2022, Vol. 46
文章信息
- 贾慧霞, 张华, 张成龙, 何毛贤, 刘文广. 2022.
- JIA Hui-xia, ZHANG Hua, ZHANG Cheng-long, HE Mao-xian, LIU Wen-guang. 2022.
- 法螺G型溶菌酶重组蛋白的原核表达及抑菌活性探究
- G-type lysozyme prokaryotic expression and antibacterial activity of the Charonia tritonis recombinant protein
- 海洋科学, 46(10): 32-42
- Marina Sciences, 46(10): 32-42.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20210926001
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文章历史
- 收稿日期：2021-09-26
- 修回日期：2021-11-22
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 南方海洋科学与工程广东省实验室(广州), 广东 广州 511458;
4. 三沙市海洋和渔业局, 海南 三沙 573199
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou 511458, China;
4. Sansha Marine and Fisheries Bureau, Sansha 573199, China
溶菌酶是生物体内重要的非特异性免疫因子, 与抵御细菌感染的免疫功能密切相关[1]。在水产动物抵抗外来病原细菌、真菌或病毒入侵时, 溶菌酶能增强其他免疫因子的抗菌活性, 并协同抵制病原菌的入侵[2-3]。溶菌酶是一种天然的碱性抗菌蛋白, 通过水解肽聚糖β-1, 4糖苷键发挥溶菌功能[4-5]。根据来源、免疫特性、结构及催化特征的不同, 动物体内的溶菌酶主要分为G型、C型和I型, 广泛存在于免疫器官和细胞中[6]。C型溶菌酶主要存在于脊椎动物中; I型溶菌酶主要分布在无脊椎动物中; G型溶菌酶最早因从鹅蛋清(goose egg-white)中分离、鉴定而得名, 主要存在于鸟类、鱼类及无脊椎的双壳软体动物中[7]。近年来, 关于水生动物G型溶菌酶的报道日渐增多, 如长牡蛎[8](Crassostrea gigas)、栉孔扇贝[9](Chlamys farreri)、紫贻贝[10](Mytilus edulislinnaeus)和膨腹海马[7](Hippocampus abdominalis)等中发现G型溶菌酶在不同组织中发挥一定的免疫防御作用。然而, 其在腹足纲软体动物法螺(Charonia tritonis)中的作用还未见有报道。
法螺(Charonia tritonis)隶属于嵌线螺科(Ranellidae)、法螺属[11](Charonia)。法螺的壳有美丽的花纹, 具有重要的经济价值[12-13]。法螺是珊瑚礁敌害生物——长棘海星的天然捕食者, 是珊瑚礁的卫士, 在维持珊瑚礁生态系统平衡中具有重要作用。近年来, 法螺自然资源由于环境污染和过度捕捞被严重破坏[14-15], 在中国南海海域面临灭绝的危险, 被列为国家二级保护动物[16], 因此亟需开展相关研究。在前期工作中, 团队在陆上水泥池对中法螺进行了养殖实验, 在2020年6—7月, 法螺发生病害, 死亡严重。在感染初期, 我们对法螺足、外套膜、腮等组织进行了细菌检测, 结果鉴定出的病原菌主要包括弧菌和葡萄球菌。由此, 我们推测法螺在饲养过程中出现的病害可能是细菌感染引起的。因此, 本研究通过分析法螺溶菌酶基因的结构, 鉴定其为G型溶菌酶。同时, 应用实时荧光定量PCR分析CtG.lys在法螺不同组织中的表达情况, 并通过构建原核表达载体诱导表达法螺G型溶菌酶重组蛋白、分析重组蛋白的抑菌功能, 为认识法螺的免疫机理和病害防控提供资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料法螺组织: 法螺收集于南海海域, 暂养在广东省雷州市养殖基地。取3只大小一致、生长状况良好个体, 剖取其外套膜、足、触手、长鼻、唾液腺、肠及肝脏组织立即于液氮速冻, 然后保存于–80 ℃超低温冰箱。
