.78±19.29 | 10.35±0.38 | 7.00±0.37 | |
7 | 1 | 196.57±76.39 | 6.86±1.62 | 6.36±0.74 |
2 | 179.88±39.07 | 5.07±0.81 | 3.87±0.53 | |
9 | 1 | 241.02±38.82 | 7.21±0.66 | 5.89±1.60 |
2 | 266.47±78.99 | 6.64±0.03 | 3.55±0.62 | |
2* | 1 | 205.01±61.26 | 7.37±2.78 | 6.80±0.64 |
2 | 176.08±24.98 | 6.46±1.77 | 7.80±0.48 | |
注: 2*代表清水恢复阶段第2 d。 |
菲与Cd2+单一及复合污染下毛蚶体内ROS含量的变化如图 1所示。对照组毛蚶体内ROS含量呈波动变化, 范围为159.84~241.02 FI·(mg·prot)-1。在菲单独胁迫下(图 1-a), 除染毒第7 d外, 10 μg·L-1(低)浓度组毛蚶体内ROS含量均高于对照组, 且第1、5 d差异显著(P < 0.05), 50 μg·L-1(高)浓度组ROS含量均显著高于对照组水平(P < 0.05)。清水释放阶段, 不同浓度组ROS含量均降至对照组水平。在Cd2+单独胁迫下(图 1-b), 染毒期间, 各浓度组毛蚶体内ROS含量均高于对照组。100 μg·L-1(低)浓度组于染毒第5 d时升至最大值, 高于对照组41.62%。500 μg·L-1(高)浓度组于第1 d时显著升高(P < 0.05), 并随时间的延长ROS含量的增加愈明显, 第5 d后, ROS含量降低, 虽和对照组相比无显著性差异, 但从数值上仍高于对照组。清水释放阶段, 不同浓度组ROS含量均与对照组无显著性差异。在菲和Cd2+复合胁迫下(图 1-c), 复合胁迫组ROS含量变化随染毒时间的增加而逐渐上升并显著高于对照组(P < 0.05), 第5 d时达到最大值, 随后略有下降直至对照组水平。我们将单一污染物胁迫组视为阳性对照, 比较发现, 除染毒第9 d外, 复合胁迫组ROS含量在数值上均高于菲和Cd2+单独胁迫组, 但差异性不显著。清水释放阶段, 单一和复合胁迫组ROS含量均降至低于对照组水平, 且各组之间无显著性差异。
2.4 菲和Cd2+对毛蚶GSH含量的影响菲与Cd2+单一及复合污染下毛蚶体内GSH含量的变化如图 2所示。对照组毛蚶体内GSH含量呈波动变化, 范围为6.86~10.66 mg·(g·prot)-1。在菲单独胁迫下(图 2-a), 染毒初期, 低浓度组毛蚶体内GSH含量稍低于对照组, 且无显著性差异(P > 0.05)。随染毒时间的延长, GSH含量先升高后降低, 在第9 d时降至最小值, 为对照组的57.65%。高浓度组GSH含量均显著低于对照组, 且在染毒第3 d时, 下降最为明显, 仅为对照组的32.24%。清水释放阶段, 各浓度组GSH含量与对照组相比均略有升高但无显著性差异(P > 0.05)。在Cd2+单独胁迫下(图 2-b), 各浓度Cd2+染毒组GSH含量均低于对照组。染毒第7 d时, 低浓度组诱导毛蚶体内GSH含量最低(P < 0.05), 为对照组的51.30%。高浓度组GSH含量在染毒前5 d均显著低于对照组(P < 0.05), 随后毛蚶体内GSH含量略有升高, 与对照组无显著性差异。清水释放阶段, 各浓度组毛蚶体内GSH含量与对照组相比无显著性差异。在菲和Cd2+复合胁迫下(图 2-c), 毛蚶体内GSH含量在染毒初期即受到显著影响, 显著低于对照组(P < 0.05)并持续至染毒期结束。与菲和Cd2+单独胁迫组相比, 复合胁迫组毛蚶体内GSH含量在第1 d显著降低(P < 0.05)。随染毒时间的延长呈先增加后降低的趋势, 但与单独胁迫组无显著性差异。清水释放阶段, 单一和复合胁迫组毛蚶体内GSH含量均升至对照组水平。
