2021, Vol. 45
文章信息
- 张莺脐, 张羡宇, 郭庆芳, 许文豪, 马峥, 石硕, 张倩, 刘鹰. 2021.
- ZHANG Ying-qi, ZHANG Xian-yu, GUO Qing-fang, XU Wen-hao, MA Zheng, SHI Shuo, ZHANG Qian, LIU Ying. 2021.
- 氟苯尼考对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)早期发育的影响
- Effects of florfenicol on the development of Crassostrea gigas during the early developmental stage
- 海洋科学, 45(1): 100-109
- Marina Sciences, 45(1): 100-109.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20200629002
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文章历史
- 收稿日期：2020-06-29
- 修回日期：2020-08-01
2. 设施渔业教育部重点实验室, 大连海洋大学, 辽宁 大连 116023
2. Key Laboratory of Environment Controlled Aquaculture, Ministry of Education, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China
随着抗生素的大量生产和广泛使用, 抗生素可通过多种途径进入环境, 包括制药和医疗废水的排放、畜牧和水产养殖过程中疫病的治疗和预防用药等[1]。因部分抗生素具有生物利用性低及不易降解的特性, 导致其常在多种类型的环境介质中被检测到[2-4]。水环境中残留的抗生素会对水生动物产生较大的影响, 包括生长发育异常、繁殖功能紊乱、生理功能和氧化应激水平变化等[5-6]。环境浓度的磺胺嘧啶暴露斑马鱼胚胎(Danio rerio)96 h后, 会引起胚胎畸形率增多、心跳速率加快、自主运动增强等现象[7]。利用不同浓度(0、5、10 mg/L)的恩诺沙星浸泡眼斑双锯鱼幼鱼(Amphiprion ocellaris)发现, >5 mg/L的恩诺沙星浸泡24 h后, 对眼斑双锯鱼幼鱼的消化酶、免疫酶活性和氧化产物含量产生显著影响[8]。
氟苯尼考(Florfenicol, FFC)属于联合国粮农组织(FAO)批准可用于水产养殖的抗生素之一。作为动物专用的氯霉素类广谱抗生素[9], 氟苯尼考对气单孢菌(Aeromonas)、链球菌(Streptococcus)、弧菌(Vibrio)和爱德华氏菌(Edwardsiella)等病原菌引起的鱼类疾病有明显的防治效果[10-11], 其理化性质稳定、不易被水解和生物降解, 大量连续地向水环境中排放导致其在水生环境中呈“假”持久性存在, 常在多种水域生态环境中被检出。有调查显示, 我国江苏省某规模化水产养殖场和丹麦某渔场附近水域中氟苯尼考的残留量分别为937.21 ng/L和8 ng/L[12-13]。在沿海水域、沉积物及生物体内均检测到不同浓度的氟苯尼考残留[15], 在大连市的大连湾养殖场周边的水域检测到氟苯尼考残留浓度高达11 mg/L[14]。对长江下游的环太湖流域的养殖区域进行调查发现, 该流域内的养殖生物体内几乎均检测出氟苯尼考残留[16]。与早期的氯霉素类药物相比, 氟苯尼考不会引起再生障碍性贫血, 但能够可逆性地抑制红细胞生成, 且具有胚胎毒性[17]。氟苯尼考暴露会抑制虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)体内吞噬作用、淋巴细胞增殖等过程[18], 对南美白对虾(Penaeus vanname)无节幼虫有较高的毒性[19]。
