2021, Vol. 45
文章信息
- 周洁玉, 刘冬, 田倩, 周军明, 魏辉煌, 李梦圆, 宋雅然, 刘红昌. 2021.
- ZHOU Jie-yu, LIU Dong, TIAN Qian, ZHOU Jun-ming, WEI Hui-huang, LI Meng-yuan, SONG Ya-ran, LIU Hong-chang. 2021.
- 海水铝浓度对海链藻活性、生产力及其固碳性的影响
- Effects of aluminum concentration in seawater on the activity, productivity, and carbon sequestration of Thalassiosira weissflogii
- 海洋科学, 45(1): 85-91
- Marina Sciences, 45(1): 85-91.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20200430002
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文章历史
- 收稿日期：2020-04-30
- 修回日期：2020-09-02
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 近海海洋环境科学国家重点实验室(厦门大学), 福建 厦门 361005;
4. 中南大学, 资源加工与生物工程学院, 湖南 长沙 410083
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Key Laboratory of Offshore Marine Environmental Science (Xiamen University), Xiamen 361005, China;
4. School of Resource processing and Biological Engineering, Central South University, Changsha 410083, China
硅藻是水体中分布最为广泛的单细胞藻类之一, 其种类繁多——是海洋中种群最多的自养型浮游生物。海洋硅藻贡献了全球初级生产力的40%, 相当于所有陆地热带雨林的总和[1-4], 并对全球范围内的碳、氮、氧、硅等元素的地球化学循环均有重要影响。硅藻对于生长环境的变化较为敏感, 环境因子的变动对其生长、生殖会产生较大影响, 进而影响到其在元素循环中的作用。以碳循环为例, 研究表明, 大洋寡铁区域铁离子浓度的升高, 将大大促进对铁元素敏感的硅藻藻属(如拟菱形藻等)的生长, 进而提高该区域硅藻的整体生产力[5-7]。基于该发现, Martin在1990年提出了"铁假说"[8], 认为铁的供给增加能够使硅藻等浮游生物勃发, 从而提高海洋输出生产力并降低大气CO2含量, 该理论促成了全球十余次中等尺度规模的海洋施加铁肥, 用以调控全球大气CO2含量的实验[9]。可见, 水体环境的变化, 是影响硅藻"固碳"能力的重要因素。
铝是地壳中含量最高的金属元素, 约占地壳总量的8.0%, 主要以铝硅酸盐的形式存在于岩石和矿物中[10]。近年来随着人类工业的飞速发展, 水体中, 尤其是海洋中的铝浓度逐渐增高[11]。其主要原因有: 1)含铝废水的大量排放, 使得铝被直接或间接地输入海洋; 2)工业化导致大气中二氧化碳浓度升高, 使得酸雨愈发频繁, 岩石和土壤所遭受的淋溶风化作用更加强烈, 更多的铝被释放到水体。加之海洋酸化, pH值降低, 使得可溶性铝浓度逐渐增加[12]。铝被认为对大多数水生生物具有一定毒性, 且其浓度越高, 毒性越强[13]。其生物毒害机制主要为:导致生物的呼吸障碍及对体内离子的调节性障碍[14]。因此, 随着海洋中铝浓度的升高, 海洋硅藻的生命活性及其生产力是否受到影响, 以及这些影响对其所参与的"碳生物泵"效率的作用机制, 尚不清楚。