2.5 菲和Cd2+对毛蚶GST活性的影响菲与Cd2+单一及复合污染下毛蚶体内GST活性的变化如图 3所示。对照组毛蚶体内GST活性呈波动变化, 范围为5.89~10.62 U·(mg·prot)-1。在菲单独胁迫下(图 3-a), 低浓度组毛蚶体内GST活性从数值上均低于对照组, 但差异不显著(P > 0.05), 只有染毒第7 d差异显著(P < 0.05), 为对照组的56.82%。高浓度组GST活性在染毒第3、5、9 d时显著低于对照组(P < 0.05), 在染毒末期(9 d)时降至最小值, 仅为对照组的45.80%。清水释放阶段, 各浓度组毛蚶体内GST活性与对照组之间无显著性差异。在Cd2+单独胁迫下(图 3-b), 低浓度组仅在染毒初期(1 d)时对毛蚶体内GST活性有明显影响, 显著低于对照水平(P < 0.05)。并随染毒时间的延长, GST活性呈先增大后降低的趋势。与对照组相比, 高浓度组毛蚶体内GST活性在染毒第3、7 d时显著降低(P < 0.05), 分别为对照组的54.39%和41.82%, 并在第5 d时稍高于对照组。清水释放阶段, 高浓度组毛蚶体内GST活性低于对照水平, 但无显著性差异。在菲和Cd2+复合胁迫下(图 3-c), 与对照组相比, 复合胁迫组在染毒开始时就对GST活性有显著影响(P < 0.05), 并随染毒时间的延长, 下降愈加显著, 一直持续至染毒期结束。复合组在染毒第3 d时GST活性显著低于菲单一胁迫组(P < 0.05), 在染毒第5、9 d时显著低于Cd2+单独胁迫组(P < 0.05)。清水释放阶段, 单一、复合污染胁迫组与对照组GST活性之间无显著性差异。
3 讨论当生物体处于多环芳烃、重金属污染等胁迫环境时, 机体可通过产生活性氧, 如O2-·、H2O2、·OH、NO·等代谢外源伤害, 此过程会伴随产生由未成对电子构成的自由基, 过量的游离自由基会造成机体的过氧化胁迫, 进而诱发氧化损伤, 甚至造成毒性影响[13-14]。Odzak等[15]研究了金属对斑马鱼胚胎的毒性, 推测出ROS含量的增加会造成细胞膜的损伤, 引起机体抗氧化酶活性的变化。Kang等[16]发现ROS的含量增加和氧化应激作用有关。因此ROS生成和氧化应激可作为解释机体受毒性作用的最佳模式[17]。实验中菲单独胁迫使毛蚶体内的ROS含量升高, 高浓度组ROS增量整体显著高于对照组, 且存在剂量-效应关系, 展现了较明显的毒性影响潜力。吕晏锋等[18]人进行的不同浓度菲对鲤鱼的胁迫实验也发现ROS增加引起了抗氧化酶活性的变化, 即生物体肝脏组织酶活性表现出低浓度诱导, 高浓度抑制的效应。在不同浓度Cd2+胁迫下, 毛蚶对高浓度Cd2+污染更加敏感, 在染毒初期生物体内ROS含量就已出现显著增加。一方面可能与浓度设置、生物体的敏感性等多种原因造成有关; 另一方面可能与重金属污染物对生物体的制毒机理有关, 具有氧化还原性的重金属可通过Fenton反应直接产生活性氧自由基, 无中间代谢过程, 从而导致染毒初期ROS含量的明显增长[19]。在复合胁迫染毒期间, ROS增量在数值上均高于菲或Cd2+单独胁迫组, 但无显著性差异。一定程度上表明, 在菲和Cd2+复合染毒胁迫下更加强烈的诱导了毛蚶自身的氧化反应, 但无明显的协同效应。染毒第9 d时ROS含量明显降低, 这可能是由于生物体逐渐适应外界刺激, 体内自我调节发挥作用, 损伤有所恢复, 从而达到一种动态平衡的结果。综上所述, 在本实验中, 菲和Cd2+单一及复合胁迫均能引发毛蚶体内ROS含量的升高。ROS含量的升高会进一步触发需氧生物体内的抗氧化防御系统, 来防止活性氧对机体的氧化损伤, 这个系统主要包含一些能够被应激诱导的酶类, 如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、GSH和酚氧化酶(PO)等[20]。
生物体中的水溶性抗氧化剂(如: GSH)、抗氧化酶(如: GST)对外源性毒物具有一定的防御和调节能力。其中GSH是一种低分子的抗氧化和自由基清除剂[21], 可以直接清除ROS[22], 同时也是抗氧化酶GST的底物[23], 其含量的多少常用于衡量机体抗氧化能力的大小[20, 24]。如计勇等[25]分析了复合污染物对鲫鱼体内GSH含量的影响, 发现指标变化存在时间-效应关系, 证明GSH对外界污染物的生物影响具有敏感性。已有研究表明, 当生物体暴露于污染物时, 体内自由基增多, 从而消耗GSH, 导致GSH值降低, 如果机体自身调节能力不足导致GSH耗尽时, 会产生中毒效应[26]。