太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)是我国重要的海水养殖经济贝类之一, 因其生长速度快、适应能力强、营养价值高等特点, 在我国乃至全球大量培育, 具有重要的经济价值[20]。水生生物的早期发育阶段对外源性污染物具有较高的敏感性[21-22], 被认为是指示各种污染物毒性的前哨生物[23]。低浓度的抗生素残留对成体生物未造成明显毒性作用时, 却可能会引起胚胎和幼虫的中毒反应[24]。
为探究养殖水环境中氟苯尼考残留对水生动物早期生命阶段的影响, 本研究以太平洋牡蛎受精卵为研究对象, 分析不同浓度的氟苯尼考(0.1、1.0和10 mg/L)对牡蛎幼虫生长发育、运动能力、免疫抗性等方面的影响, 进一步探讨氟苯尼考残留的潜在风险及其使用的安全浓度范围。本研究将为水产养殖过程中抗生素的科学合理使用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 牡蛎体外人工授精太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)于2019年6月购自大连市长兴海鲜市场, 低温运输至实验室, 于海水中暂养一天, 控制水温为(24 ± 1)℃。挑选健康性腺饱满的牡蛎用于实验, 使用无菌解剖针挑取牡蛎性腺进行涂片, 在光学显微镜(745T/SMZ1000, Nikon)下观察, 通过鉴定生殖细胞种类确定牡蛎性别, 选择生殖细胞活力较好的个体用于后续体外授精。
牡蛎亲本通过解剖取卵、人工授精的方法进行繁殖。取5只雌性牡蛎和3只雄性牡蛎, 分别剥离牡蛎性腺, 使其通过400目的筛绢以去除多余的生殖腺组织杂质, 再使用200目筛绢分别收集卵母细胞和精子, 于24℃海水中活化20 min, 使卵母细胞形体趋于饱满, 激活精子。将卵母细胞与精子以1︰10的比例混合受精, 保持较暗的光照条件, 不定时搅动水体, 受精15 min后, 利用光学显微镜观察, 确保受精成功。
1.2 实验设计太平洋牡蛎受精卵胚胎毒性的测定参考Quiniou等人[25]方法。取约300个/mL受精卵于220×150×180 mm的玻璃缸中孵化, 加入3 L相应浓度的氟苯尼考暴露溶液。受精卵于黑暗条件下培养24 h, 水温控制在(24 ± 0.5)℃, 持续微量曝气。参考氟苯尼考在环境中检出的浓度以及养殖过程中的投喂浓度[26], 设置氟苯尼考终浓度为0、0.1、1和10 mg/L, 每组设置三个重复。从牡蛎受精卵开始暴露24 h后, 收集样品, 进行下一步分析。
利用高效液相色谱仪(HPLC, SPD-20A, 岛津)测定10 mg/L氟苯尼考暴露液的实际浓度。流动相为乙腈(A)和超纯水(B), 流动相比例为40︰60(v︰v), 保留时间为4.2 min。检测暴露液中氟苯尼考实际浓度约为标称浓度的96.2%, 与标称浓度差异性较小, 因此将使用标称浓度进行实验计算。
1.3 水体中细菌总数的测定测定不同浓度的氟苯尼考暴露24 h后养殖水体中的细菌总数[27]。取10 mL暴露组水样, 进行等比例稀释, 制成1︰1、1︰10、1︰100、1︰1 000的样品匀液。吸取1 mL样品匀液于琼脂培养平板中, 涂布均匀, 每个稀释度的样品匀液做三个平行。在37℃恒温培养箱内培养24 h后对菌落进行计数, 选取平板菌落个数在30~300个之间的平板进行计数, 并计算不同浓度处理组的菌落平均值。
1.4 牡蛎幼虫的生长发育氟苯尼考暴露24 h后从各实验组随机收集1 mL暴露溶液, 置于细胞培养皿中于4倍光学显微镜(N-10E, Novel)下统计牡蛎幼虫存活量。从各实验组随机挑选20只D型幼虫, 加入2%的戊二醛进行固定, 在显微镜下观察牡蛎幼虫形态, 并利用NIS-Elements图像软件统计幼虫的壳高、壳宽。
