2022, Vol. 46
文章信息
- 吴蒙, 李墨非, 孙黎. 2022.
- WU Meng, LI Mo-fei, SUN Li. 2022.
- 大菱鲆CD55负调控补体激活及其广谱细菌结合能力
- Turbot Scophthalmus maximus CD55 negatively regulates complement activation and binds a variety of bacteria
- 海洋科学, 46(7): 24-31
- Marine Sciences, 46(7): 24-31.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20220410001
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文章历史
- 收稿日期：2022-04-10
- 修回日期：2022-04-29
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 天津师范大学 生命科学学院 天津市动植物抗性重点实验室, 天津 300387
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China
补体系统是免疫系统重要的组成部分, 在先天性免疫反应和适应性免疫反应中发挥着至关重要的作用[1]。补体系统由30多种存在于血清、组织液和细胞膜表面的蛋白质构成, 主要通过经典途径、旁路途经和凝集素途径这3种方式激活[2]。C3的活化是所有补体激活途径中的关键步骤, 在3条补体激活途径中共生成两种类型的C3转化酶, 即经典途径和凝集素途径生成的C3转化酶为C4b2a以及旁路途径生成的C3转化酶C3bBb[3]。C3转化酶进一步激活后续的补体通路[4]。补体系统激活后能够在靶细胞表面组装形成膜攻击复合物(MAC), 从而引起靶细胞裂解死亡[5]。在正常情况下, 补体系统通过严谨的激活调控机制可以清除入侵机体的病原微生物, 但在补体系统功能失调的情况下, 补体系统的激活会危害宿主自身的健康细胞[6]。为了防止损伤自身细胞, 宿主体内存在多种补体调控蛋白可以调节补体系统的激活, 如CD55、C1抑制剂(C1INH)、CD35、CD46和CD59, 这些调控蛋白能够防止补体的异常激活, 从而保护自身细胞[7]。CD55蛋白, 也被称为补体衰变加速因子(DAF), 哺乳动物中CD55蛋白是一种大约40 kDa的细胞外糖蛋白, 通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接固定在细胞膜上, 广泛分布在不同的组织细胞表面和细胞分泌物中[8]。在哺乳动物的研究中表明, CD55蛋白能够通过加速C3转化酶和C5转化酶中C2a和Bb因子的衰变解离而抑制补体系统激活[9], 从而阻止MAC在细胞膜上的生成。CD55蛋白在体内表达异常可引起自身免疫性疾病, 如阵发性夜间血红蛋白尿症[10]。另外, 细胞表面的CD55蛋白可以作为病原微生物(如致病性大肠杆菌(Escherichia coli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和埃可病毒(echovirus)等)感染细胞的受体[11]。目前, 针对CD55蛋白的研究主要集中在哺乳动物中, 在硬骨鱼还未见有相关的研究报道。
大菱鲆(Scophthalmus maximus)是中国主要水产养殖鱼类之一, 具有重要的经济价值。本研究以大菱鲆CD55(SmCD55)蛋白为研究对象, 首次在硬骨鱼中探究了CD55蛋白的生物学功能。作者克隆得到了SmCD55基因, 检测了SmCD55基因在大菱鲆组织中的表达情况, 获得了重组表达的SmCD55蛋白(rSmCD55), 检测了rSmCD55蛋白对大菱鲆补体系统的激活, 探索了rSmCD55蛋白与水产病原菌等细菌的相互作用, 研究结果提升了我们对硬骨鱼补体调控系统的认识。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物健康大菱鲆(500±20 g)采购自山东省青岛市一鱼类养殖场。在进行实验前, 将大菱鲆在持续充氧的21 ℃水箱中暂养两周。
1.1.2 菌株和培养条件本实验中所使用的菌株包括大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus)。鳗弧菌、哈维氏弧菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞杆菌和枯草芽孢杆菌在28 ℃条件下在Luria–Bertani broth (LB) 培养基中培养; E. coli和M. luteus在37 ℃条件下在LB培养基中培养; S. iniae在28 ℃条件下在Trypticase Soy Broth (TSB)培养基中培养。
1.1.3 实验试剂RNA提取试剂盒(FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2)、实时荧光定量PCR试剂盒(AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix)和同源重组试剂盒购自诺维赞公司; 反转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix)购自东洋纺公司; 克隆(DH5α)和表达(BL21)感受态大肠杆菌购自擎科生物技术有限公司; Hank’s平衡盐溶液购自索莱宝公司; 脱纤维羊血红细胞购自贝博公司; 小鼠抗his抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体购自Abcam公司。
