软骨鱼类作为海洋生态系统中的重要参与者, 对维持海洋生态系统的稳定发挥着重要调控作用^[1]。然而, 近年来, 由于全球气候的变化、渔业无差别捕捞以及鱼翅等软骨鱼类制品交易的泛滥, 导致软骨鱼类的生存面临严峻挑战。目前, 约有70%海洋鲨类和鳐类的野生种群资源量出现下降, 部分物种甚至濒临灭绝^[2]。同时, 由于软骨鱼类具有生长速度缓慢、繁殖力低、胚胎发育周期长等特点, 使得在面对环境的剧烈变化时, 软骨鱼类野生种群数量很难在短时间内快速回复^[3-5]。开展软骨鱼类保育工作, 保护海洋生物多样性成为亟待解决的问题。

孔鳐(Okamejei kenojei), 俗称老板鱼, 隶属软骨鱼纲(Chondrichthyes)、鳐目(Rajiformes)、鳐科(Rajidae)、短吻鳐属(Okamejei)^[6], 是中国北方沿海地区代表性的软骨鱼类, 其野生种群的资源量也面临着日益衰退的问题^[7]。目前, 孔鳐已被IUCN组织列为易危物种, 开展孔鳐人工保育工作成为保护孔鳐种质资源的重要内容。虽然各国学者已对孔鳐的繁殖习性以及种群遗传结构进行了部分研究^[8-11], 但是针对孔鳐性腺的结构和生殖细胞发育过程的研究还十分有限。开展孔鳐生殖系统相关研究对于软骨鱼类的繁殖调控与保育具有重要参考价值。本研究利用组织切片技术对成年孔鳐的雄性生殖系统的组织结构、精子成熟过程等进行观察, 以期丰富中国软骨鱼类的繁殖生理研究并为孔鳐精子冷冻保存、体外培养等技术的开发提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

本实验所用13尾雄性孔鳐, 钓捕于中国黄海海域。并在室内海水流水养殖系统(16±3 ℃)中暂养1~3 d。

1.2 样品的解剖与观察

使用MS-222(0.1 g/mL)将鱼体麻醉, 用手术刀从雄性泄殖孔处入刀, 沿体轴向上剖至围心腔下软骨处, 然后沿后鳍软骨弧形边缘向两侧剖至泄殖孔。最后用刀柄再将腹腔处体壁与腹膜剥离, 直至内脏暴露。再用手术刀小心划开腹膜, 将肠道、肝脏等器官去除, 保留生殖系统相应器官用于观察。本研究中性腺以及附属生殖器官的解剖学描述主要参考PEDREROS^[12]、CONCHA^[13]和PRATT等^[14]研究结果。碱腺PH值由MColorpHast试纸(德国默克公司)测定。

1.3 石蜡切片制备与观察

将雄性生殖系统从体腔剥离, 并自上而下切分成若干段, 每段分别用波恩固定液固定, 酒精梯度脱水, 浸蜡, 再经过包埋、切片、脱蜡复水、HE染色、脱水封片等步骤, 石蜡切片制作流程参照王雨福^[15]试验流程。制备完善的石蜡切片用Nikon eclipse 50i显微镜进行观察与测量, 而后使用Excel 2019软件进行统计分析。模式图使用Adobe PS CS6软件绘制。

2 结果 2.1 解剖学观察结果

雄性孔鳐生殖系统由体内和体外两部分组成, 其中体外性征明显, 雄性孔鳐腹鳍末端特化形成交配器官-鳍脚(图 1), 该器官是雄性软骨鱼类特有的外生殖器, 交配时雄性会将鳍脚由泄殖孔插入雌性体内, 将精液喷射进雌性生殖道中以完成受精, 鳍脚末端有多个关节, 可灵活张合。张开的鳍脚会在侧翼伸出一根倒刺(图 1), 用于钩住雌性的生殖道。鳍脚主要是由端叶、鳍扇和扇盾等结构组成。在鳍脚基部位置对称分布有鳍脚腺, 呈米黄色, 长椭球形, 中央有一纵沟, 鳍脚腺外包裹有致密的白膜中。切开鳍脚腺后, 可见乳白色的黏液。

