2022, Vol. 46
文章信息
- 唐佳, 蔡文启, 闫智聪, 赵建民, 周智. 2022.
- TANG Jia, CAI Wen-qi, YAN Zhi-cong, ZHAO Jian-min, ZHOU Zhi. 2022.
- 海水酸化和Cu2+暴露对虫黄藻Cladocopium goreaui营养同化和能量分配的影响
- Effects of seawater acidification and Cu2+ exposure on nutrient assimilation and energy allocation of Cladocopium goreaui
- 海洋科学, 46(4): 98-105
- Marina Sciences, 46(4): 98-105.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20210425001
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文章历史
- 收稿日期：2021-04-25
- 修回日期：2021-11-05
2. 海南大学海洋学院, 海南 海口 570228;
3. 中国科学院大学, 北京100049
2. College of Marine Sciences, Hainan University, Haikou 570228, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
虫黄藻是一类黄褐色的单细胞甲藻, 主要分布于亚热带和热带海域, 是珊瑚礁生态系统中最主要的初级生产者[1]。按照染色体数目、营养期和移动期细胞大小以及叶绿体的大小、数目和排列等方面的差异, 研究人员将虫黄藻划分为9个系群(Clade A-I)[2], 目前这些系群被正式定为属[3]。虫黄藻可在珊瑚礁区营浮游生活, 也可与造礁石珊瑚、海葵和砗磲等礁栖生物营共生生活。其中, 与造礁石珊瑚共生的虫黄藻主要来自Symbiodinium (Clade A)、Breviolum (Clade B)、Cladocopium (Clade C)、Durusdinium (Clade D)和Fugacium (Clade F)5个属[3]。在造礁石珊瑚与虫黄藻形成的共生联合体中, 共生虫黄藻可为造礁石珊瑚输送光合作用衍生物(糖类、脂质和氨基酸), 该过程可满足珊瑚宿主95%以上的能量需求[4-5]。作为交换, 造礁石珊瑚也可为共生虫黄藻提供二氧化碳(CO2)和其他无机氮磷等营养物质[6-7]。此外, 在造礁石珊瑚成礁过程中, 虫黄藻具有促进其钙化的重要作用[1]。
近年来, 造礁石珊瑚的生存面临着全球气候变化和人类活动的双重胁迫, 导致全球范围内33%~ 50%的珊瑚礁生态系统濒临退化[8]。根据联合国政府间气候变化专门委员会(IPCC)的预测, 2100年海水pH预计将下降至7.6左右[9]。研究发现, 许多珊瑚礁区海水pH在短时间内可发生较大幅度的变化, 从而影响到局部海域的文石饱和度; 例如, 大堡礁南部的伊丽特女士岛海域, 其文石饱和度变化范围为1.1~6.5, 文石饱和度的下降将严重影响到礁区生物的钙化过程[10]。此外, 调查表明, 部分珊瑚礁礁区Cu2+浓度已严重超过了我国《海水水质标准(GB 3097-1997)》中第Ⅰ类海水水质标准的阈值(5 μg·L–1)[11]; 诸如香港东部海水中Cu2+平均浓度达到21.4 μg·L–1[12], 百慕大珊瑚礁区附近的Cu2+浓度亦可达18.4 μg·L–1[13]。尽管铜是生物所必须的元素, 但高浓度Cu2+会对生物体产生毒性[14]。由此可见, 部分珊瑚礁区同时面临着海水酸化和Cu2+污染的双重威胁。