菌株, 质粒和试剂: 大肠杆菌E. coli DH5α和pGEX-4T-1载体由本实验室保存; 大肠杆菌(BL21)购自北京全式金生物技术有限公司; 藤黄微球菌Micrococcus luteus、肠炎沙门氏菌Salmonella enterica、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、施罗氏弧菌Vibrio shilonii由中国科学院南海海洋研究所宋永相老师惠赠; 金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus由中国科学院南海海洋研究所向志明老师惠赠。总RNA提取试剂盒购自Magen公司; 反转录试剂盒购自Toyobo公司; T4 DNA连接酶、DNA限制性内切酶EcoRI和NotI均购自TaKaRa公司; genefist三色预染蛋白marker 10-180KD(protein marker)购自广州捷承科技有限公司。
1.2 生物信息学分析及所用软件使用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找CtG.lys开放阅读框(ORF); 利用ClustalX及CLC Main Workbench 6.0软件进行多序列比对; 氨基酸结构域分析使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)。通过ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸序列各项理化性质; 通过SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测CtG.lys是否含有信号肽; 利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测CtG.lys跨膜结构域; 通过MEGA 6.0软件, 用循环邻接法Neighbor joining构系统发育树, 置信度检验1 000次。
1.3 RNA提取、cDNA合成及实时荧光定量PCR采用通用型RNA提取试剂盒(Magen)提取组织RNA, 用紫外可见光谱仪测定其浓度, 琼脂糖凝胶检测RNA条带完整性。然后, 使用去除gDNA的逆转录试剂盒(Toyobo)进行cDNA第一链合成。用384孔板配置反应, 每孔总反应体系为10 μL, 包括: 5 μL qPCR反应酶(Toyobo)、0.3 μL正向引物和0.3 μL反向引物(序列见表 1)、3.4 μL双蒸水及用双蒸水稀释的1 μL模板cDNA。反应程序设置为94 ℃预变性3 min, 98 ℃变性10 s, 退火温度根据引物TM值设置为59 ℃、25 s, 预变性循环1次, 变性退火延伸循环45次; 18SrRNA为内参基因, 重复3次。根据2−ΔΔCt法计算CtG.lys的表达量, 用Prism 8.0的T检验进行统计分析, P < 0.05具有统计学意义。
| 引物名称 | 引物序列(5′-3′) | 用途 |
| CtG.lys-qRT-PCR-F | AACTTCATGCGTCTTCACC | qRT-PCR |
| CtG.lys-qRT-PCR-R | TTCTTGCGTTTGTTCAGC | qRT-PCR |
| 18S-F | ATGGTCAGAACTACGACGGTAT | qRT-PCR |
| 18S-R | GTATTGCGGTGTTAGAGGTGAA | qRT-PCR |
| Ctlys-F | CGGAATTCCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCCC | PCR |
| Ctlys-R | ATAAGAATGCGGCCGCCCGAAACGCGCGAGGCAGATCGTC | PCR |
PCR反应扩增CtG.lys(引物序列见表 1, 下划线碱基为EcoRI, NotI酶切位点, 粗体碱基为保护基团), 扩增体系25 μL: 引物0.5 μL, 模板cDNA 1 μL, Ex Taq保真酶12.5 μL, ddH2O 10.5 μL。循环参数: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃、15 s, 58 ℃ 15 s, 72 ℃、1 min, 32个循环, 72 ℃终延伸1 min。将目的基因PCR产物和表达载体pGEX-4T-1经限制性内切酶EcoRI, NotI(TaKaRa 1611, 1623)进行双酶切反应, 后用T4 DNA酶(TaKaRa 2011A)低温连接, 按1∶20比例将构建好的重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。