针对上述问题, 本研究选取近海分布最广的硅藻之一——海链藻为研究对象。通过实验室培养实验中添加铝的方式, 模拟海洋环境中铝浓度的增加, 以分析硅藻生命活性及初级生产力对环境铝浓度升高的响应机制, 进而探明其对海链藻固碳能力的影响及机制。本研究中, 叶绿素a的含量作为衡量初级生产力的指标。这是由于硅藻的初级生产力可以根据硅藻叶绿素a的含量等因子进行评估[15]。
1 材料与方法 1.1 实验材料海链藻藻种采自中国南海惠州海域(考洲洋), 经实验室分离、纯化后保存于4℃冰箱中, 随后于培养箱中进行扩大培养。经多代无铝培养后所获海链藻藻种通过能量色散X射线光谱(EDS)进行线扫描元素分析(分析方法等详见1.6), 未发现铝赋存。
1.2 硅藻加铝培养海链藻在光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)中培养, 培养瓶为1 L锥形瓶, 海水培养液由人工海水(成分详见表 1)和f/2培养基(NaNO3、NaH2PO4、微量元素、维生素、Na2SiO3)组成。以AlCl3作为铝源, 使用去离子水配制0.001 mol/L AlCl3溶液加入上述硅藻培养液中, 分别获得铝浓度为10 nmol/L、20 nmol/L和50nmol/L的培养液。培养液的初始pH为8.41, 海链藻的培养温度为25℃, 明暗周期为12 h/12 h, 光照强度为100 μEm–2s–1, 培养时间为15天(海链藻的生长周期)。为避免外源铝污染, 本实验中所有使用的培养器皿均使用盐酸等进行了去微量金属清洗, 人工海水和培养液等也为无铝试剂配制[16]。
| 试剂 | 添加浓度(g/L) |
| NaCl | 20.758 |
| Na2SO4 | 3.477 |
| KCl | 0.587 |
| NaHCO3 | 0.170 |
| KBr | 0.084 5 |
| H3BO3 | 0.022 5 |
| NaF | 0.002 7 |
| MgCl2. 6H2O | 9.395 |
| CaCl2. 2H2O | 1.316 |
| SrCl2. 6H2O | 0.021 4 |
海链藻的初始细胞密度是4.74×104个/mL, 培养期间每天取样对细胞进行取样计数。具体步骤为:晃动锥形瓶, 使锥形瓶中的海链藻分布均匀, 从每个锥形瓶中分别取2.0 mL样品。于计数板中各加入20μL样品, 使用Count Star细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)对其进行计数, 并计算出海链藻的细胞密度。为保证数据准确性, 每次进行3次平行样品测试, 使用平均值进行计算。
1.4 叶绿素a提取及分光光度法测定叶绿素a浓度为保证较高精确度, 选在不同铝添加样品细胞密度的极大值日取样。分别取1.5 mL含海链藻的培养液置于离心管中, 并于高速离心机(德国Sartorius Sigma 1-14)中以15 000 rmp转速离心7 min, 将上层清液弃去, 所获固体为海链藻细胞。向上述海链藻细胞中加入1.0 mL无水乙醇(4℃)[17-18], 用旋涡混匀仪使细胞悬浮, 将装有悬浮液的离心管用铝箔纸封口并置于4℃冰箱保存24 h后, 于高速离心机中以15 000 rmp转速离心7 min。收集上清液并使用分光光度计(UV 2400型, 上海舜宇恒平科学仪器有限公司)在665 nm和649 nm处分别测定其吸收值A。叶绿素a的浓度计算公式为:
| $ {C_{{\rm{Chl - }}a}} = 13.7 \times {A_{665}} - 5.76 \times {A_{649}} $ | (1) |
式中: CChl-a为叶绿素a的浓度, 单位为μg/mL; A665为波长在665 nm处的吸光值; A649为波长在649 nm处的吸光值; 13.7和5.76为该分光光度方程的系数[18]。
1.5 处理海链藻及海链藻壳体样品待15天培养结束后, 离心, 用纯水反复洗涤, 并冷冻干燥, 以保留海链藻的完整组分。对部分海链藻样品进行化学处理, 在30%过氧化氢溶液中浸泡72 h[19], 至样品变白, 以去除其有机质, 随后用纯水洗涤。重复上述浸泡和洗涤过程, 直至硅藻所有有机组份完全去除(经碳含量测试评估, 碳含量低于仪器检测限)。将离心所获海链藻壳体干燥后保存待测。