1.5 牡蛎幼虫运动行为检测对氟苯尼考暴露24 h后牡蛎D型幼虫的运动行为进行追踪分析。各实验组随机选取15只牡蛎幼虫置于48孔微板中, 适应5 min后, 使用体视显微镜(P-DSL32, Nikon)于16倍镜下进行垂直拍摄5 min。利用视频追踪系统(EthoVision XT, Nodus)对牡蛎幼虫运动行为轨迹进行分析, 计算幼虫游泳距离、移动速度。
1.6 荧光定量PCR基因表达取氟苯尼考暴露24 h后的牡蛎D型幼虫置于液氮中冷冻, 于–80℃保存。使用RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取牡蛎幼虫总RNA, 利用超微量核酸蛋白检测仪(IN0311, Monad)检查RNA浓度(260 nm)和纯度(260/280 nm)。使用Evo M-MLV反转录试剂盒(AG11705, 湖南艾科瑞生物工程有限公司)将RNA反转录为cDNA模板。使用TransStart TOP Green qPCR SuperMix试剂盒(Transgen Biotech)进行荧光定量PCR(Lightcycle 96, Roche)。选择与牡蛎幼虫生长发育相关的基因, ILPR、Cg-Tyr、CYP356A1、Ferritin、HSP70、Cg-Tal和Caspase7, 根据太平洋牡蛎幼虫基因组设计引物, 序列如表 1所示[28]。qPCR反应参数设置为: 94℃预变性30 s, 94℃变性30 s, 退火30 s, 72℃延伸60 s, 共30个循环, 循环完成后72℃延伸5 min。各引物序列及优化的退火温度如表 1所示。选择核糖体蛋白L7(RL7)为管家基因用于标准化其他目标基因的表达水平, 该基因在各处理组间未显示差异性, qRT-PCR数据采用2–ΔΔCt法进行分析。每个样品测量进行三次检测。
| 基因名称 | 生物功能 | 引物序列(F:正向R:反向) | 退火温度/℃ | 扩增子/bp | 基因序列号 |
| Insulin-Like peptide receptor (ILPR) | 发育 | F: TCGTCCATATCCTCATCACCCTCCT R: GGACCCATCGTTCGCTAACAAGTCATAC |
60 | 96 | LOC105348544 |
| Cg-Tyr | 发育 | F: CCGATGTCACATTGCCGTATTG R: GACCATCTCCGTTACCAAGGAA |
60 | 105 | KC878467.1 |
| CYP356A1 | 生物转化 | F: TCACAAGTTGGTGGATACGATGTC R: CGAGATAGCGAAGTGGGTCAAA |
60 | 121 | EF645271 |
| Ferritin | 发育 | F: CAACTGAGTGATGTGGTCCGATA R: CGATTTCCTTGAGACCCACTACTT |
60 | 76 | CAD92096.1 |
| HSP70 | 应激反应 | F: TGATGCCAACGGTATCCTGAA R: ATCCTCTCACGCTGCTTCTC |
60 | 146 | LOC117686547 |
| Cg-Tal | 免疫系统 | F: CGTGTTGTGTCCGAGTGTATGTA R: GCTGTCGTCGCATTCTTTCATC | 60 | 103 | LOC105336631 |
| Caspase7 | 细胞凋亡 | F: GCTGTCTGAGGTCCTGATGAA R: GGAGGTGTTAGACTGGAACTTGT |
60 | 103 | LOC109617112 |
| RL7 | 翻译 | F: GGTTGTACTTCCTTCTCCATCCACCA R: GACCCAACTTCAAGTATGCTGCCAAC |