1.2 方法 1.2.1 SmCD55基因序列分析利用美国国家生物技术信息中心(NCBI) 数据库获得SmCD55基因的序列(登录号: XP_035488277.1)信息, 采用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)进行信号肽分析, 采用SMART在线工具进行结构域分析, 利用DNAMAN软件进行多重序列比对, 使用MEGA软件进行进化树分析。
1.2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SmCD55基因的表达qRT-PCR方法参照以前的研究[4]。为了检测正常生理条件下SmCD55基因的表达, 在无菌条件下, 取5条大菱鲆的鳃、肌肉、脾、头肾、肠、血、脑、心和肝组织, 按照RNA提取试剂盒说明提取总RNA, 使用Nanodrop测定260/280吸光度比值来检测RNA的质量。cDNA的合成借助东洋纺公司的反转录试剂盒进行。采用诺维赞公司的AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行qRT-PCR, 内参基因选择β-actin[12], 实验中所用到的引物为: β-actin-RT-F (5′-ATGGATGAGGAAATCGCTGCC-3′)、β-actin-RT-R (5′-CTCCCTGATGTCTGGGTCGTC-3′)、SmCD55-RT-F (5′-GCCAAGTGTGAAACCGTGAC-3′)、SmCD55-RT-R (5′-AGGAGGCCCAGAGTCGTATT-3′)。qRT-PCR反应体系为20 μL, 包括qPCR Master Mix 10 μL, 引物各1 μL, ddH2O 6 μL, 模板2 μL。采用2–ΔΔCT法分析SmCD55基因的表达水平[13]。
1.2.3 SmCD55重组蛋白(rSmCD55)的表达和纯化以SmCD55基因cDNA序列为模板, 用引物SmCD55-F(5′-GAACAGATTGGTGGTGGATCCATGA ACTGCCCTAAACCTCGGGCA-3′, 下划线部分为同源臂序列)和SmCD55-R(5′-GTGGTGGTGGTGGT GCTCGAGAGGTGCATATTCGATACGCGT-3′, 下划线部分为同源臂序列)扩增不包含信号肽(27~298位)的SmCD55胞外段。PCR产物经过胶回收, 通过同源重组的方式插入表达质粒pET28a-Sumo[4]。将重组产物转化到克隆感受态大肠杆菌DH5α中, 然后挑选阳性克隆并进行测序, 测序正确的质粒命名为pEtSmCD55-Sumo。将质粒pEtSmCD55-Sumo(表达重组蛋白rSmCD55-Sumo)和pET28a-Sumo(表达重组对照蛋白rSumo)转化到表达大肠杆菌BL21中。重组蛋白的纯化按之前报道的方法进行[14]。将菌株接种到LB培养基中, 37 ℃培养至对数生长期, 添加终浓度为0.1 mmol/L的异丙基-ß-D-硫代半乳糖(IPTG), 于16 ℃培养箱中诱导12 h后收集菌体。对菌体进行超声破碎, 离心后收集上清。将含有重组蛋白rSmCD55-Sumo的上清液中加入Sumo蛋白酶去除融合蛋白中的Sumo标签, 然后利用镍柱纯化rSmCD55蛋白。rSumo按照同样方法纯化。最后, 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测纯化得到的蛋白。
1.2.4 检测rSmCD55蛋白处理后血清的溶血活性和杀菌活性将大菱鲆血清用Hank’s平衡盐溶液稀释8倍、16倍和32倍, 分别与rSmCD55蛋白、rSumo蛋白或PBS(对照)混合, rSmCD55蛋白和rSumo蛋白的终质量浓度为100 μg/mL。室温下孵育1 h。在溶血试验中, 将羊血红细胞用Hank’s平衡盐溶液洗涤并制备细胞浓度为1×109细胞/mL的重悬液。在96孔板中, 将10 μL(约107细胞)的羊红细胞重悬液与100 μL蛋白或PBS处理后的不同稀释度的血清混合, 22 ℃孵育20 min, 然后离心10 min(4 000 r/min), 缓慢吸出上清并测定OD450。为方便比较, 将血清稀释8倍时对照组的溶血活性设为100%, 以此计算其他组的溶血活性。在杀菌试验中, 将大肠杆菌用Hank’s平衡盐溶液洗涤并制备浓度为1×106 CFU/mL的细菌重悬液。取300 μL蛋白或PBS处理后的不同稀释度的血清与等体积的细菌重悬液均匀混合, 室温下孵育1 h。孵育完成后, 将混合液进行梯度稀释并均匀涂布到LB固体平板上, 随后将平板倒置放置于37 ℃培养箱中, 12 h后进行平板计数。为方便比较, 将血清稀释8倍时对照组的杀菌活性设为100%, 以此计算其他组的杀菌活性。