孔鳐的精巢位于腹腔脊椎的两侧, 浅黄色, 分左右两叶, 表面有血管分布, 通过精巢系膜固定于腹腔中, 精巢的边缘附着有性上器官, 呈扇形片状器官, 该器官是软骨鱼类特有的免疫器官, 伴随整个性腺的发育过程。在精巢旁边靠近脊椎处为孔鳐的附睾, 呈柱状, 附睾末端可见折叠样的管状结构为输精管, 输精管末端腔体扩大形成储精囊, 储精囊为精子的暂存部位。附睾周围环绕有柱状的间质腺, 该器官是附睾液的重要来源。此外, 孔鳐的储精囊旁有一对泡状结构-碱腺, 该结构为鳐鱼、鱼等鱼类所特有, 内部含有大量液体, 孔鳐碱腺液体pH为8.7左右, 该器官结构简单, 仅有一层系膜构成, 难以单独剥离。

2.2 组织学观察结果

性上器官: 分布在性腺的外侧, 呈扇形片状器官, 是软骨鱼类特有的淋巴器官。由被膜、实质组成, 被膜由间皮、结缔组织所组成, 间皮为单层扁平上皮。性上器官实质中含有大量的红细胞、淋巴细胞等血细胞。同时含有分布不均、大小不等的血窦。血窦内皮细胞呈梭形, 围绕血窦腔内侧分布, 血窦腔隙中可见组织液和各类血细胞(图 2)。

精巢: 孔鳐精巢最外层由2~3层单层扁平上皮所构成的外膜, 外膜内包裹有若干精小囊。精小囊是孔鳐精子发育的基本单元, 各精小囊之间分布有精巢间质细胞(leydig cell), 核大而圆, 往往聚集分布。每一个精小囊中的生精细胞发育同步, 若干个精小囊按照成熟度由中心向四周呈同心圆状排列形成球形精巢小叶(图 2)。多个球形的精巢小叶聚集形成精巢。按照生精细胞的状态和支持细胞(sertoli cell)的相对位置, 可以将孔鳐的精子发生过程分为7个时期, 第一期: 精巢支持细胞未迁移期, 此时精小囊直径为92.08±17.00 μm, 精小囊空腔直径30.28±7.05 μm, 该时期主要特征为精巢支持细胞围绕着精小囊空腔呈辐射状分布在内侧, 精巢支持细胞的细胞核明显, 呈水滴形或肾形。精小囊中的生精细胞为精原细胞, 细胞核直径5.98±0.50 μm, 核大而圆, 细胞边界明显; 第二期: 精巢支持细胞迁移期, 此时, 精小囊直径为130.07±13.81 μm, 精小囊空腔直径56.45±11.58 μm, 精巢支持细胞开始沿径向向精小囊外缘的管周肌样细胞迁移, 精巢支持细胞的长轴与精小囊的径向平行, 此时精小囊中的生精细胞依然是精原细胞, 细胞核直径4.62±0.63 μm; 第三期: 精巢支持细胞定植早期, 此时精小囊直径为214.52±57.69 μm, 精小囊空腔直径为56.22±15.45 μm, 该时期精巢支持细胞完成迁移, 并整齐地贴合在精小囊内壁基底膜处, 精巢支持细胞的短轴与精小囊径向平行, 此时精小囊中的生精细胞主要以初级精母细胞为主, 细胞核直径7.02±1.98 μm, 核大, 染色较浅且不均, 在光镜下可见染色较深的点状染色质, 细胞边界明显; 第四期: 精巢支持细胞定植晚期, 此时精小囊直径237.66±55.25 μm, 空腔直径57.44± 22.89 μm, 其中的生精细胞主要以次级精母细胞为主, 细胞核直径2.94±0.33 μm, 核小染色较深; 第五期: 精子变形期, 此时精小囊直径为220.02± 48.60 μm, 精小囊腔边界模糊, 此时精子开始变形, 在光镜下可见正在伸长的弯曲的精细胞核散乱的分布在精小囊中, 精细胞的尾部伸向精小囊管腔; 第六期: 精子迁移期, 此时精小囊直径为253.40± 55.82 μm, 精小囊空腔中充满黏液和精子尾部, 这一时期精子变态基本完成, 光镜下可明显看到头部和尾部结构, 此时精子的头部沿径向以放射状的形式在精小囊中排齐, 同时在精小囊内壁处可清楚的看到精巢支持细胞排列成一圈, 包绕在精子外围。第七期: 精子聚拢期, 此时精小囊直径为223.46±38.15 μm, 此时精子变态结束, 精子头部紧密贴合并聚拢呈精子束, 平均每一簇精子束由59~64个精子组成。每束精子束的周边可见脱落的呈嗜酸性的残余体, 每一束精子按照螺旋状排列在精小囊中, 并准备进入附睾。