60 | 84 | CAD89885.1 |
使用SPSS18.0统计软件和Origin Pro软件对测定结果进行统计分析, 实验数据采用平均值±标准误(Mean ± SE)表示。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对对照组和处理组间进行统计学差异分析, 采用LSD检验或Duncan法进行事后检验。当P＜0.05时, 认为具有显著性差异, 当P＜0.01时, 认为具有极显著性差异。对氟苯尼考暴露浓度、牡蛎幼虫生存量和水体细菌总数进行相关性分析, 选择分别选择线性回归(R2)和皮尔逊相关系数作为计算类型, 利用相关系数r的大小判断变量间相关关系的密切程度。
2 实验结果 2.1 氟苯尼考对牡蛎幼虫的胚胎毒性不同浓度氟苯尼考暴露24 h对牡蛎幼虫存活量的影响如图 1所示。随着氟苯尼考暴露浓度的增加, 牡蛎幼虫的存活量呈上升趋势, 在10 mg/L的FFC实验组中, 牡蛎幼虫的存活量达到最高, 约为(122.9± 5.3)个/mL, 显著高于对照组和0.1 mg/L氟苯尼考浓度组(109.9±3.8和101.1±3.6个/mL), 与1 mg/L氟苯尼考浓度组中的存活量无显著性差异。
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| 图 1 氟苯尼考对牡蛎幼虫存活量的影响 Fig. 1 Effects of florfenicol on Crassostrea gigas survival 注:不同上标字母表示处理组间具有差异性显著(P＜0.05)。 |
进一步对氟苯尼考暴露24 h后各实验组养殖水体中的细菌总数进行检测。实验结果显示, 对照组水体中细菌总数为(214.2±35.3) CFU/mL, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考的实验组水体内细菌总数分别为(304.2±58.7) CFU/mL、(296.8±50.4) CFU/mL, 各实验组与对照组水体中的细菌总数并无显著性差异。
对氟苯尼考暴露浓度、牡蛎幼虫24 h存活量、水体细菌总数之间的相关性进行分析(表 2)。统计结果显示, 氟苯尼考暴露浓度与牡蛎幼虫24 h存活量、水体细菌总数间具有线性关系, 且水体细菌总数与氟苯尼考暴露浓度、幼虫存活量之间显著性相关(0.5＜| r |≤0.8), 氟苯尼考暴露浓度与幼虫存活量间呈高度相关性(0.8＜|r|≤1)。
| y | x | a | b | R2 | r |
| 幼虫存活量 | 氟苯尼考浓度 | 1.569 7 | 107.59 | 0.713 9 | 0.845 |
| 水体细菌总数 | 氟苯尼考浓度 | 5.114 2 | 250.4 | 0.327 8 | 0.573 |
| 幼虫存活量 | 水体细菌总数 | 0.135 2 | 76.182 | 0.422 2 | 0.650 |
太平洋牡蛎受精卵在培养24 h后, 进入D型幼虫期, 开始早期外壳的发育。与对照组相比, 高浓度氟苯尼考(≥1 mg/L)暴露24 h后, 牡蛎幼虫的大小显著性降低(图 2)。在1 mg/L、10 mg/L氟苯尼考暴露后, D型幼虫的壳高显著降低(P＜0.05), 壳高的均值分别为(62.95± 0.19) μm、(52.83± 0.93) μm, 与对照组相比, 平均壳高分别减少5.50%、20.69%。不同浓度的氟苯尼考暴露24 h后, D型幼虫壳宽的变化程度较小, 其中10 mg/L氟苯尼考暴露组对壳宽(48.49 ± 0.76) μm的抑制作用显著高于其他实验组(P＜0.05), 与对照组相比降低16.55%。
