文章信息
- 王雪芹, 滕李超, 于华华, 邢荣娥, 李鹏程. 2022.
- WANG Xue-qin, TENG Li-chao, YU Hua-hua, XING Rong-e, LI Peng-cheng. 2022.
- 基于响应面法的活性肽制备工艺
- Optimization of monkfish active peptide using response surface methodology
- 海洋科学, 46(5): 42-53
- Marina Sciences, 46(5): 42-53.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20211117001
-
文章历史
- 收稿日期:2021-11-17
- 修回日期:2021-12-20
2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋药物与生物制品功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
生物活性肽是一类对人体生命活动有益的肽类化合物, 具有抗氧化、抗菌、抗疲劳、免疫调节、降血压等生物活性, 是近年来的研究热点[3]。生物活性肽的制备方法较多, 常见的有化学法和酶解法, 化学法通常反应剧烈, 耗时较长且污染环境; 酶解法因为具有反应条件温和, 成本较低, 安全性高等优点, 备受关注[4]。在蛋白酶解过程中, 酶类的选择尤为重要, 不同蛋白酶的酶切位点和酶解条件不同, 因此需要对酶解条件进行优化确定酶解反应的最优条件以得到目标蛋白肽[5]。如王晓玲等[6]采用木瓜蛋白酶制备带鱼蛋白水解肽, 在料液比为1∶10 g/mL, 加酶量20 000 U/g, 酶解温度45 ℃, pH 6.5, 酶解时间6 h的条件下其水解度高达71.3%; 周燕芳等[7]选择中性蛋白酶酶解海产低值鱼制备抗氧化肽, 在酶浓度1 400 U/g, 底物浓度3.0%, 酶解温度60 ℃, pH 7.0, 酶解时间2 h的最佳条件下制得的抗氧化肽1, 1-二苯基-3-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除率为68.63%; 羟自由基清除率为75.22%; 柏昌旺等[8]筛选出动物蛋白酶制备牡蛎短肽, 响应面实验结果显示: 料液比1∶3.9 g/mL, 酶解温度47 ℃, pH 6.5, 酶解时间3 h, 加酶量3 300 U/g的最佳条件下, 牡蛎短肽得率为58.53%, 相比原酶解工艺提高24.8%。
随着经济的快速发展和人们生活水平的不断提高, 人们逐渐认识到许多疾病均与人体内氧化产生的自由基有关, 当机体内的抗氧化物与氧化剂之间的平衡失常时, 就会导致氧化应激, 严重的话会造成氧化损伤, 从而影响机体健康[9]。因此, 我们需要寻求外源性抗氧化剂来清除体内过多的自由基, 以维持机体的健康。人工合成的抗氧化剂虽然具有较强的抗氧化作用, 但对人体有潜在的致畸和致癌等副作用[10], 而天然抗氧化剂因其安全无毒、来源广等优点被广泛研究。
海洋生物具有多样性、复杂性和特殊性等特点, 从而产生与陆地生物不同的机体防御系统。目前, 已从一些海洋生物包括大黄鱼[11]、鳕鱼[12]、海参[13]、鲱鱼[14]、牡蛎[15]、海藻[16]等体内发现存在的天然生物活性肽。其中以海洋生物抗氧化肽的研究较为广泛, 如从沙丁鱼[17]、鲐鱼[18]、牡蛎[19]、海藻[20]、海葵[21]等海洋生物资源中均获得活性较好的抗氧化肽。海洋生物蛋白源抗氧化肽可通过各种途径清除内源性和外源性自由基, 且具有抗氧化性强、种类多、副作用低等特点[9]。随着人们对食品品质及食品安全的要求越来越高, 抗氧化肽已被广泛应用于食品领域, 如肉类、海鲜类、水果蔬菜类及饮料类等食品加工业中, 以及化妆品和医药领域等。未来, 抗氧化肽将应用于人类生活的方方面面, 成为各学科学者们研究的热点。
本研究以
新鲜
实验采用的仪器与设备如下: 高速组织捣碎机(PHILIPS); DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司); 冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司); 数显恒温水浴锅(国华电器有限公司); 冷冻高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1.3 实验方法 1.3.1分别称取适量
蛋白酶 | 酶活力/ (U∙g–1) | pH | 酶解温度/℃ | 酶解时间/h |
木瓜蛋白酶 | 8.0×105 | 6.5 | 50 | 5 |