附睾: 雄性孔鳐的生殖道连接精巢和外生殖器, 是孔鳐精子输送到体外的通道, 其主要由附睾、输精管、储精囊等结构组成(图 3)。其中孔鳐的附睾主要由输出小管和附睾管所组成, 输出小管上皮为柱状上皮, 细胞核整齐地排列在基底膜处, 管腔小, 腔内有少量黏液。精子经输出小管后进入附睾管, 附睾管根据管壁上皮细胞和管腔的大小可分为前段、中段、后段3部分, 附睾管前段的上皮为假复层纤毛柱状上皮, 其中以高柱状的主细胞(principal cell)为主, 主细胞细胞核呈椭圆形分布在靠近基底膜位置, 在主细胞的间隙夹杂着部分狭窄细胞(narrow cell), 狭窄细胞的细胞核呈楔形, 细胞核靠近附睾管腔(图 3)。管腔中有大量黏液和精子分布, 少量的精子聚集形成无规律的精子团, 同时在黏液间隙可见直径约10 μm的嗜酸性颗粒。附睾管中段上皮为低柱状纤毛上皮, 细胞核靠近基底膜, 在细胞的游离面可见静纤毛, 相较于前段, 中段管腔较大, 腔内黏液量增多, 由于上皮中未观察到杯状细胞、黏液性细胞或浆液性细胞等具有分泌功能的细胞结构, 因此该区域黏液量增多可能与间质腺的分泌功能有关。同时, 大量精子散乱分布在管腔, 黏液中的嗜酸性颗粒数量增多。附睾管中段末端的区域, 部分精子开始头部聚拢形成精子束, 黏液中的嗜酸性颗粒整合形成直径约22 μm的较大颗粒。附睾管后段前端上皮开始向管腔内折叠形成微小的褶皱, 管腔内的精子头部聚拢形成致密的精子束, 光镜下可见到宽约8 μm、长约15 μm的精子细胞核斑块。

输精管: 附睾末端管腔膨大, 上皮向管腔内隆起形成褶皱, 构成输精管。输精管中可见精子团, 管腔内黏液量减少, 由于该区域上皮类型为纤毛柱状上皮(图 3)。

储精囊: 位于生殖道的最末端, 由附睾管末端膨大形成, 生殖道中管腔最大的部位, 主要用于暂存精子。由外向内依次由间皮、结缔组织、柱状上皮组成, 其中结缔组织主要由平滑肌、胶原纤维和弹性纤维组成, 厚度约20 μm, 纤维性结缔组织伸入到柱状上皮中参与绒毛的形成。储精囊的绒毛很长, 几乎横跨整个管腔。同时管腔中的黏液在HE染色下呈较强的嗜酸性, 黏液中的精子散乱分布。在光镜下可见绒毛的顶端有嗜酸性的颗粒分泌(图 3)。

间质腺: 由盘曲折叠的腺管组成, 腺管上皮由黏液性细胞构成, 细胞呈锥体, 边界模糊, 细胞核小而扁平, HE染色较深, 紧靠基底膜, 胞质较多染色淡, 较透明。在黏液细胞的间隙分布有少量的楔形细胞, 核靠近游离面。间质腺管腔中常见有黏液分布, 靠近附睾中段的腺管充盈, 分泌旺盛(图 4)。

鳍脚腺: 鳍脚腺位于鳍脚基部的两侧, 左右对称分布, 呈长椭球形, 沿长轴方向有一个纵沟, 整个鳍脚腺外包裹有致密的结缔组织, 可能参与腺体的挤压过程。鳍脚腺由外向内依次由外膜、肌层、腺体3部分构成, 其中外膜由短柱状上皮构成, 下面有一层厚约3 μm疏松结缔组织构成, 结缔组织中可见血管分布。肌层厚约10 μm, 肌纤维呈细长条状, 形成规则的肌束。椭圆形的肌细胞核, 分布在肌浆的外围。腺体由规则的六边形的浆液性腺泡组成, 其中腺泡主要由单层的锥体形细胞所围成, 核椭圆, 分布在腺泡的基底膜处, 顶部胞质含有大量的嗜酸性分泌颗粒(图 5)。