1.2.5 检测rSmCD55蛋白结合细菌以及对细菌生存的影响将大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞杆菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、海豚链球菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌进行接种培养至OD600为0.8, 细菌离心后用PBS清洗并重悬于PBS至108 CFU/mL。细菌与蛋白质的相互作用按照之前的报道用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测[15]。为了检测rSmCD55蛋白对细菌生存的影响, 将细菌悬液与终浓度为100 μg/mL的rSmCD55蛋白、rSumo蛋白或PBS在22 ℃条件下孵育2 h。然后稀释混合液, 均匀涂布到含琼脂的培养平板上, 在37 ℃或28 ℃培养箱中培养24 h, 计数细菌数量。
2 结果 2.1 SmCD55蛋白序列分析SmCD55蛋白由344个氨基酸残基组成, 理论分子量为36.8 kDa, 预测等电点(pI)为7.85。结构预测分析表明, SmCD55蛋白序列N-端1~26位氨基酸残基为信号肽(Signal peptide)序列, 其后有3个补体调控蛋白(CCP)结构域(28~86氨基酸残基、91~143氨基酸残基和148~204氨基酸残基)。选取硬骨鱼和哺乳动物CD55蛋白的同系物与SmCD55蛋白进行序列比对, 结果表明, SmCD55蛋白与所选同系物序列的相似性在27%~68%(图 1), 其中SmCD55蛋白与射水鱼(Toxotes jaculatrix)CD55蛋白相似性最高(68%), 在硬骨鱼中与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)CD55蛋白相似性最低(37%), 在哺乳动物中与人类(Homo sapiens)的CD55蛋白相似性最低(27%)。构建的进化树分析表明, SmCD55蛋白与硬骨鱼类CD55蛋白分子在进化上关系较近, 与射水鱼关系最近, 与虹鳟关系较远(图 2)。用于和SmCD55蛋白序列进行比对和进化树分析的物种包括: Toxotes jaculatrix, XP_ 040890444.1; Seriola dumerili, XP_022617127.1; Sander lucioperca, XP_031157844.1; Sparus aurata, XP_030277131.1; Epinephelus lanceolatus, XP_033483710.1; Cynoglossus semilaevis, XP_024915538.1; Oreochromis niloticus, XP_ 005458494.1; Oncorhynchus mykiss, XP_021425213.2; Rattus norvegicus, XP_006249779.1; Homo sapiens, ANF06964.1。
2.2 SmCD55基因的组织特异性表达谱在健康大菱鲆中, 利用qRT-PCR技术检测SmCD55基因在大菱鲆各个组织中的表达情况。实验结果表明, 大菱鲆肌肉、肠、鳃、头肾、心、脾、血、肝和脑组织中均有SmCD55基因的表达, 其中在脑组织中表达量最高(图 3)。
2.3 rSmCD55蛋白对补体激活的影响为了研究SmCD55蛋白在补体激活中的作用, 作者利用原核表达系统纯化出了rSmCD55蛋白和rSumo蛋白(图 4)。采用不同浓度的rSmCD55蛋白、rSumo蛋白或PBS (对照组)处理大菱鲆血清, 然后检测血清的溶血活性和杀菌活性。实验结果表明, 在血清稀释8倍和16倍时, 用rSmCD55蛋白处理后血清的溶血活性显著低于对照组, 8倍和16倍稀释血清的溶血活性分别下降了5%和21%; 而用对照蛋白rSumo处理的血清在溶血活性方面没有显著变化(图 5a)。在血清稀释8倍、16倍和32倍时, 用rSmCD55蛋白处理后血清的杀菌活性显著降低; 相比对照组, rSmCD55蛋白处理后的8倍、16倍和32倍稀释血清的杀菌活性分别下降了45%、75%和46%(图 5b)。
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| 图 1 SmCD55蛋白同系物序列的比对 Fig. 1 Alignment of the SmCD55 protein homologous sequences 括号中的数字表示SmCD55蛋白和被比较序列的整体相似度。完全相同的氨基酸残基用蓝色标记, 相似度≥75%的氨基酸残基用黑色标记, 相似度≥50%的氨基酸残基用灰色标记。Signal peptide和CCP (complement control protein)结构域用红色箭头在图中标记 The numbers in parentheses represent the overall similarity between SmCD55 protein and the sequence being compared. Identical amino acid residues were marked in blue, those with similarity ≥75% were marked in black, and those with similarity ≥50% were marked in gray. The signal peptide and CCP (Complement Control Protein) domains are marked with red arrows |