1.6 透射电镜(TEM)、能量色散X射线光谱仪(EDS)及碳含量测试TEM及EDS测试:将硅藻及壳体样品与水混合, 然后摇晃使其分散, 将分散液滴在铜网上, 待表面干燥后, 用透射电子显微镜对单个硅藻进行定位以及用EDS进行元素分析, 以确定铝元素的赋存。TEM型号为: FIE Talos F200S (测试电压为200 kV, 测试电流为1 nA), 该仪器自带了一个EDS系统, EDS型号为: FEI Super-X。
碳含量测试:取上述硅藻样品约2.00 mg, 放入6×12 mm的锡舟中, 用Vario ELⅢ元素分析仪对海链藻进行碳元素分析, 每个样品进行三次平行测试, 取平均值用于分析。仪器检测限40 ppm。
1.7 数据分析方法采用了单因素方差分析(ANOVA), 以P值0.05作为衡量显著性差异的标准, 用SPSS和Origin 8.0对所得数据进行处理和作图。
2 结果与讨论 2.1 富铝环境对海链藻生长的影响为评估环境铝浓度对海链藻分裂增殖的影响, 本研究对不同初始铝浓度(对照组、10 nmol/L添加组、20 nmol/L添加组和50 nmol/L添加组)培养液中所获海链藻细胞密度进行了分析。计数仪测试结果表明, 海链藻前期增长速度极快, 到第5天时, 增长速度放缓进入稳定期, 其藻细胞密度于第8天达到极大值(图 1)。随后, 在第12天左右, 其细胞密度逐渐下降, 这是由于部分硅藻达到生命周期后不再分裂, 并有部分硅藻死亡所致。对于富铝培养液中的硅藻, 在不同铝添加组中, 其表现出不同的分裂生殖特征。在海链藻的指数生长期内, 加铝组的细胞分裂速度相较于对照组均有所升高。需要注意的是, 对照组和铝添加组中的海链藻细胞密度极大值并无显著性差异(P > 0.05), 这表明在上述初始铝浓度下, 添加铝对硅藻生长、生殖所产生的生物总量影响较小, 这也表明上述铝添加浓度(10、20和50 nmol/L)对海链藻的生长无明显毒害作用。
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| 图 1 添加/未添加铝培养液中不同培养时间的海链藻细胞密度 Fig. 1 Cell density of Thalassiosira weissflogii at different culture time in medium with or without the addition of aluminum |
本研究通过测定不同铝添加组下的海链藻的叶绿素a含量, 用以评估加铝对其初级生产力的影响。使用低温-乙醇法提取硅藻液中的叶绿素a, 并经紫外分光光度计测得其吸光值, 通过分光光度方程计算得到叶绿素a浓度。结果表明, 铝添加组和对照组中的叶绿素a浓度并无显著性差异(P > 0.05)。然而, 考虑到测试所选取的海链藻溶液中, 海链藻的细胞密度不同, 我们对数据进行了标化处理, 以获得对照组和不同铝添加组中单个海链藻细胞叶绿素a的含量(图 2)。结果表明, 随着添加铝初始浓度的增加, 单位海链藻的叶绿素a含量先升高后降低, 其中20 nmol/L添加组的单位海链藻叶绿素a含量显著高于对照组的值(P < 0.05)。值得注意的是, 即使初始铝浓度高达50 nmol/L, 单位海链藻的叶绿素a含量也高于对照组的样品值。这表明, 一定浓度(≤50 nmol/L)的铝可有效提高海链藻的初级生产力, 而在上述几组不同铝添加组中, 20 nmol/L添加组具有最好的效果。
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| 图 2 不同铝浓度培养下海链藻的叶绿素a浓度以及单个海链藻细胞的叶绿素a含量 Fig. 2 Chlorophyll a concentration of Thalassiosira weissflogii cultured with different aluminum concentrations and content of chlorophyll a in a single cell of Thalassiosira weissflogii |