胰蛋白酶 | 2.5×105 | 8~8.5 | 45 | 5 |
胃蛋白酶 | 3.0×103 | 2.0 | 35 | 5 |
菠萝蛋白酶 | 6.0×105 | 6.5 | 35 | 5 |
酶解过程结束后, 将酶解液置于沸水中加热10 min, 钝化灭酶, 再用酸或碱调节酶解液的pH至中性, 4 ℃低温离心(10 000 r/min, 15 min), 上清液−20 ℃冷藏备用。分别测定各蛋白酶酶解液的DPPH自由基清除能力, 筛选最佳用酶。
1.3.3 单因素实验影响酶解反应的因素主要包括: 加酶量、pH值、酶解温度、酶解时间和液固比, 任一因素的改变, 均会对酶解反应的过程产生影响[23]。在前期实验确定的最佳蛋白酶的酶解条件基础上, 设计酶解反应的各个因素水平, 其他实验条件固定, 分别考察加酶量(600, 800, 1 000, 1 200, 1 500, 2 000 U/g), pH值(5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 8.0, 9.0)、酶解温度(30, 40, 50, 55, 60 ℃)、酶解时间(3, 4, 5, 6, 7, 8 h)和液固比(2∶1, 4∶1, 6∶1, 8∶1和10∶1)对DPPH自由基清除能力的影响, 实验做3次平行。
1.3.4 响应面优化实验在单因素实验结果的基础上, 进一步采用响应面分析法(Response Surface Methodology, RSM)对
DPPH自由基清除能力的测定方法参照文献[25]略作修改。样品组依次加入3.0 mL酶解产物和1.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液, 对照组依次加入3.0 mL 50%乙醇溶液和1.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液, 充分混合, 静置30 min, 于517 nm比色。同时用50%乙醇溶液做空白, 每个浓度重复3次, 实验结果用清除率E来表示:
$ E(\%)=\left(1-\frac{{A}_{样品}-{A}_{空白}}{{A}_{对照}-{A}_{空白}}\right)\times 100\% . $ | (1) |
羟自由基清除能力的测定方法参考文献[26]略作修改。向试管中依次加入1.0 mL不同质量浓度的酶解产物(终浓度为: 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10 mg/mL), 0.5mL EDTA-Fe溶液(2 mmol/L), 1.0 mL磷酸缓冲液(PBS, 150 mmol/L, pH7.4), 1.0 mL番红花红(360 µg/mL), 最后加入1.0 mL H2O2(3%), 混匀, 37 ℃水浴30 min, 于520 nm比色。空白组用缓冲溶液来代替样品, 对照组用缓冲液代替样品和过氧化氢, 同时用VC作对照。每个浓度重复3次, 实验结果用清除率E来表示:
$ E(\%)=\frac{{A}_{样品}-{A}_{空白}}{{A}_{对照}-{A}_{空白}}\times 100\% . $ | (2) |
在
序号 | 氨基酸 | 含量比例/% |
1 | 苏氨酸*(Thr) | 3.55 |
2 | 丝氨酸(Ser) | 3.43 |
3 | 谷氨酸(Glu) | 12.17 |
4 | 甘氨酸(Gly) | 4.28 |
5 | 丙氨酸(Ala) | 3.43 |
6 | 胱氨酸(Cys) | 0.32 |
7 | 缬氨酸*(Val) | 4.04 |
8 | 蛋氨酸*(Met) | 1.99 |
9 | 异亮氨酸*(Ile) | 3.49 |
10 | 亮氨酸*(Leu) | 6.02 |
11 | 酪氨酸(Tyr) | 1.87 |
12 | 苯丙氨酸*(Phe) | 3.01 |
13 | 赖氨酸*(Lys) | 7.47 |
14 | 组氨酸(His) | 1.20 |
15 | 精氨酸(Arg) | 4.64 |
16 | 脯氨酸(Pro) | 2.29 |
∑AA | 63.21 | |
∑EAA | 29.58 | |
∑EAA/∑NEAA | 0.88 | |
∑EAA/∑AA | 0.47 | |
注: ∑AA表示氨基酸总量; ∑EAA表示必需氨基酸含量; ∑NEAA表示非必需氨基酸含量, *表示必需氨基酸。 |
选择胰蛋白酶, 胃蛋白酶, 木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶作为实验用酶。分别称取适量鱼糜, 按照液固比为6∶1加入去离子水, 调节至各蛋白酶最适宜的酶解温度和pH值, 加酶量1 000 U/g, 酶解时间5 h。酶解过程结束后, 灭酶, 低温离心, 取上清液测定各蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除能力。