为了检测rSmCD55蛋白是否能够与细菌相互作用, 将不同浓度的rSmCD55蛋白或rSumo蛋白与大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞杆菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、海豚链球菌、枯草芽孢杆菌或藤黄微球菌孵育。ELISA结果显示, rSmCD55蛋白能够以浓度依赖的方式结合所有检测的细菌(图 6)。与rSmCD55蛋白结合最强的细菌是哈维氏弧菌, 结合最弱的细菌是迟缓爱德华氏菌。进一步检测了rSmCD55蛋白是否对细菌具有杀伤作用。结果显示, rSmCD55蛋白对这些细菌没有明显的杀伤作用(数据未展示)。
3 讨论本研究对SmCD55蛋白进行了序列分析、组织分布和生物功能的研究。序列分析表明, SmCD55蛋白氨基酸序列与射水鱼CD55蛋白相似度最高, 在进化上与硬骨鱼CD55蛋白同系物距离最近。预测的SmCD55蛋白氨基酸序列中含有一个信号肽和3个CCP功能域。之前的研究表明, 哺乳动物CD55蛋白中存在4个CCP功能域, 其中第2、3和4个CCP功能域可以特异性地结合旁路途径的C3转化酶(C3bBb), 引起Bb片段与C3b结合的不稳定性, 从而释放Bb片段, 造成C3转化酶的衰变解离[16, 17]。CCP功能域在SmCD55蛋白的保守性存在表明, SmCD55蛋白可能在补体激活调控中具有与哺乳动物CD55蛋白相似的生物学功能。CD55蛋白在哺乳动物体内分布十分广泛, 存在于粒细胞、单核细胞、淋巴以及许多上皮细胞的表面[8, 18]。在本研究中, 作者发现SmCD55基因在所有被检测的9种大菱鲆组织中都表达, 说明SmCD55蛋白可能与哺乳动物CD55蛋白类似, 在保护自身组织细胞免受补体损伤中发挥作用。
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| 图 2 SmCD55蛋白的系统进化分析 Fig. 2 Phylogenetic analysis of SmCD55 protein 利用MEGA 6.0软件, 使用邻位相连法构建系统进化树, 测定了大菱鲆SmCD55蛋白与其他硬骨鱼和哺乳动物CD55蛋白在进化上的关系 The phylogenetic tree of turbot SmCD55 protein was constructed by ortho-linkage method using MEGA 6.0 software, and the evolutionary relationship between SmCD55 protein and other teleost and mammals was determined |
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| 图 3 SmCD55基因在健康大菱鲆组织中的表达情况 Fig. 3 SmCD55 expression in tissues of healthy Scophthalmus maximus 利用实时荧光定量PCR方法, 检测健康大菱鲆肌肉、肠、鳃、头肾、心、脾、血、肝和脑组织中SmCD55基因的表达。为了便于各组织间比较, 作者将肌肉组织表达水平设为1。数据是3次实验数据的平均值, 用±表示标准误差 The expression of SmCD55 gene in muscle, intestine, gill, head kidney, heart, spleen, blood, liver and brain of healthy turbot was detected by real-time quantitative PCR. In order to facilitate the comparison between tissues, the authors set the expression level of muscle tissue as 1. Data are the means of three independent assays and presented as means±SEM |
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| 图 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析rSmCD55蛋白 Fig. 4 SDS-PAGE analysis of rSmCD55 protein 泳道1为蛋白标准Marker, 泳道2为rSumo蛋白, 泳道3为rSmCD55蛋白。将纯化后的蛋白利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析, 利用考马斯亮蓝R-250染色进行观察 Lane 1 was the protein standard Marker, lane 2 was rSumo protein, and lane 3 was rSmCD55 protein. The purified protein was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and observed by Coomassie bright blue R-250 staining |