死亡的硅藻通过"携带"自身合成的有机质穿过水-沉积层界面进入埋深, 实现"固碳"作用, 并成为"生物泵"的重要环节[4]。为评估富铝环境对海链藻"固碳"能力的影响, 本实验对培养所获硅藻的含碳量进行了分析:待15天培养结束后, 通过元素分析的方法, 分别对对照组、10 nmol/L添加组、20 nmol/L添加组及50 nmol/L添加组所获硅藻样品的含碳量进行测定。结果表明, 在20 nmol/L添加组中培养的海链藻, 含碳量显著高于另外三组(P＜0.05)(图 3)。由于本测试针对的是硅藻自身所含碳的评估, 因此该结果表明, 在铝浓度为20 nmol/L时, 硅藻固碳能力显著提高。
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| 图 3 不同铝浓度下培养所获海链藻的含碳量 Fig. 3 Carbon content of Thalassiosira weissflogii cultured under different aluminum concentrations |
前人在开展铝在海洋中的生物地球化学循环研究时曾发现:硅藻可以通过生物捕获作用由环境中获取铝[20]。进一步的研究发现, 海水中铝的浓度受控于硅藻, 基于此, 研究者提出了生物驱动下的海洋中硅、铝共循环观点[21-23]。通过对硅藻中铝进行探测发现, 铝很有可能赋存在硅藻壳体结构中[24-27]。基于培养实验和沉积物中硅藻壳体的元素分析等, Koning等认为壳体中铝的赋存量(按照铝硅摩尔比计)为10–4~10–3[27]。然而, 由于受到硅藻壳体提纯困难及原位微区分析技术缺乏的影响, 铝在硅藻壳体结构中的赋存量仍不明确[28-30]。
为探明富铝环境中铝的生物迁移机制, 解决上述问题, 本研究利用微区探测的方法, 在微-纳米尺度对铝在海链藻中的赋存特征进行了探索。选取20 nmol/L添加组中所获海链藻和壳体为研究对象, 使用TEM进行观测, 并结合EDS对硅藻和壳体中的Si和Al分布和含量等进行了分析。结果表明, 铝赋存在海链藻中(图 4a和图 4c), 且在硅藻壳体中有较均匀的分布(图 4d和图 4f)。EDS线扫描结果表明, 20 nmol/L添加组中所获海链藻的铝含量, 以铝硅摩尔比计, 为0.055;而其壳体的铝硅摩尔比为0.009。可见, 壳体中的确赋存有铝, 但其含量较低。TEM-EDS微观分析手段可为铝的赋存及分布特征提供直接可视化的证据。
上述结果表明, 富铝培养液中的铝可通过硅藻的生物作用进入海链藻体内, 并作为骨架元素赋存于其硅质骨架中。该结果进一步验证了前人的研究[20-30], 为硅藻驱动的铝海洋生物地球化学循环提供了直接证据。
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| 图 4 海链藻TEM图 Fig. 4 Transmission electron microscopy image of Thalassiosira weissflogii 注: a:海链藻高角环形暗场(HAADF)像; b:海链藻硅分布图; c:海链藻铝分布图; d:海链藻壳体TEM-HAADF像; e:海链藻壳体硅分布图; f:海链藻壳体铝分布图 |
本研究通过实验室富铝培养, 模拟海洋环境中铝浓度(≤50 nmol/L)对海链藻的活性、生产力及其"固碳"性的影响及机制。结果表明, 在上述浓度下, 1)铝未对海链藻产生毒害; 2)铝可加快海链藻指数生长期的分裂; 3)铝提升了海链藻的初级生产力, 且在铝浓度为20 nmol/L时, 其效果最佳; 4)在铝浓度≤20 nmol/L时, 海链藻的"固碳"能力有所提高, 但当铝浓度达到50 nmol/L时, "固碳"能力降低。另外, 本研究发现, 铝可以被海链藻主动捕获, 并用于构建其骨架。上述结果表明, 在海链藻生长活动和其所参与的元素生物地球化学循环过程中, 水体中铝的浓度应被作为一个重要的环境变量加以考虑。
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