次日挑取单菌落至LB(含氨苄)液体培养基, 经菌落PCR测定后送华大基因测序鉴定, 重组质粒命名为pGEX-4T-1-CtG.lys。将测序正确的pGEX-4T-1- CtG.lys转化到表达宿主菌E.coli BL21感受态细胞中。取50 μL已转化的重组质粒菌株接种于含100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中, 次日挑取单菌落至5 mL LB(含氨苄)液体培养基37 ℃, 200 r/min振荡培养至OD600值为0.5~0.6; 加入IPTG至终物质的量浓度1.0 mmol/L, 37 ℃, 200 r/min诱导表达4 h后收菌。以未经诱导的重组质粒作为对照, SDS-PAGE法检测全菌中目的蛋白表达情况。
1.4.2 重组蛋白的可溶性检测取3管20 mL OD600=0.4~0.6的pGEX-4T-1-CtG.lys菌液分别加入0.5 mmol/L IPTG(以未诱导菌液为对照)。分别在20 ℃、16 ℃诱导10 h后各收集5 mL菌液, 用PBS缓冲液重悬菌液并超声破碎, 4 ℃, 6 000 g离心10 min, 分别收集上清和沉淀, 分别取100 μL上清液和沉淀高温变性。SDS-PAGE电泳检测破碎上清液(可溶性)和沉淀(包涵体)中重组蛋白表达情况。
1.5 重组蛋白的纯化收集400 mL诱导后的菌液, 用PBS洗涤菌体, 按1∶20比例重悬菌体, 冰浴超声波破碎, 离心收集上清液。利用GST标签蛋白纯化试剂盒(碧云天生物技术公司P2262), 按产品说明书纯化重组蛋白。收集的洗脱液即为纯化的蛋白样品, SDS-PAGE电泳检测纯化后的重组蛋白。取纯化后的蛋白样品, 按5倍比例稀释后用BCA法(BCA蛋白定量试剂盒上海雅酶生物科技有限公司ZJ101)测定纯化后的蛋白浓度。样品设置5个重复, 以牛血清白蛋白BSA, 用PBS稀释至终质量浓度为2 mg/mL作为标准品绘制标准曲线, 用酶标仪(Tecan infinite 200Pro)测定562 nm处标准品和纯化重组蛋白的吸光度值, 绘制标准曲线, 计算样品中的蛋白浓度。
1.6 重组蛋白的抑菌活性鉴定选取革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和革兰氏阴性细菌肠炎沙门氏菌、溶藻弧菌及施罗氏弧菌划线活化, 挑取活化后的单菌落过夜培养, 次日按10%的接种量加到LB液体(弧菌另加2.5%海盐)培养基中发酵至OD600为0.5备用。采用平板涂布法[17-19], 以1∶100(V∶V)与纯化后的重组蛋白混合, 按各菌株的培养条件, 培养2 h后取100 μL涂布于LB(或含2.5%海盐)平板, 以不加重组蛋白、用纯化时收集的pGEX-4T-1-CtG.lys流穿液涂布作为对照。
采用液体生长抑制法[20], 用无菌的PBS溶液将纯化后的法螺溶菌酶重组蛋白稀释至终浓度为120、140、204、220 μg/mL, 各取100 μL培养至OD600为0.5的金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、肠炎沙门氏菌、溶藻弧菌及施罗氏弧菌菌液备用, 与各取100 μL稀释至所需浓度的重组蛋白混合均匀, 加入至96孔板中, 重复3次, 以不加重组蛋白用PBS代替的孔作为对照, 37 ℃、28 ℃过夜培养, 用酶标仪测定OD600, 根据实验孔与对照孔中各菌株的生长情况判断, 当菌液吸光值没有明显增加且肉眼观察无明显细菌增长时[21], 该孔对应的蛋白浓度即为最低抑菌浓度。
2 结果分析 2.1 法螺溶菌酶基因CtG.lys序列特征CtG.lys全长cDNA编码1 041 bp cDNA, 855 bp CDS序列, 其中5′UTR为66 bp, 3′UTR为186 bp, ORF为789 bp, 编码262个氨基酸。ProtParam预测其蛋白质分子式C1098H1703N333O354S21, 相对分子质量25.91 kDa, 理论等电点(PI)是7.95; 氨基酸含量较高的有: Gly(14.3%)、Ser(9.4%)、Ala(9.0%)、Asn(6.9%)、Leu(5.3%); 含16个带负电氨基酸(Asp + Glu)、含18个带正电氨基酸(Arg + Lys); 脂肪系数60.20, 总平均亲水性为–0.372, 属于亲水性蛋白。
