日本海神蛤(Panopea japonica)为名贵贝类, 属软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、海螂目(Myoida)、缝栖蛤科(Hiatellidae)、海神蛤属(Panopea), 分布于我国黄海北部、朝鲜半岛和日本北海道等海域^[1]。在中国市场上, 日本海神蛤与分布在北美西海岸的高雅海神蛤(P. abtupta)的商业名称均为象拔蚌, 其肉质鲜美、营养丰富^[2], 深受消费者喜爱, 市场潜力大。目前我国日本海神蛤的自然资源几近枯竭, 全部依赖进口。20世纪90年代, 中国学者开展了大量的高雅海神蛤(P. abtupta)引种试验^[3-4], 在苗种繁育方面取得了突破, 但由于受栖息水温限制, 关于高雅海神蛤在我国大规模养殖的研究尚无系统报道, 制约了象拔蚌产业发展。日本海神蛤为我国北黄海土著贝类资源^[1], 有望在我国辽阔的海域推广养殖。近年来, 国外学者和国内大连海洋大学霍忠明等^[5-10]相继开展了日本海神蛤繁殖生物学的研究工作, 建立了日本海神蛤人工苗种繁育技术, 为象拔蚌的人工养殖开辟了新途径。

性腺发育的生物学零度和有效积温是海洋贝类繁殖生物学研究的重要指标, 有助于了解性腺发育的特点, 为贝类人工苗种繁育提供理论支撑。目前, 关于海洋贝类的性腺发育的生物学零度和有效积温已有较多报道, 主要包括海湾扇贝(Argopecten irradians Lamarck)^[11-13]、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)^[14]、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)^[15]、西施舌(Coelo­mactra antiguata)^[16]、缢蛏(Sinonovacula constricta)^[17]、褐云玛瑙螺(Achatina fulica Frusaac)^[18]等。毕庶万等^[13]通过使用二点法、最小二乘法、积温仪计数法对海湾扇贝性腺发育生物学零度和有效积温进行了研究。刘德经等^[16]运用回归直线法开展了西施舌生物学零度和有效积温研究。闫喜武^[19]通过有效积温公式K=H(T–t), 拟合线性升温曲线, 结合组织学观察求算了菲律宾蛤仔性腺发育生物学零度。田斌等^[14]采用有效积温拟合曲线的方法, 计算了虾夷扇贝性腺发育的生物学零度和有效积温。Xue等^[17]比较了1龄及2龄缢蛏新品种“申浙1号”性腺发育的生物学零度和有效积温。

目前, 关于海神蛤生物学零度和有效积温的研究尚未见报道。Marshall等^[20]研究了温度对高雅海神蛤的性腺发育的影响, 发现高雅海神蛤性腺发育的最佳水温是7 ℃, 繁育水温是11 ℃, 当水温升高到15 ℃以上时高雅海神蛤性腺开始退化, 当水温达到19 ℃时高雅海神蛤的性腺不发育。Aragón-noriega等^[21]对球形海神蛤(P. globosa)的性腺发育及繁殖周期进行了研究, 结果表明, 球形海神蛤在水温30 ℃时性腺开始逐渐发育, 当水温逐渐降低至18 ℃时进入繁殖盛期。本研究运用二点法、回归直线法和有效积温法3种方法求算日本海神蛤性腺发育的生物学零度及有效积温, 以期为我国日本海神蛤资源恢复和人工苗种繁育提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 亲贝的选择和暂养

于2019年1月26日, 在日本海海域采集壳型规整、无损伤, 水管粗壮且收缩力强的日本海神蛤158个作为亲贝低温运输至大连庄河贝类育苗场, 在30 m³的水泥池中进行暂养。室内暂养水温为4.1~4.3 ℃, 盐度30~31, 饵料按球等边金藻(Isochrysis galbana)和角毛藻(Chaetoceros)体积比1∶1混合投喂, 日投饵3~4次, 日投饵量约为(1.2~1.8)×10⁴ cells/mL, 每天全量换水一次。