目前, 较少的研究关注虫黄藻对海水酸化和Cu2+暴露的生理响应。已有研究表明, 海水酸化能够影响虫黄藻的生长[15]、多样性[16]、光合作用[15, 17-19]、脂肪酸含量[17]和代谢物组成[20]。Cu2+暴露也可以对虫黄藻的生长和光合作用产生负面影响[21-22]。最新的研究表明, 珊瑚能量获取能力的受限能够改变共生体的营养循环过程, 从而导致珊瑚和虫黄藻间共生关系的破裂[23], 提示营养物质循环和能量分配对于虫黄藻生长和繁殖的重要性。然而, 目前关注海水酸化和Cu2+暴露对虫黄藻营养同化和细胞内能量分配的研究尚不多见。
虫黄藻Cladocopium goreaui属于Clade C, 该属虫黄藻广泛分布于太平洋的热带和亚热带浅海海域[24], 也是我国南海造礁石珊瑚中共生虫黄藻的主要属[25-26]。本研究以虫黄藻C. goreaui为研究对象, 开展了为期7 d的海水酸化和Cu2+暴露实验, 以评估酸化和Cu2+单独与复合暴露对虫黄藻碳氮稳定同位素含量、能量储备物质含量、能量消耗和细胞内能量分配的影响, 研究结果有助于理解环境变化对虫黄藻的胁迫机制, 同时也可为珊瑚礁生态系统的保护和恢复提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验藻种和暴露实验实验所用虫黄藻(C. goreaui)由厦门大学海洋与地球学院的林森杰教授课题组提供。虫黄藻培养于L1培养基中[27], 培养光强为110±10 μE/(m2·s), 温度为26±0.5℃, 光周期为12L∶12D。
本研究共设置2个pH水平(pH 8.1和pH 7.6)和2个Cu2+水平(4.25 μg·L–1和16.47 μg·L–1)。其中, pH 8.1代表目前采样海域的实际pH值, pH 7.6模拟IPCC预测的2100年海水pH值[9], 通过CO2气体流量控制系统调节水体pH至7.6; Cu2+的暴露浓度参考了采样海域和其他珊瑚礁区的环境Cu2+浓度。每个处理组设置6个生物学重复, 分别进行为期7 d的暴露实验。暴露实验中, 初始藻密度均为6.68×104个/mL, 培养体积为250 mL, 光强为110±10 μE/(m2·s), 温度为26±0.5 ℃, 光周期为12L∶12D。
实验起始前, 利用电感耦合等离子体质谱仪(Agilent, 7800 ICP-MS, 美国)测定了各处理组培养基中的实际Cu2+浓度; 实验期间, 每日采用标准液校准的pH计(Mettler toledo, 瑞士)测定水体pH, 同时利用盐度计(上海精密, 中国)和温度计(生工生物工程股份有限公司, 中国)分别测定水体的盐度和温度, 相关海水化学参数见表 1。
| 处理组 | pH | Cu2+实测浓度/(μg·L–1) | 盐度 | 温度/℃ |
| 对照组 | 8.16±0.02 | 4.25±0.07 | 30.2±0.3 | 25.9±0.5 |
| pH处理组 | 7.58±0.03 | 4.25±0.07 | 30.1±0.1 | 26.6±0.5 |
| Cu处理组 | 8.13±0.03 | 16.47±0.67 | 30.1±0.2 | 26.5±0.4 |
| 复合处理组 | 7.57±0.04 | 16.47±0.67 | 30.3±0.2 | 26.8±0.5 |
虫黄藻经暴露7 d后, 分别从各处理组采集5 mL藻液, 过滤至Whatman公司GF/F滤膜(450℃预烧4 h)上; 50℃干燥24 h, 经1 mol/L盐酸酸化后, 采用稳定同位素质谱仪(Sercon HS20-22, 英国)测定虫黄藻中的δ13C和δ15N, 具体测定方法参照Sturaro等[28]。在分析过程中, 碳、氮同位素标准样品分别为美国白垩纪皮狄组织层位中的拟箭石化石和空气中的氮气。δ13C和δ15N的计算参照以下公式[29]:
式中, X指13C或15N, R表示13C/12C的丰度比值或15N/14N的丰度比值。