从图 1可以看出, 木瓜蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除能力最高, 达到了72.08%, 与其他3种蛋白酶酶解产物的抗氧化活性达到了显著性差异(P<0.05), 其次是胃蛋白酶和菠萝蛋白酶, 而胰蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除能力最低, 为64.62%。因此, 实验后期选择木瓜蛋白酶为最佳用酶进行
任一酶解反应因素的改变都会影响酶解产物的活性。本实验采用单因素实验对各个因素水平进行分析, 筛选出木瓜蛋白酶在酶解反应中各个因素的最优水平, 为后续的响应面实验提供理论依据。
2.4.1 加酶量选用液固比6∶1, 酶解时间5 h, 酶解温度50 ℃, pH 6.5, 蛋白酶加酶量分别为600, 800, 1 000, 1 200, 1 500, 2 000 U/g。
从图 2可以看出, 随着加酶量从800 U/g增加到1 000 U/g, 酶解产物的DPPH自由基清除率逐渐增加并达到最高值82.78%; 随着加酶量的进一步增加, 酶解产物的DPPH自由基清除率开始下降, 且酶解液的颜色加深。因此, 选择加酶量1 000 U/g木瓜蛋白酶为最佳加酶量。
2.4.2 pH选用6∶1液固比, 加酶量为1 000 U/g, 酶解时间5 h, 酶解温度50 ℃, pH值分别为5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 8.0, 9.0。
由于每种蛋白酶都有最适的pH值, 当最适pH值发生较大偏离时, 维持蛋白酶三维结构的共价键受到离子作用的干扰, 导致酶蛋白自身会发生变性[29]。从图 3可以看出, pH值为5.0~7.0, 酶解产物的DPPH自由基清除率呈上升趋势, 并在pH为7.0的时候达到最高值83.27%; 随着pH的进一步升高, 偏离木瓜蛋白酶的最适pH值范围, 酶解产物的DPPH自由基清除率显著性下降, 当pH值为9.0时仅为74.10%, 较最高值相比, 降幅达到12.37%。因此, 选择pH值为7.0进行后续实验。
2.4.3 酶解温度选用液固比6∶1, 加酶量为1 000 U/g, 酶解时间5 h, pH值为6.5, 酶解温度分别为30, 40, 50, 55, 60 ℃。
图 4结果显示, 酶解温度从30 ℃升高为50 ℃时, 酶解产物的DPPH自由基清除率与酶解温度成正比, 这表明在一定温度范围内, 蛋白酶的活性与温度呈正相关性, 随着温度的升高, 酶的水解效率增强, 生成活性肽的抗氧化活性增强, 在酶解温度为50 ℃的时候, 酶解产物的DPPH自由基清除率达到了82.78%。随着酶解温度继续升高到55 ℃, 酶解产物的DPPH自由基清除率显著性下降, 说明当温度高于某一点时, 酶蛋白的特定结构会发生改变, 酶的活性也会降低甚至失活[30]。虽然在温度升高到60 ℃的时候, DPPH自由基清除率有所升高, 但仍未达到最高值, 因此, 选择酶解温度为50 ℃进行后续实验。
2.4.4 酶解时间选用6∶1液固比, 加酶量为1 000 U/g, 酶解温度为50 ℃, pH值为6.5, 酶解时间分别为3, 4, 5, 6, 7, 8 h。
从图 5可以看出, 酶解时间在3~4 h时, 酶解产物的DPPH自由基清除率还未有明显变化, 但当酶解时间达到5 h时, DPPH自由基清除率显著升高, 达到82.03%, 并随着酶解时间的延长趋于平衡。分析原因可能是随着酶解时间的延长, 底物逐渐被消耗, 酶的催化效率降低, 酶解反应趋于平衡, 得到的酶解产物抗氧化活性也不再升高。因此, 选择酶解时间5 h进行后续实验。
2.4.5 液固比加酶量为1 000 U/g, 酶解温度为50 ℃, pH值为6.5, 酶解时间为5 h, 液固比分别为2∶1, 4∶1, 6∶1, 8∶1和10∶1。
图 6表明, 随着液固比的增加, 酶解产物的DPPH自由基清除率显著性增加, 在液固比为6∶1的时候达到最高值, 为80.05%, 然而当液固比达到10∶1时, DPPH自由基清除率开始下降。这是由于在适宜的液固比下, 底物与蛋白酶充分结合, 有利于水解产物的形成, 其抗氧化活性较好; 当料液比增加到一定程度时, 底物浓度过低导致酶解效率低, 水解度降低[31]。因此, 选择料液比6∶1进行后续实验。
2.5 响应面优化实验制备在单因素实验结果的基础上, 进一步采用响应面优化实验对酶解反应的五大因素水平进行筛选, 以酶解产物的DPPH自由基清除率为评价指标, 分析木瓜蛋白酶对