SignaIP 5.0分析结果表明该蛋白有信号肽存在, 且位于17与18位氨基酸之间, 该蛋白为分泌蛋白。SMART分析表明该CtG.lys成熟肽有1个转糖苷酶(SLT)结构域, 位于72~255 aa; TMHMM预测结果显示该蛋白不存在跨膜结构。利用SWISS-MODEL对CtG.lys氨基酸序列进行三维结构预测, 用同源建模法进行模型创建, 非洲鸵鸟(Struthio camelus) G.lys(GenBank No.: 3wyh_A)为模板。建模的结果如图 1所示: 预测的CtG.lys三维结构符合G型溶菌酶蛋白结构, 包含7个α螺旋, CtG.lys的催化位点氨基酸残基(Glu72、Asp85、Asp96)与模板蛋白(Glu73、Asp86、Asp97)的空间位置几乎一致, 含有6个半胱氨酸残基。
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| 图 1 法螺CtG.lys(红色)与非洲鸵鸟的溶菌酶G.lys (绿色)三维结构 Fig. 1 Three-dimensional structure of Charonia tritonis G. lys (red) and Struthio camelus G. lys (green) |
NCBI氨基酸一致性分析显示法螺CtG.lys氨基酸序列与海蜗牛Aplysia californica(登录号: XP_012944836.1)、福寿螺Pomacea canaliculata(登录号: XP_025083688.1)G.lys氨基酸一致性较高, 分别为45.11%和45.95%。与斑马鱼Danio rerio(登录号: NP_001076289.1)和原鸡Gallus gallus (登录号: XP_040517238.1)的一致性较低, 分别为39.67%和32.43%; 多序列比对显示, CtG.lys与海蜗牛G.lys同源性较为一致(图 2)。不同物种G.lys系统发育分析结果显示, 福寿螺和海蜗牛首先聚为一支, 其次与法螺聚为一支, 表明法螺CtG.lys与福寿螺和海蜗牛G.lys亲缘关系最近(图 3)。
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| 图 2 法螺CtG.lys与多物种同源蛋白序列比对 Fig. 2 Alignment of CtG.lys and multi-species lysozyme protein sequence of Charonia tritonis 注: 黑色背景碱基保守性≥50%, 灰色代表碱基相似 |
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| 图 3 法螺CtG.lys与其他物种溶菌酶G.lys的邻接法(N-J)系统进化分析(置信度检验1 000次) Fig. 3 Phylogenetic tree of Charonia tritonis CtG. lys and the G. lys of other species based on the amino acid sequences using the neighbor-joining method (1 000 replicates) |
qRT-PCR检测CtG.lys在法螺不同组织中的表达模式。结果显示CtG.lys表达具有明显的组织差异性, 在肝脏表达量最高, 外套膜、唾液腺、肠次之, 与其他组织相比差异显著(图 4)。
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| 图 4 法螺CtG.lys在不同组织的表达 Fig. 4 Expression analysis of CtG. lys in different Charonia tritonis tissues 注: 各组间含有不同字母表示差异显著(P < 0.05), 含相同字母表示无差异 |
重组工程菌大肠杆菌BL21-pGEX-4T-1-CtG.lys经IPTG诱导后表达出相对分子质量约为51.91 kDa的融合蛋白, 以蛋白分子量10~180 kDa Maker(Genefist GF6616)为参考, 而对照组未诱导的DE3-pGEX- 4T-1-CtG.lys(图 5泳道1)则无此特异性条带。由于法螺溶菌酶CtG.lys的蛋白分子量约为25.91 kDa, 且pGEX-4T-1包含的GST标签蛋白分子量约为26 kDa, 故全菌中重组蛋白大小约为51.91 kDa(图 5泳道2~9), 说明增加的蛋白条带就是重组菌株被诱导表达的融合蛋白产物。