1.3 虫黄藻能量储备的测定虫黄藻经处理7 d后, 分别从各处理组收集50 mL藻液, 5 000×g 4 ℃离心收集藻细胞; 经磷酸盐缓冲液(PBS, 0.14 mol/L NaCl、8 mol/L Na2HPO4、1.5 mmol/L KH2PO4和3 mmol/L KCl; pH 7.4)洗涤3次, 采用1 mL PBS重悬藻细胞沉淀, 分别加入适量氧化锆破碎珠(0.5 mm, Biospec, 美国), 并借助生物均质仪(杭州奥盛仪器有限公司, Bioprep-24, 中国)完全破碎虫黄藻。藻细胞破碎后, 12 000×g 4 ℃离心10 min, 收集上清液用于虫黄藻能量储备物质含量(糖类、脂质和蛋白质)的测定。
糖类含量的测定参考Aderemi等[30]描述的方法, 以葡萄糖为标准品; 脂质含量的测定参照Bligh等[31]的方法, 并以三棕榈酸甘油三酯作为标准品; 同时, 采用BCA法蛋白定量试剂盒(生工生物工程股份有限公司, 中国)测定上清液的蛋白质含量, 具体操作步骤和计算参考说明书。根据经验常数(17 500 mJ/mg糖类、35 900 mJ/mg脂质和24 000 mJ/mg蛋白质), 将虫黄藻储能物质的含量转换为其能量值。同时, 以这3种储能物质的能量值加和作为虫黄藻中的能量储备[30]。
1.4 虫黄藻能量消耗和分配的测定将上述获得的虫黄藻上清液, 用于线粒体电子传递链活性的测定。根据Kenner等[32]描述的方法, 测定虫黄藻的线粒体电子传递链活性。测定方法简述如下: 50 μL待测样品中加入100 μL BSS溶液(100 mmol/L Tris-HCl, 0.2% Triton X-100)和50 μL底物溶液(1.17 mmol/L NADH和250 μmol/L NADPH), 随后添加100 μL对碘硝基四唑紫(8 mmol/L)起始反应。波长490 nm处测定反应液10 min内吸光值的变化, 并根据电子转移系统每消耗1 μmol/L氧气形成2 μmol/L碘硝基四唑紫甲瓒计算耗氧量。最终将耗氧量转化为能量(480 kJ/mol O2), 即为能量消耗。能量储备和能量消耗的比值作为细胞内能量分配值[33]。
1.5 统计分析所有生理指标均以平均值±标准差表示, 每个指标均测定6个重复。使用SPSS(IBM, Statistics 20)软件进行统计分析, 利用Shapiro-Wilk和Bartlett’s分别检验数据的正态性和方差齐性。符合正态分布和方差齐性的数据进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)和Tukey检验。显著性差异水平设定为P < 0.05。
2 结果 2.1 海水酸化和Cu2+暴露对虫黄藻δ13C和δ15N的影响海水酸化和Cu2+暴露7 d后, 采用稳定同位素质谱仪测定了虫黄藻内的δ13C和δ15N。其中, 双因素方差结果分析表明, 海水酸化和Cu2+复合暴露对δ13C存在交互作用, 而对δ15N不存在显著(P > 0.05)交互作用(表 2)。pH处理组(–33.94‰±0.21‰)和复合处理组(–34.68‰±0.21‰)中的虫黄藻δ13C值显著(P < 0.05)低于对照组(–14.02‰±0.07‰)和Cu处理组(–14.09‰±0.08‰), 且后两者间无显著差异(图 1a)。对于虫黄藻内的δ15N值, pH处理组(–7.14‰±0.51‰)和Cu处理组(–7.09‰±1.04‰)均与对照组(–8.58‰± 0.72‰)无显著差异(P > 0.05), 而复合处理组(–6.80‰± 1.24‰)显著(P < 0.05)高于对照组(图 1b)。
| 因素 | |||
| pH | Cu2+ | pH×Cu2+ | |
| δ13C | F (1, 16)=33.683 | F (1, 16)=83 525.846 | F (1, 16)=22.291 |
| P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | |
| δ15N | F (1, 16)=4.916 | F (1, 16)=4.412 | F (1, 16)=1.924 |
| P=0.041 | P=0.052 | P=0.184 | |