GST是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的一种, 是生物体对有毒物质进行Ⅱ相生物转化的转化酶之一[27], 通过消除脂质过氧化物ROOH来降低自由基对机体的破坏作用[20]。污染物质进入生物体后通过Ⅰ相生物转化反应形成亲水性中间产物, 而后通过Ⅱ相代谢酶(如GST酶)进行内源性分子结合, 转化为低毒代谢产物排出体外[28]。GST作为抗氧化酶不仅能够清除有机过氧化物, 在肝脏解毒方面也发挥着极其重要的作用[20, 29-30]。由于在肝细胞中分布广泛, 当机体受到损伤时, GST能很快的被释放, 其活性的变化常作为解毒能力的敏感指标。如张燕宁等[31]研究了厦门海域石油烃对僧帽牡蛎体内GST活性的影响, 发现在体外染毒情况下牡蛎与指标GST之间相关性显著, 可通过检测生物体内GST指标的变化来衡量机体的抗氧化能力。王素敏等[32]在进行体外有机污染物暴露实验时发现GST对外界胁迫比较敏感, 可作为污染物早期预警的生物标志物。
在本实验中, 在菲和Cd2+的单独胁迫下, 毛蚶体内GSH含量和GST活性整体变化趋势一致, 均出现了不同程度的降低, 这种降低趋势与ROS的间接作用有关[33], 说明毛蚶在菲或Cd2+的胁迫下大量消耗体内GSH和GST, 从而诱发了机体产生强烈的抗氧化反应。菲和Cd2+高浓度胁迫时, 对毛蚶体内GSH和GST值影响更为明显。说明随着污染物浓度的增加, 毛蚶自身调节能力愈发不足, 导致机体氧化胁迫作用增强, 进一步加深毒性影响。另外, GSH含量和GST活性变化趋势的一致性在一定程度上意味着毛蚶体内GSH主要用作底物诱导GST表达, 而不是用来直接清除ROS, 另一方面也表示毛蚶体内这些非酶抗氧化剂和抗氧化酶被共同调动用于抵抗菲和Cd2+暴露带来的氧化损伤。我们之前对菲和Cd2+单一及复合胁迫对毛蚶体内SOD、CAT活性和总抗氧化能力(TAOC)水平的影响进行过研究[34-35], 结果表明在污染胁迫条件下, 这些抗氧化指标均不同程度地被诱导, 证明了当毛蚶在菲和Cd2+单一及复合胁迫作用下产生了ROS对机体造成的损伤时, 可通过激活体内抗氧化酶(SOD、CAT)的活性来消除过量的自由基对机体的伤害。用于衡量机体抗氧化系统功能状况, 既包括酶促系统, 如SOD、CAT等, 又包括非酶促系统, 如GSH等的综合性指标, TAOC水平的诱导也支持了这一现象。结合本研究结果, 充分说明毛蚶在受到菲和Cd2+单一及复合胁迫后, 在抗氧化剂和多种抗氧化酶上均可表现出明显的应激反应。清水释放阶段, 这种应激反应有所缓解, 菲和Cd2+单一及复合污染胁迫组各抗氧化指标均能恢复至对照组水平, 这一方面是由于生物体的抗氧化防御系统在发挥功能, 消除了多余的活性氧; 另一方面可能是由于外源污染物菲和Cd2+经代谢逐渐释放到清水中从而使其毒性作用降低。因此, 毛蚶体内的抗氧化系统对菲和Cd2+污染具有良好的应激反应敏感性。
同时, 本实验结果表明, 在菲和Cd2+复合污染胁迫作用下, 毛蚶体内GSH含量和GST活性在染毒期间整体低于单独胁迫组, 我们之前对毛蚶体内SOD和CAT指标的研究结果也表明, 菲和Cd2+复合污染对毛蚶的氧化胁迫作用大于二者单独胁迫[35]。说明在复合污染条件下, 毛蚶不足以调节外源污染损伤, 导致抗氧化能力下降, 从而使生物体遭受到较为严重的毒性影响。此研究结果在非酶氧化剂和多种抗氧化酶方面进一步支持了我们先前的研究成果。
综上所述, 菲和Cd2+单独胁迫下, 毛蚶体内ROS含量均高于对照组, 整体呈现出不断增加趋势, GSH含量和GST活性均低于对照组, 整体呈现出先增加后降低的趋势, 且随着污染物浓度的增加, 对各指标的影响愈明显, 存在剂量-效应关系。毛蚶体内GSH含量和GST活性整体变化趋势具有一致性, 在一定程度上意味着GSH作为底物大量参与诱导GST的表达。对比单一及复合污染的结果发现, 菲和Cd2+复合污染增强了二者单独污染对毛蚶的氧化胁迫效应, 表现出更强的氧化损伤。清水恢复阶段结束后, 单一及复合污染胁迫组各指标均能恢复至对照组水平。表明毛蚶体内抗氧化系统适合作为监测海洋多环芳烃和重金属复合污染的生物标志物。
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