实验因素 | 代码 | 编码水平 | ||
–1 | 0 | 1 | ||
加酶量/(U∙g–1) | A | 800 | 1 000 | 1 200 |
pH | B | 6 | 7 | 8 |
酶解温度/℃ | C | 40 | 50 | 60 |
酶解时间/h | D | 4 | 5 | 6 |
液固比 | E | 4 | 6 | 8 |
响应面实验设计与结果见表 5。实验结果表明, 在46组实验中, DPPH自由基清除率的范围为67.10%~ 81.63%, 不同因素水平下酶解产物的DPPH自由基清除能力不同。通过Design Expert 12.0软件分析, 得出二次多项回归方程如下:
$ \begin{array}{l} Y(\% ) = 77.23 - 0.515\;6A - 0.207\;0B - 0.944\;9C + \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;0.405\;9D - 0.377\;8E + 0.890\;3AB - 1.56AC - \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;0.850AD - 0.811\;7AE - 1.04BC + 3.21BD + \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;1.85BE - 2.98CD + 1.98CE - 1.33DE + 1.32{A^2} - \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;2.05{B^2} - 3.42{C^2} + 0.055\;8{D^2} - 1.19{E^2}, \end{array} $ | (3) |
编号 | 加酶量/(U∙g–1) | pH | 温度/℃ | 酶解时间/h | 液固比 | DPPH自由基清除率/% |
1 | 800 | 6 | 50 | 5 | 6 | 77.21 |
2 | 1 200 | 6 | 50 | 5 | 6 | 75.93 |
3 | 800 | 8 | 50 | 5 | 6 | 75.36 |
4 | 1 200 | 8 | 50 | 5 | 6 | 77.64 |
5 | 1 000 | 7 | 40 | 4 | 6 | 70.61 |
6 | 1 000 | 7 | 60 | 4 | 6 | 74.86 |
7 | 1 000 | 7 | 40 | 6 | 6 | 78.50 |
8 | 1 000 | 7 | 60 | 6 | 6 | 70.83 |
9 | 1 000 | 6 | 50 | 5 | 4 | 76.78 |
10 | 1 000 | 8 | 50 | 5 | 4 | 72.65 |
11 | 1 000 | 6 | 50 | 5 | 8 | 72.08 |
12 | 1 000 | 8 | 50 | 5 | 8 | 75.36 |
13 | 800 | 7 | 40 | 5 | 6 | 74.97 |
14 | 1 200 | 7 | 40 | 5 | 6 | 76.60 |
15 | 800 | 7 | 60 | 5 | 6 | 77.01 |
16 | 1 200 | 7 | 60 | 5 | 6 | 72.41 |
17 | 1 000 | 7 | 50 | 4 | 4 | 74.83 |
18 | 1 000 | 7 | 50 | 6 | 4 | 78.23 |
19 | 1 000 | 7 | 50 | 4 | 8 | 77.01 |
20 | 1 000 | 7 | 50 | 6 | 8 | 75.10 |
21 | 1 000 | 6 | 40 | 5 | 6 | 71.70 |
22 | 1 000 | 8 | 40 | 5 | 6 | 74.29 |
23 | 1 000 | 6 | 60 | 5 | 6 | 71.41 |
24 | 1 000 | 8 | 60 | 5 | 6 | 69.83 |
25 | 800 | 7 | 50 | 4 | 6 | 78.50 |
26 | 1200 | 7 | 50 | 4 | 6 | 79.05 |
27 | 800 | 7 | 50 | 6 | 6 | 80.41 |
28 | 1 200 | 7 | 50 | 6 | 6 | 77.55 |
29 | 1 000 | 7 | 40 | 5 | 4 | 76.33 |
30 | 1 000 | 7 | 60 | 5 | 4 | 69.97 |
31 | 1 000 | 7 | 40 | 5 | 8 | 71.29 |