| 糖类 | F(1, 16)=65.121 | F(1, 16)=1.619 | F(1, 16)=1.051 |
| P < 0.000 1 | P=0.221 | P=0.320 | |
| 脂质 | F (1, 16)=0.271 | F (1, 16)=10.119 | F (1, 16)=17.175 |
| P=0.610 | P=0.006 | P=0.001 | |
| 蛋白质 | F (1, 16)=255.219 | F (1, 16)=30.911 | F (1, 16)=7.385 |
| P < 0.001 | P < 0.001 | P=0.015 | |
| 能量储备 | F (1, 16)=58.677 | F (1, 16)=0.003 | F (1, 16)=21.116 |
| P < 0.001 | P=0.956 | P < 0.001 | |
| 能量消耗 | F (1, 16)=337.103 | F (1, 16)=67.766 | F (1, 16)=0.493 |
| P < 0.001 | P < 0.001 | P=0.493 | |
| 能量分配 | F (1, 16)=544.241 | F (1, 16)=67.247 | F (1, 16)=20.369 |
| P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | |
| 注: 显著性差异加粗表示, P < 0.05 | |||
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| 图 1 海水酸化和Cu2+对虫黄藻δ13C和δ15N的影响。数据由平均值±标准差表示(n = 6) Fig. 1 Effects of seawater acidification and Cu2+ exposure on δ13C and δ15N of Cladocopium goreaui. Data points represent means, and error bars represent standard deviations (n = 6) 注: 不同字母表示在相同pH条件下不同Cu2+浓度处理之间存在显著差异(P < 0.05) |
海水酸化和Cu2+暴露7 d后, 分别测定了虫黄藻内的糖类、脂质和蛋白质含量变化。分析可见, 海水酸化和Cu2+复合暴露对脂质和蛋白质含量存在显著(P < 0.05)交互作用, 而对糖类不存在显著(P < 0.05)交互作用(表 2)。pH处理组(0.05±0.01 mg/106个)和复合处理组(0.06±0.01 mg/106个)中虫黄藻的糖类含量显著(P < 0.05)高于对照组(0.017±0.01 mg/106个)和Cu处理组(0.02±0.00 mg/106个)(图 2a)。pH处理组(0.13± 0.01 mg/106个)、Cu处理组(0.11±0.01 mg/106个)和复合处理组(0.15±0.04 mg/106个)中虫黄藻的脂质含量均显著(P < 0.05)低于对照组水平(0.19±0.02 mg/106个)(图 2b)。对于虫黄藻内的蛋白质含量, pH处理组(0.30±0.03 mg/106个)显著(P < 0.05)高于对照组(0.18± 0.01 mg/106个)和Cu处理组(0.20±0.01 mg/106个), 而显著(P < 0.05)低于复合处理组(0.38±0.03 mg/106个) (图 2c)。
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| 图 2 海水酸化和Cu2+对虫黄藻糖类、脂质和蛋白质含量的影响。数据由平均值±标准差表示(n=6) Fig. 2 Effects of seawater acidification and Cu2+ exposure on carbohydrate, lipid, and protein content of Cladocopium goreaui. Data points represent means, and error bars represent standard deviations (n = 6) 注: 不同字母表示在相同pH条件下不同Cu2+浓度处理之间存在显著差异(P < 0.05) |