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| 图 2 氟苯尼考对牡蛎幼虫生长的影响 Fig. 2 Effects of florfenicol on Crassostrea gigas growth 注:不同小写字母表示不同处理组间壳宽具有差异性显著(P＜0.05), 不同大写字母表示不同处理组间壳高具有差异性显著(P＜0.05)。 |
氟苯尼考对牡蛎幼虫自主运动行为的影响如图 3所示。不同浓度的氟苯尼考暴露对D型幼虫的移动速度均未产生明显的影响, 但在1 mg/L氟苯尼考的暴露后, D型幼虫的移动速度呈上升趋势(图 3a)。氟苯尼考对D型幼虫移动距离的影响如图 3b所示, 低浓度氟苯尼考(＜1 mg/L)暴露24 h后, 幼虫的移动距离并无明显变化, 在1 mg/L浓度组中D型幼虫的移动距离显著增加(P＜0.05), 相比于对照组(5.80 ± 0.53) cm, 1 mg/L组的移动距离增加了53.20%。10 mg/L氟苯尼考暴露后, 对牡蛎幼虫的移动距离、移动速度并未产生明显影响。
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| 图 3 氟苯尼考对牡蛎幼虫移动行为的影响 Fig. 3 Effects of florfenicol on the motor behavior in Crassostrea gigas 注:不同上标字母表示不同处理组间差异性显著(P＜0.05) |
ILPR、Cg-Tyr、CYP356A1和Ferritin基因参与牡蛎的细胞发育和壳的生长过程。如图 4所示, ILPR、Cg-Tyr基因的相对表达量出现明显变化(P＜0.05) (图 4a, b), 而CYP356A1和Ferritin的转录水平与对照组相似(图 4c, d)。相较于1 mg/L浓度组, 在0.1 mg/L氟苯尼考暴露下, 牡蛎幼虫中ILPR的相对表达量显著增加1.13倍, 高于对照组、10 mg/L氟苯尼考浓度组, 但无显著性差异。各实验组中牡蛎幼虫Cg-Tyr基因的表达水平与对照组相似, 但1 mg/L浓度组中基因的表达水平显著低于0.1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考浓度组(P＜0.05), 分别降低为0.47和0.38倍。CYP356A1基因和Ferritin的基因表达水平随着氟苯尼考暴露浓度的增加而下调, 但无显著性差异。CYP356A1的表达水平在10 mg/L氟苯尼考暴露组出现上调现象, 高于其他实验组。
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| 图 4 氟苯尼考对牡蛎幼虫生长发育相关基因表达的影响 Fig. 4 Effects of florfenicol on the mRNA expression levels of growth and development-related genes in Crassostrea gigas 注:不同上标字母表示不同处理组间具有显著性差异(P＜0.05)。 |
HSP70、Cg-Tal和Caspase7基因与牡蛎的免疫功能相关。如图 5所示, 氟苯尼考暴露组中HSP70基因表达水平与对照组相比呈升高趋势, 但无显著性差异。牡蛎幼虫体内Cg-Tal基因表达水平随着氟苯尼考暴露浓度的增加而增加, 呈剂量依赖效应。与对照组相比, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考暴露组中Cg-Tal基因表达水平显著性升高, 分别增加1.41和0.90倍。低浓度氟苯尼考(＜1 mg/L)对Caspase7基因表达水平无明显影响, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考暴露组中Caspase7表达水平呈下降趋势。