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| 图 5 pGEX-4T-1-CtG.lys重组质粒在大肠杆菌BL21中的IPTG诱导表达 Fig. 5 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induced expression of the pGEX-4T-1-CtG.lys recombinant plasmid in E. coli BL21 注: 1: 未经IPTG诱导的BL21(pGEX-4T-1-CtG.lys)全菌蛋白; 2~9: IPTG诱导的BL21(pGEX-4T-1-CtG.lys)全菌蛋白; M: 蛋白质分子质量标准Marker; 箭头指示条带为重组蛋白 |
重组工程菌大肠杆菌BL21-pGEX-4T-1-CtG.lys经20 ℃、16 ℃, 0.5 mmol/L IPTG浓度诱导培养10 h后, 收集菌体, PBS洗涤重悬。经超声波破碎后, 离心收集上清液和包涵体沉淀。将蛋白分子量10~180 kDa Maker(Genefist GF6616)、破碎上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳, 检测pGEX-4T-1-CtG.lys重组蛋白的可溶性。结果显示, 20 ℃, 0.5 mmol/L诱导10 h重组蛋白只以包涵体的形式存在(图 6a泳道6), 而16 ℃, 0.5 mmol/L诱导10 h时重组蛋白同时在上清(图 6b泳道5~8)和包涵体中表达(图 6b泳道1~4)。
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| 图 6 pGEX-4T-1-CtG.lys重组蛋白可溶性SDS-PAGE分析 Fig. 6 pGEX-4T-1-CtG.lys recombinant soluble protein analysis 注: a: 1. 未经IPTG诱导的BL21(pGEX-4T-1-CtG.lys)全菌蛋白; 2~5. IPTG诱导的BL21(pGEX-4T-1-CtG.lys)上清液; 6. IPTG诱导的BL21(pGEX-4T-1-CtG.lys)包涵体; M. 蛋白质分子质量标准Marker; 箭头指示条带为重组蛋白; b: 1~4. IPTG诱导的BL21(pGEX-4T-1-CtG.lys)包涵体; 5~8. IPTG诱导的BL21 (pGEX-4T-1-CtG.lys)上清液; 9. 未经IPTG诱导的BL21 (pGEX-4T-1-CtG.lys)全菌蛋白; M. 蛋白质分子质量标准Marker; 箭头指示条带为重组蛋白 |
通过亲和层析柱去除未结合的蛋白, 收集此时的流穿液。用裂解液洗脱亲和层析柱, 收集洗脱液; 再用含GST的洗脱缓冲液, 将GST融合蛋白从树脂上洗脱下来, 即得到纯化的融合蛋白。将蛋白分子量10~180 kDa Maker(Genefist GF6616)、流穿液(图 7a泳道1)、洗脱液(图 7a泳道2~3)、纯化的融合蛋白变性后进行SDS-PAGE鉴定, 均可见到明显的目的蛋白, 表示纯化成功结果见(图 7a泳道4~10)。测定纯化重组蛋白浓度绘制BSA标准曲线如图 7b。
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| 图 7 pGEX-4T-1-CtG.lys重组蛋白SDS-PAGE纯化分析及BSA标准曲线 Fig. 7 SDS-PAGE analysis of the pGEX-4T-1-CtG.lys recombinant protein and the BSA standard curve 注: M: 蛋白分子量标准; 1. 上样流穿液; 2~3. 洗涤液; 4~10. 洗脱纯化后的蛋白; 箭头指示条带为纯化后的重组蛋白 |
平板涂布法的抑菌活性测定结果显示, 纯化后的重组蛋白(图 8实验组)与革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌; 革兰氏阴性细菌肠炎沙门氏菌、溶藻弧菌及施罗氏弧菌作用后, 菌落数明显少于对照组(图 8对照组)。其中法螺溶菌酶重组蛋白作用后金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、施罗氏弧菌与对照组相比菌落数明显减少; 肠炎沙门氏菌、溶藻弧菌的菌落数与对照组相比数量较少不明显(图 8)。这表明法螺溶菌酶重组蛋白对革兰氏阳性细菌的抑菌作用大于革兰氏阴性细菌。采用液体生长抑制法测定重组蛋白对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、施罗氏弧菌的最小抑菌浓度, 结果表明, 重组蛋白对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度为70 μg/mL; 对藤黄微球菌的最小抑菌质量浓度为104 μg/mL; 对施罗氏弧菌的最小抑菌质量浓度为110 μg/mL。