海水酸化和Cu2+暴露7 d后, 分析了各处理组中虫黄藻内的细胞能量储备、能量消耗以及细胞内能量分配。根据双因素方差分析结果, 海水酸化和Cu2+复合暴露对能量储备和细胞内能量分配均存在显著(P < 0.05)交互作用, 而其对能量消耗不存在显著(P < 0.05)交互作用(表 2)。各处理组间的能量储备、能量消耗和细胞内能量分配两两比较均存在显著性差异(P < 0.05)。虫黄藻内的能量储备从高到低依次为复合处理组(16 018.32±1 872.51 mJ·10–6个)、pH处理组(13 520.07±1 083.54 mJ·10–6个)、对照组(11 873.82±903.92 mJ·10–6个)和Cu处理组(9 435.63± 522.33 mJ·10–6个)(图 3a)。对虫黄藻的能量消耗而言, Cu处理组(189.29±27.88 mJ·10–6个·h–1)最高, 对照组(123.49±10.36 mJ·10–6个·h–1)次之, 复合处理组(76.68± 7.71 mJ·10–6个·h–1)和pH处理组(53.71±4.48 mJ·10–6个·h–1)依次降低(图 3b)。同时, 根据虫黄藻能量储备和能量消耗的比值, 计算出细胞内能量分配值, 其从高到低排序为: pH处理组(252.47±20.45)、复合处理组(210.77±34.58)、对照组(96.44±7.59)和Cu处理组(50.46±5.55)(图 3c)。
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| 图 3 海水酸化和Cu2+对虫黄藻能量储备、能量消耗和细胞内能量分配的影响。数据由平均值±标准差表示(n=6) Fig. 3 Effects of seawater acidification and Cu2+ exposure on energy reserve, energy consumption, and cellular energy allocation of Cladocopium goreaui. Data points represent means, and error bars represent standard deviations (n = 6) 注: 不同字母表示在相同pH条件下不同Cu2+浓度处理之间存在显著差异(P < 0.05) |
近年来, 全球范围内的调查均已发现, 部分珊瑚礁区同时存在着海水酸化和Cu2+污染现象, 但其对共生虫黄藻的生理影响研究仍十分有限。本研究探讨了海水酸化和Cu2+暴露对虫黄藻营养同化、能量消耗和能量分配的影响, 本研究结果可为深入了解海水酸化和Cu2+暴露对虫黄藻的胁迫机制提供基础数据, 也可为珊瑚礁生态系统的保护和恢复提供参考依据。
通常而言, 藻类会优先吸收轻同位素(12C和14N)[34]。因此, δ13C常被用于评估大气pCO2和海洋初级生产力的变化, 而δ15N则能够反映藻类对硝酸盐等营养物的利用程度[35]。在已开展的研究中, 珊瑚中共生虫黄藻的δ13C通常为负值, 而δ15N通常为正值[36], 而本研究观察到的δ13C和δ15N值均为负值, 推测可能是虫黄藻在体(珊瑚)和离体(培养基)环境的差异所导致。类似地, OECD培养基中小球藻的δ15N也为负值[37]。在本研究中, 单独酸化以及酸化和Cu2+复合暴露均能够导致虫黄藻δ13C的显著降低。与之相类似, 刘天琪[38]对东海原甲藻进行不同浓度的CO2处理, 也观察到高CO2处理组藻细胞中的δ13C值下降。自然海水中碳稳定同位素以12C和13C形式存在, 且12C较13C更容易被藻类所吸收[39]。