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| 图 5 氟苯尼考对牡蛎幼虫免疫功能相关基因表达的影响 Fig. 5 Effects of florfenicol on the mRNA expressions of immune function-related genes in Crassostrea gigas 注:不同上标字母表示不同处理组间具有显著性差异(P＜0.05)。 |
抗生素广泛应用于水生动物疾病的预防和治疗, 大量未被吸收利用的抗生素通过多种途径最终进入到水环境介质中。抗生素的残留不仅会引起耐药性的产生, 还会打破生态平衡, 影响生物多样性等。水生动植物对抗生素的富集现象会导致抗生素沿食物链进行传递并放大, 对人类健康造成影响。大量研究表明, 高浓度氟苯尼考暴露对微藻[29-31]、甲壳类水生动物[32]等的生长产生显著的抑制作用, 但较低浓度的氟苯尼考会对微藻生长产生刺激作用。已有研究利用牡蛎探究农药等污染物的毒性[33-34], 而关于抗生素对双壳类动物毒性作用的研究较少。本研究结果显示, 牡蛎幼虫的存活量随着氟苯尼考暴露浓度的增加而增大。然而, 高浓度的氟苯尼考(>1 mg/L)暴露对牡蛎幼虫的生长发育产生显著的抑制作用, 牡蛎D型幼虫的壳高和壳宽均显著降(P＜0.05)。牡蛎幼虫早期发育阶段对外源性化学污染物较为敏感, 与壳发育相关的生理、生化功能易受到影响, 进而影响牡蛎幼虫后期的附着变态发育等过程。
在水产动物人工育苗过程中, 水体中的细菌含量与养殖生物胚胎能否健康地生长和发育密切相关[35]。通常认为, 添加抗生素会抑制细菌病毒的繁殖, 促进养殖生物的生长。本研究中, 不同浓度的氟苯尼考暴露牡蛎幼虫24 h后, 各处理组的养殖水体中细菌总数无显著性差异。这可能由于牡蛎幼虫培育时间较短, 水体中细菌总数含量较低有关。本研究培育水体中细菌总数比其他鱼类、贝类养殖水体中细菌总数低2~3个数量级[36-37]。根据氟苯尼考暴露浓度、牡蛎幼虫存活量及水体细菌总数之间的相关性分析结果提示水体中氟苯尼考的添加会对水体中细菌的总数产生影响, 但并不是造成牡蛎幼虫发育、生长状态不同的主要原因, 可能还与抗生素种类、作用方式、暴露时间有关。
行为反应是水生动物对环境适应的直接结果, 行为学参数的研究是识别和评估环境压力的有效工具[38]。牡蛎幼虫的泳动能力是贝类浮游幼虫阶段重要的行为表现。不同浓度的氟苯尼考暴露24 h均未引起牡蛎幼虫移动速度的显著性变化, 牡蛎幼虫的移动距离随着暴露浓度的增加呈倒“U”型, Guo等[39]研究发现氟苯尼考暴露会影响牙鲆初孵仔鱼(Paralichthys olivaceus)的自发性游泳能力, 与本研究结果相似。低浓度的氟苯尼考对牡蛎幼虫的移动距离无明显的影响, 1 mg/L氟苯尼考暴露会显著增加牡蛎幼虫的移动距离, 可能由于氟苯尼考会引起牡蛎幼虫的运动神经兴奋, 导致其静止的时间比例降低。而高浓度的氟苯尼考(10 mg/L)可能会对牡蛎幼虫产生神经毒性, 导致其自由泳动能力下降。Gamain等人[40]发现铜和S-异丙甲草胺暴露后, 牡蛎幼虫直线型运动轨迹与对照组无显著差异, 但圆形轨迹的百分比显著增加, 提示10 mg/L氟苯尼考暴露对牡蛎幼虫的移动能力产生胁迫, 可能导致其游泳多呈圆形轨迹, 使得移动距离出现下降趋势。