32 | 1 000 | 7 | 60 | 5 | 8 | 72.84 |
33 | 800 | 7 | 50 | 5 | 4 | 77.34 |
34 | 1 200 | 7 | 50 | 5 | 4 | 76.98 |
35 | 800 | 7 | 50 | 5 | 8 | 78.50 |
36 | 1 200 | 7 | 50 | 5 | 8 | 74.89 |
37 | 1 000 | 6 | 50 | 4 | 6 | 78.79 |
38 | 1 000 | 8 | 50 | 4 | 6 | 70.71 |
39 | 1 000 | 6 | 50 | 6 | 6 | 72.73 |
40 | 1 000 | 8 | 50 | 6 | 6 | 77.49 |
41 | 1 000 | 7 | 50 | 5 | 6 | 77.05 |
42 | 1 000 | 7 | 50 | 5 | 6 | 77.05 |
43 | 1 000 | 7 | 50 | 5 | 6 | 77.19 |
44 | 1 000 | 7 | 50 | 5 | 6 | 77.73 |
45 | 1 000 | 7 | 50 | 5 | 6 | 77.05 |
46 | 1 000 | 7 | 50 | 5 | 6 | 77.32 |
其中, Y代表酶解产物的DPPH自由基清除率, A, B, C, D, E分别代表加酶量、pH值、酶解温度、酶解时间和液固比的各个编码值。
通过F检验来判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性, 结果表明, 整体模型的P值小于0.000 1, 模型F值等于37.04均表示该二次方程模型高度显著。同时A, C, D, E, AB, AC, AD, AE, BC, BD, BE, CD, CE, DE, A2, B2, C2, E2对响应面值均有显著性影响(P<0.05)。此外, 模型失拟项不显著, 模型决定系数R2 =0.967 4, 说明该模型方程的拟合程度较好, 预测值与实测值之间具有高度的相关性, 用该模型能较好地优化实验方案。
2.5.2 响应面优化实验作图分析由上述方差分析结果可以看出, 加酶量、酶解温度、酶解时间和液固比4个因素对酶解产物的DPPH自由基清除率影响较大, 且加酶量和pH值、pH值和液固比、酶解温度和酶解时间、酶解时间和液固比等两因素水平之间的相互作用也达到了显著性。响应面图形是响应值分别对应5个自变量所构成的一个三维空间图, 可直观反映出各自变量对响应值的影响。
图 7为根据多元二次回归模型得到的响应面曲线图, 从图中可以看出各响应面曲线图均与坐标轴有一定的角度, 说明两因素交互作用均有不同程度的显著性[23]。从图 7a—d可以看出, 当考察pH、酶解温度、酶解时间和液固比与加酶量之间的相互作用时, 酶解产物的DPPH自由基清除率随着pH和酶解时间的增加而显著升高, 说明加酶量与pH、加酶量与酶解时间的交互作用显著; 酶解产物的DPPH自由基清除率随着酶解温度和液固比的增加先缓慢升高后降低, 说明加酶量与酶解温度、加酶量与液固比在一定水平范围内交互作用显著。分析可能原因为温度升高导致蛋白酶活力下降, 液固比升高, 底物浓度降低, 蛋白酶的酶解效率降低, 间接导致了酶解产物的活性降低。
从图 7e和图 7f可以看出, 当考察酶解温度和酶解时间与pH之间的相互作用时, 酶解产物的DPPH自由基清除率随着酶解时间的增加显著升高, 随着酶解温度的增加呈先上升后缓慢下降的趋势, 说明pH与酶解时间交互作用显著, 与酶解温度在40~ 50 ℃交互作用显著。
图 7g和图 7j考察了pH和酶解时间与液固比之间的相互作用, 从图中可以看出, 酶解产物的DPPH自由基清除率随着pH和酶解时间的增加而升高, 且随着酶解时间的增加, DPPH自由基清除率增加的趋势较明显。此外, 从图 7h和图 7i可看出, 酶解产物的DPPH自由基清除率随着酶解时间和液固比的增加缓慢升高, 说明酶解时间和液固比与酶解温度间有一定的交互作用。
2.5.3 响应面法验证性实验根据Design Expert 12.0所建立的数学模型进行参数最优分析, 得到高抗氧化活性的
在响应面优化实验中, 我们选择实验所得酶解液来直接测定其DPPH自由基清除率, 保证实验的时效性, 同时减少因冷冻干燥过程造成一定的实验误差。后续实验中, 我们进一步对最优酶解条件下获得的
羟自由基是目前已知活性氧自由基中对生物体毒性最大、危害最大的一种自由基, 过量的羟自由基会引起机体功能紊乱, 乃至机体病变和死亡[32], 因此, 本实验进一步讨论了
杨会成等[33]研究了
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