本研究通过充入CO2气体来实现海水酸化, 该过程增加了水体中12CO2的浓度, 进而降低了单独酸化以及复合暴露组对13C的吸收, 提示未来气候变化背景下水体中CO2浓度增加能够为虫黄藻含碳化合物的合成提供充足的碳源。此外, 娄亚迪[40]的研究表明, 新月菱形藻、塔玛亚历山大藻和赤潮异弯藻优先吸收水体中的14N, 而在氮源不足的情况下, 藻类会被迫吸收水体中的15N, 从而导致藻体δ15N值的增加。在本研究中, 复合处理组的δ15N值显著高于对照组, 提示复合暴露能够显著改变虫黄藻的营养吸收作用, 藻体需要从水体中吸收更多的氮源以合成含氮化合物, 这于藻体内较高的蛋白质含量结果也相吻合, 表明虫黄藻可能需要累积更多的蛋白质抵御复合暴露带来的不利影响。
糖类、脂质和蛋白质是生命活动所必须的3大营养物质, 虫黄藻中的能量储备对于虫黄藻维持正常的生命活动具有重要作用。在本研究中, 单独酸化以及酸化和Cu2+复合暴露均能够造成虫黄藻的糖类和蛋白质含量显著上升, 且复合暴露比单独酸化暴露更能显著促进蛋白质的累积。类似的现象在其他藻类中也有报道, 如短期海水酸化暴露增加了小球藻细胞中的糖类和蛋白质含量[41]。虫黄藻中糖类和蛋白质含量的提高, 提示海水酸化能够促进虫黄藻的光合作用, 包括促进光合作用相关酶类的蛋白含量增加以及光合作用产物(糖类)的累积。复合暴露组中虫黄藻的蛋白质含量增加幅度最大, 提示该条件下虫黄藻可能需要累积更多的蛋白质以抵御复合暴露带来的不利影响。此外, 相较于对照组水平, 其余处理组中虫黄藻的脂质累积均显著下降。与本研究类似, Napan等[42]观察到高浓度的重金属(包括Cu2+)暴露能够抑制微藻Scenedesmus obliquus的脂质累积。虫黄藻中脂质含量下降可能是由于环境变化诱导脂类物质转化为能够支持虫黄藻生命活动的其他成分。总体而言, 海水酸化和Cu2+单独以及复合暴露均能够扰乱虫黄藻的能量储备物质含量。
环境变化能够扰乱机体分配到基础代谢、生长和生存方面的能量。细胞内能量分配常被用于指示机体应对环境压力时能量状态的变化, 是反应生物生理状态的重要指标[30]。在本研究中, 单独酸化暴露以及酸化和Cu2+复合暴露均显著增加了虫黄藻的能量储备, 且复合暴露组增加幅度最大, 而单独Cu2+暴露则显著降低了虫黄藻的能量储备。结合储能物质含量可知, 单独酸化以及复合暴露通过增加糖类、蛋白质含量促进了虫黄藻中总能量的增加, 且复合处理组中蛋白质含量的显著增加促使能量储备显著高于单独酸化组。然而, 脂质含量的降低是Cu2+暴露导致虫黄藻能量储备减少的主要原因。同时, 单独酸化以及复合暴露显著降低了虫黄藻的能量消耗, 该过程可能与碳浓缩机制密切相关, 即使在Cu2+存在的情况下, 海水酸化也能够增加自由扩散进入虫黄藻细胞内的CO2含量, 从而减少了碳浓缩机制的能量消耗[43]。此外, 复合处理组中虫黄藻的能量消耗显著高于单独酸化处理组, 以及Cu2+处理组中虫黄藻的能量消耗显著高于对照组, 提示藻类需要消耗更多的能量用于抵御Cu2+的负面影响。单独酸化以及复合暴露显著降低了藻类能量消耗, 从而促进虫黄藻细胞内能量分配显著增加。单独Cu2+暴露显著增加了虫黄藻能量消耗, 同时降低了能量储备, 导致虫黄藻细胞内能量分配显著降低。总之, 海水酸化和Cu2+单独以及复合暴露均能够扰乱虫黄藻的能量收支平衡状态, 进而可能影响到虫黄藻的生长。
4 结论本文以虫黄藻C. goreaui为研究对象, 探讨了海水酸化和Cu2+暴露对其营养同化、能量消耗和分配的影响, 主要结论如下: 单独酸化暴露以及酸化和Cu2+复合暴露均能够导致虫黄藻细胞能量分配比例的增加和能量消耗的减少, 且复合暴露组虫黄藻能量储备增加。然而, 单独Cu2+暴露增加了虫黄藻的能量消耗, 同时降低了藻细胞的能量分配。本研究提示, 海水酸化和Cu2+单独暴露以及复合暴露能够扰乱虫黄藻的营养状态和能量分配, 可能会对虫黄藻的生长和繁殖构成潜在负面影响。
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