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| 图 8 法螺G型溶菌酶重组蛋白的抑菌效果 Fig. 8 Antibacterial effect of the Charonia tritonis G-type-lysozyme recombinant protein |
溶菌酶能诱导非特异性免疫应答, 具有抗菌、抗炎症特性[22], 是一种天然的内源性抗生素[23]。水生动物溶菌酶较陆生动物溶菌酶具有更广的抗菌谱, 能溶解革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌[24], 使其在病害防治中有很好的应用前景。本研究利用同源建模法构建的CtG.lys蛋白三维结构表明, 法螺CtG.lys的SLT结构域含有3个酶活性催化位点, 即: Glu72、Asp85、Asp96。这与G型溶菌酶的典型代表-鹅蛋清溶菌酶[25](goose egg-white lysozyme)中的催化位点略有差异。据报道, 斑马鱼[26]、大黄鱼和金鱼[27]等G型溶菌酶的酶活性催化位点与鹅蛋清溶菌酶相比也存在位置差异情况[28]。在鱼类G型溶菌酶中, 第1位Glu和第3位Asp残基是其发挥抗菌作用的关键位点[29]。由此推测, 法螺G型溶菌酶发挥抑菌活性的关键可能是Glu和Asp残基与细菌细胞壁肽聚糖底物结合[30], 从而破坏N-乙酰葡糖胺和乙酰胞壁酸之间的糖苷键。
半胱氨酸是形成二硫键的前提, 二硫键的存在可使溶菌酶蛋白结构更稳定, 从而有助于增强水生动物对环境变化的适应性及在高渗透条件下的稳定性[31]。但是, G型溶菌酶的二硫键数目因物种不同存在较大的变化[32]。大西洋鲑鱼G型溶菌酶中存在3个半胱氨酸残基[6], 鲤鱼和条石鲷中不存在半胱氨酸残基[33-34]。本研究中, 法螺G型溶菌酶蛋白含有6个半胱氨酸残基, 能形成三对二硫键使其空间结构更紧密, 推测其可能在抵御细菌感染时能更稳定与细菌细胞壁肽聚糖底物相结合。溶菌酶的组织分布与其功能密切相关, 如鱼类中发挥免疫功能的G型溶菌酶基因, 在免疫组织脾脏中的表达量较高[3, 35]。本研究中, 法螺CtG.lys基因被检测到在肝脏和外套膜中高表达。外套膜能分泌具有抑菌和杀菌作用的黏液, 是软体动物免疫防御的第一道防线[1, 36]; 肝脏作为主要的解毒器官也参与免疫反应[37]。由此推断, 法螺CtG.lys基因在其免疫防御中发挥了一定的作用。
原核重组表达菌株经低温诱导能有效地增加可溶性蛋白的比例, 提高可溶性蛋白的表达量。叶星等[35]采用原核表达系统成功表达出草鱼G型溶菌酶; 杨梅等[4]利用原核表达系统经低温诱导获得小菜娥溶菌酶重组蛋白, 且表达产物对革兰氏阳性细菌的抑菌活性强于革兰氏阴性细菌; 王秀霞及徐永平等[38-39]在大肠杆菌中对刺参溶菌酶进行了表达, 表达产物对多种海洋致病菌均具有抑菌活性是表达谱很广的免疫效应分子。本研究中, 纯化后的法螺G型重组蛋白对革兰氏阳性细菌有较强的抑菌活性, 对革兰氏阴性细菌的抑菌作用较弱, 这可能与不同细菌的细胞壁组成成分有关[19, 40]。革兰氏阳性菌细胞壁组分主要是肽聚糖, 对溶菌酶敏感度高易被水解; 革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖含量较低, 且位于内层对溶菌酶的敏感度低不易被水解[41-42]。
4 结论本研究中法螺溶菌酶基因与其他腹足纲双壳软体动物的G型溶菌酶序列同源性最高、结构特征最为相似, 据此判定法螺中溶菌酶基因CtG.lys类型为G型。另外, 成功诱导表达出法螺G型溶菌酶重组蛋白, 纯化后的重组蛋白具有广谱的抑菌活性, 能明显抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性。这将为深入研究由细菌感染引起的法螺病害防治及免疫防御机制提供参考依据。
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