已有报道表明, 从人红细胞中纯化的天然CD55蛋白可以插入兔(Oryctolagus cuniculus)和羊(Ovis aries)的红细胞膜中, 并抑制人类补体对兔和羊红细胞的裂解能力[9], 这种抑制作用是通过CD55蛋白加速C3转化酶的衰变解离造成的[18]。CD55蛋白异常可导致疾病, 例如, 阵发性夜间血红蛋白尿症是一种以红细胞对补体溶血活性异常敏感为特征的自身免疫性疾病, 红细胞表面CD55蛋白表达缺陷是造成这种疾病的主要原因[19-21]。在我们的研究中, 发现用rSmCD55蛋白处理的大菱鲆血清的溶血活性和杀菌活性明显降低, 说明rSmCD55蛋白抑制了大菱鲆补体系统的激活, 是一种补体激活的负调控因子。
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| 图 5 rSmCD55蛋白对补体激活的影响 Fig. 5 Effect of rSmCD55 protein on complement activation 用rSmCD55蛋白、rSumo蛋白或PBS (对照) 处理不同稀释度的大菱鲆血清, 随后测定血清的溶血活性(a)和杀菌活性(b)。数据以平均值±表示标准误差(n = 3)表示。n为实验次数。*. P < 0.05, **. P < 0.01 The serum of turbot was treated with rSmCD55 protein, rSumo protein or PBS (Control), and the hemolytic activity (a) and bactericidal activity (b) of the serum were determined. Data are shown as means±SEM (n = 3). n, the number of times the experiment was performed. *. P < 0.05, **. P < 0.01 |
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| 图 6 rSmCD55蛋白与细菌的结合情况 Fig. 6 Binding of rSmCD55 protein to bacteria 将大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞杆菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、海豚链球菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌分别与不同浓度的rSmCD55蛋白孵育, 对照组细菌与PBS孵育, 利用ELISA法检测细菌与蛋白的结合。数据是3次独立实验的平均值, 用±表示标准误差 Escherichia coli、Edwardsiella tarda、Pseudomonas fluorescens、Vibrio anguillarum、Vibrio harveyi、Streptococcus iniae、Bacillus subtilis and Micrococcus luteus were incubated with different concentrations of rSmCD55 protein, respectively. The control group was incubated with PBS, and the binding between bacteria and protein was detected by ELISA. Data are the means of three independent assays and presented as means±SEM |
人类CD55蛋白在所有暴露于血清的细胞上都高水平表达。这种广泛性表达使得CD55蛋白被某些病原微生物利用, 成为微生物感染宿主细胞的受体[22]。NOWICKI等[23-24]首次报道了人类CD55蛋白可以被泌尿系统致病性大肠杆菌结合并充当细菌感染细胞的受体。幽门螺杆菌是一种人类常见病原菌, 其诱导多种胃部疾病。研究表明, 在幽门螺杆菌感染后, 胃组织细胞中CD55蛋白表达增加, 并且与幽门螺杆菌结合, 在宿主-病原体的相互作用中充当病原的细胞受体[11]。在本研究中, ELISA结果显示rSmCD55蛋白可以结合多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌, 包括常见的鱼类病原菌, 但这种结合作用并不影响细菌的生存与繁殖。鉴于上述哺乳动物CD55蛋白在几种病原体黏附和入侵宿主细胞中的作用, 我们推测, SmCD55蛋白有可能作为病原菌感染大菱鲆组织细胞的受体, 病原菌能够通过结合CD55蛋白逃逸鱼类血清的杀伤作用, 达到感染宿主细胞的目的。这种推测的正确性有待将来的研究检验。
4 结论综上所述, 研究结果表明, SmCD55蛋白是哺乳动物CD55蛋白的同系物, 在健康大菱鲆的多种组织中呈组成型表达。rSmCD55蛋白可以抑制大菱鲆补体系统的激活, 显著降低血清补体的溶血活性和杀菌活性。另外, rSmCD55蛋白可以与包括水产致病菌在内的多种细菌结合。这些结果表明大菱鲆CD55蛋白在补体系统的激活中起负调控作用, CD55蛋白也可能作为病原菌在细胞表面的受体, 协助病原菌逃逸宿主补体的杀伤。因此, CD55蛋白不仅在鱼类自身免疫调控中发挥重要作用, 而且可能参与病原感染过程。这些结果为鱼类补体激活调控机制提供了新的认知。
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