双壳贝类的早期发育时期对各种环境压力较为敏感, 不仅表现在形态、生理功能改变, 同时对细胞中基因和蛋白质水平产生影响。类胰岛素生长因子系统在无脊椎动物生长、发育、繁殖等过程中起着重要作用。胰岛素多肽受体基因(ILPR)在贝类早期发育过程中表达量较高, 负责向细胞内传递不同配体的信号, 使贝类发育顺利进行[41]。本研究中随着氟苯尼考暴露浓度的升高ILPR表达水平呈先升高后降低趋势, 可能是由于低浓度的氟苯尼考会对牡蛎幼虫产生的毒性兴奋效应, 激活ILPR表达水平升高, 而高浓度的氟苯尼考暴露抑制ILPR表达, 影响细胞内配体的信号传递, 进而可能会影响牡蛎幼虫的生长发育。Cg-Tyr基因与软体动物的非钙化壳的形成有密切的关系, 参与贝壳角质层的形成[42], 在1 mg/L氟苯尼考的暴露下, Cg-Tyr基因水平出现显著性下降(P＜0.05), 提示氟苯尼考暴露可能会抑制牡蛎幼虫壳的生成与钙化, 这与前文D型幼虫的生长结果相一致。CYP356A1基因参与细胞生长、细胞内稳态调节和细胞解毒等过程, 10 mg/L氟苯尼考的暴露引起CYP356A1基因表达水平的上调, 可能是氟苯尼考参与了细胞内催化氧化反应, 促进官能团与极性分子结合, 使得其水溶性增加进而促进排泄, 对氟苯尼考起到解毒的功能[43]。牡蛎幼虫内铁蛋白Ferritin参与牡蛎幼虫纤毛功能的发育, 氟苯尼考暴露降低了Ferritin基因的表达水平, 进而影响牡蛎幼虫的自主运动能力。
牡蛎在面对生物或非生物压力时, 可催化细胞内羟基自由基的形成, 细胞受到氧化胁迫的影响。在氟苯尼考的暴露下, 牡蛎幼虫的Caspase7基因、HSP70免疫功能基因变化较小。HSP70参与保护细胞免受氧化应激[44]。随着氟苯尼考暴露浓度的增加, HSP70基因相对表达量出现上升趋势, 提示其可能参与机体抵御氟苯尼考暴露引起的氧化胁迫。Cg-Tal在牡蛎血细胞内特异性表达, 与早期造血细胞的形成相关, 在诱导造血活性的双壳软体动物的免疫系统中起作用。Auffret等[45]人研究发现, 当多环芳烃暴露浓度超过100 μg/L时, 欧洲扇贝(Pecten maximus)血细胞数量增加, 这是面对环境胁迫时一种常见的反应。本研究中Cg-Tal基因表达水平随着氟苯尼考暴露浓度的升高而显著上升, 说明Cg-Tal基因积极参与氟苯尼考暴露引起的机体免疫排斥反应。Caspase家族在细胞凋亡途径中对凋亡信号的诱导、转导和增殖起着重要的作用, 通过对Caspase靶蛋白的水解, 导致程序性细胞死亡[46]。随着暴露浓度的升高, Caspase7相对表达量无显著性变化, 提示氟苯尼考暴露虽然会对牡蛎幼虫产生氧化胁迫作用但不会引起牡蛎幼虫发生细胞凋亡现象。
综上, 本研究结果提示处理浓度的氟苯尼考虽然会提高牡蛎幼虫的存活量, 但对牡蛎幼虫的生长发育产生了显著的抑制作用, 随着暴露时间的延长, 可能会导致牡蛎幼虫外壳的畸形与钙化, 影响牡蛎幼虫后期变态发育及附着。此外, 高浓度的氟苯尼考(10 mg/L)暴露会造成纤毛功能的损伤, 影响牡蛎幼虫的自主运动能力, 可能会对其摄食产生影响。因此, 在养殖育苗过程中, 需密切注意养殖水体的水质状态, 提高对养殖水体中抗生素残留危害的认识及监测, 进一步加强养殖水体水质的净化。
4 结论本实验以太平洋牡蛎幼虫为实验对象, 研究不同浓度的氟苯尼考暴露24 h后对牡蛎幼虫早期生命阶段生长发育的影响, 探讨氟苯尼考对牡蛎幼虫的作用机理, 得到以下结论:
1) 高浓度氟苯尼考(10 mg/L)暴露显著增加牡蛎幼虫的存活量。低浓度的氟苯尼考暴露(0.1 mg/L)对牡蛎幼虫的大小未产生显著性影响, 当暴露浓度高于1 mg/L时, 牡蛎幼虫的壳高、壳宽显著降低。
2) 氟苯尼考暴露对牡蛎D型幼虫的移动速度影响较小, 明显影响牡蛎幼虫的移动距离。1 mg/L氟苯尼考的暴露后, D型幼虫的移动速度有上升的趋势, 移动距离显著性增加(P＜0.05)。
3) 氟苯尼考通过影响牡蛎幼虫生长发育相关基因ILPR、Cg-Tyr和Ferritin的表达, 进而对牡蛎幼虫的生长发育、运动能力等产生影响;
4) 氟苯尼考暴露会对牡蛎幼虫产生氧化胁迫作用, HSP70和Cg-Tal基因参与保护细胞免受氟苯尼考引起的氧化应激损伤。
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