1.2 亲贝的升温促熟

分别在两个水泥池(1号培育池与2号培育池)中按两种升温方式进行日本海神蛤室内人工升温促熟。在亲贝人工升温促熟过程中, 两个实验组饵料投喂等日常管理操作保持一致。1号培育池与2号培育池均于1月27日开始升温, 1号培育池每2日升温0.5 ℃, 2号培育池每日升温0.5 ℃, 每日早、中、晚进行3次水温测量, 根据监测温度计算日均水温, 记录从升温促熟开始到产卵的总天数。

1.3 统计分析

数据以平均值±标准差表示, 使用SPSS 17.0软件进行数据分析, 采用Excel软件进行作图。

2 结果

经过室内人工升温促熟, 1号培育池在促熟后43 d开始出现产卵排精现象, 平均水温为(7.41±2.37) ℃, 2号培育池在促熟后38 d出现产卵排精现象, 平均水温是(8.50±2.45) ℃。两池人工升温促熟的日均水温见表 1。根据有效积温公式: K=H(T–T₀), 其中H为日本海神蛤开始促熟到产卵所需的时间(d); T为升温促熟日均水温(℃); T₀为生物学零度; K为有效积温。运用二点法^[13]、回归直线法^{[16, 22-23]}和有效积温法^{[14, 19]}3种方法求算日本海神蛤性腺发育的生物学零度T₀及有效积温K。

2.1 二点法

利用两点法计算, 根据有效积温相等, 可得(T₁–T₀)H₁=K=(T₂–T₀)H₂, 其中T₁、T₂分别为1号培育池、2号培育池升温促熟日均水温(℃); T₀为生物学零度; H₁、H₂分别为1号培育池、2号培育池促熟时间(d), K为有效积温。

整理得, 生物学零度:

式中T₁和T₂分别为7.41 ℃和8.50 ℃; H₁和H₂分别为43 d和38 d。结果表明, 日本海神蛤性腺发育生物学零度为–0.874 ℃, 有效积温为356.212 ℃·d。

2.2 回归直线法

设性腺发育速率为V, 则$V = \frac{1}{H}$$V = \frac{1}{H}$, H为日本海神蛤开始促熟到产卵所需的天数(d), 将V代入积温公式, 即得: T=T₀+KV。通过实验所得到数据, 建立一个理论回归直线, 根据最小二乘法原理, 其回归直线斜率即为K的估计值, 直线的截距就是T₀的估计值, 其中${T_0} = \frac{{\sum {V^2} \cdot \sum T - \sum V \cdot \sum VT}}{{n\sum {V^2} - {{\left( {\sum V} \right)}^2}}}$, $K = \frac{{n\sum VT - \sum V \cdot \sum T}}{{n\sum {V^2} - {{\left( {\sum V} \right)}^2}}}$(n=2)。

式中促熟天数、日均水温等观测数据见表 2, 将表中数据代入回归直线法计算公式, 求算生物学零度T₀和有效积温K值, 结果表明, 日本海神蛤性腺发育生物学零度为–1.14 ℃, 有效积温为366.69 ℃·d。

2.3 有效积温法

记录两批亲贝从开始促熟到自然产卵的日均水温, 根据积温公式K=H(T–T₀)拟合线性升温曲线, 利用积温K值相同, 即S₁=S₂、统计得出生物学零度T₀及有效积温K。

日本海神蛤人工升温促熟的两个培育池拟合水温变化见图 1、图 2。

根据日均水温拟合两个实验的升温曲线分别为L₁(图 3a)和L₂(图 3b)。

$ {{\text{L}}_{1}}: y= 0.187 0x + 3.294 9 \;\;R^{2} = 0.984 0 $

(1)

$ {{\text{L}}_{2}}: y= 0.215 8x + 4.296 3 \;\; R^{2} = 0.954 3 $

(2)

由前两种方法得知, 日本海神蛤的生物学零度T₀较低, 亲贝入池水温已高于T₀, 故实际实验积温图如图 3:

由S₁=S₂得,

$ \int_0^{43} {{{\text{L}}_1}} - \int_0^{43} {{{\text{l}}_1}} = \int_0^{38} {{{\text{L}}_2}} - \int_0^{38} {{{\text{l}}_2}} . $

(3)

由(3)解得: T₀=–0.900 96

根据生物学零度–0.900 96 ℃, 按有效积温公式K=H(T–T₀)推算, 得出在人工促熟条件下, 日本海神蛤的有效积温为(357.305±0.09) ℃·d(见表 3)。

根据二点法、直线回归法和有效积温法计算获得的日本海神蛤生物学零度和有效积温(见表 4), 求得日本海神蛤生物学零度及有效积温平均值分别为(–0.97±0.14) ℃和(360.07±5.76) ℃·d。

3 讨论

温度是影响贝类的性腺发育及繁殖周期的重要因素^[24-26], 掌握其性腺发育的生物学零度和产卵的有效积温, 可通过调节生境温度的方法, 可以加快性腺发育速度, 达到提早繁育效果, 为贝类室内人工升温促熟苗种繁育提供科学的理论依据^[27]。目前关于贝类的生物学零度的计算方法较多, 如二点法、回归直线法和有效积温法。利用二点法计算, 需要样本数少, 计算方法简单, 可快速得到数据, 但由于代入数值为日均温度, 存在精度不足的问题。回归直线法将发育起点温度转化为求算直线回归系数, 简化了计算过程, 但是这种方法在计算过程中颠倒了自变量和因变量的关系, 将原来的自变量变成了因变量。二点法及回归直线法法均为早期方法, 计算较为简便, 首先在昆虫等变温性动物中应用^{[22, 28]}, 后被引入贝类等水产动物。闫喜武^[19]在计算菲律宾蛤仔时应用了有效积温法, 根据K=H(T–t)拟合线性升温曲线, 利用有效积温K值进行数理统计得出性腺发育生物学零度, 再通过组织学方法进行验证。此方法适用于实际生产。拟合线性升温曲线, 一定程度上减少了实验温度不稳定原因造成的影响, 再结合组织学方法进行验证, 具有较强的说服力。本文采用3种方法计算得出日本海神蛤生物学零度分别为–0.874 ℃、–1.1352 ℃和–0.900 96 ℃, 有效积温分别为356.212 ℃·d、366.689 ℃·d及357.305 ℃·d, 结果较为相近。综合3种方法, 求得日本海神蛤的生物学零度平均值为(–0.97±0.14) ℃, 有效积温平均值为(360.07±5.76) ℃·d。

本研究表明日本海神蛤性腺发育生物学零度较低, 这可能与日本海神蛤冷水生活环境适应性和繁殖习性有关。在目前已有的报道中, 性腺发育生物学零度低于0 ℃的水产动物较少, 王妍妍等^[29]研究表明条斑星鲽(Verasper moseri)胚胎发育的生物学零度为–0.1 ℃, 分析指出这可能与条斑星鲽为冷温性鱼类, 与其性腺早期在较低水温开始发育有关。日本海神蛤为冷水性贝类, 成年个体生活适温为8~ 22 ℃。李莹^[30]通过日本海神蛤周年性腺发育组织切片观察发现, 几乎全年都存在性腺发育处于增殖期的雌性个体, 3—9月出现性腺发育处于成熟期雌性个体; 而雄性日本海神蛤全年都存在性腺发育处于成熟期个体; 雌雄日本海神蛤性腺发育具有不同步的特点。本实验计算求得日本海神蛤性腺发育生物学零度为–0.97 ℃, 与日本海神蛤自然水域的性腺发育实际情况相一致。

4 结论

本研究计算日本海神蛤生物学零度及有效积温的平均值分别为(–0.97±0.14) ℃和(360.07±5.76) ℃·d。在日本海神蛤室内人工苗种繁育过程中, 结合日本海神蛤性腺发育的生物学零度和产卵的有效积温特点, 通过调控生境水温, 可以加快性腺发育速度, 达到提早繁育效果。