3 讨论

进行体内受精的物种, 雄性需要将精子输送入到雌性体内以完成受精, 在这一过程中如何有效地减少精子的损失成为提高雌性受孕率的关键。外生殖器的出现使的这一问题得以解决。经过漫长的演化过程, 雄性软骨鱼类形成了高度特化的外生殖器-鳍脚, 该器官在交配过程中可以进入雌性软骨鱼类的生殖道中, 依靠倒刺等结构(图 1)固定在雌性生殖道中以顺利完成射精过程。该器官会随着雄性个体发育而逐渐成熟, 发育成熟后不会出现周年变化现象。同时值得注意的是, 不同软骨鱼类鳍脚的形态和骨骼的组成也不尽相同^[16], 这可能与不同物种雌性生殖道的结构相适应。然而, 由于软骨鱼类取样较为困难, 目前针对不同软骨鱼类鳍脚形态差异的原因还尚不清楚。此外, 外生殖器并非软骨鱼所特有, 在硬骨鱼类中部分进行体内受精的物种也形成了特殊的交配结构, 在一些物种中这些交配结构表现为一种可变化的特殊组织如平鲉属鱼类的尿殖突^[17-19], 这些组织结构呈现出明显的季节性, 往往在繁殖季节发达, 而在非繁殖季节退化; 而另一些物种的交配结构已经高度特化形成了实质性的交配器官如某些鳉形目鱼类的生殖足^[20], 虽然目前针对软骨鱼类和硬骨鱼类的外生殖器的起源以及发生机制还尚不明确, 但是相关研究表明雄激素对食蚊鱼(Gambusia affinis)、猬白鳐(Leucoraja erinacea)等鱼类的外生殖器的生长发育具有重要调控作用^[21-22]。对于鱼类外生殖器发育机制的进一步研究, 可以为理解脊椎动物体内受精方式的产生与进化提供一定的参考。

就精子发生过程以及精巢细胞的组成而言, 在脊椎动物中是相对保守的, 精原细胞在精巢支持细胞和间质细胞的作用下, 经过有丝分裂形成初级精母细胞, 初级精母细胞经过第一次减数分裂形成次级精母细胞, 次级精母细胞经过第二次减数分裂形成精细胞, 最终精细胞变态形成精子^[23], 但是和硬骨鱼类相比^[24], 有些软骨鱼类的精巢中生精细胞并未表现出明显的季节性, 部分软骨鱼类甚至可以不受环境的限制全年进行交配^[25], 成年雄性孔鳐的精巢中可观察到处于各个时期的生精细胞。除此之外, 软骨鱼类的精巢的结构也不同于硬骨鱼类的小叶型和小管型^[26], 根据精小囊的排列方式和相对位置可将软骨鱼类的精巢大致分为3类: 扇型、辐射型和混合型^[14]。其中孔鳐属于混合型精巢。尽管精小囊的排布规律有所差异, 但软骨鱼类在精子发生过程中精巢支持细胞的迁移过程是普遍存在的^[25], MARINA等^[27-28]对精巢支持细胞的超微结构和定位特征进行了部分研究, 但是目前对精子发生影响的分子机制目前尚不清楚。在本研究中可以观察到, 在精子发生的早期精小囊中的精巢支持细胞并未发生迁移, 此后, 精巢支持细胞会逐渐迁移到精小囊的外围。同时, 当精细胞的头部变态基本结束后, 精子也会逐渐迁移到精小囊的外围, 并聚拢成束, 这一过程可能涉及到生精细胞以及精巢支持细胞相互作用, 但还需要进一步的实验证据。同时软骨鱼类的精子能以精子束的方式进入生殖道中^[29], 这种精子聚集方式在部分硬骨鱼类和星虫中也有报道^[30-31], 该一现象可能是一种生殖适应性进化的表现。以精子束的方式在附睾等长管状、多褶皱的器官中进行运输, 能够有效地减少精子的损失, 特别是对于精子个体较大的物种而言。

附睾是对精子进一步修饰成熟的器官^[32], 附睾液是精子去获能和精子储存的重要组分, 哺乳动物的附睾管主要由6种细胞组成^[33], 各细胞分工明确, 在吞噬精子残体、调节管腔PH、维持管腔稳定、促进精子成熟等方面发挥着重要的作用。软骨鱼类的附睾管结构虽然和哺乳动物相似, 但是细胞种类较少, 其附睾管细胞可能同时承担多种功能。此外, 值得注意的是, 在艾氏异仔鳉(Xenotoca eiseni)等部分行体内受精的硬骨鱼类的雄性生殖系统中也具有附睾^[34], 然而目前硬骨鱼类和软骨鱼类的附睾对精子的调控机制是否存在共性还需要进一步的对比研究。

雄性个体将发育成熟的精子从体内输送至体外是受精的关键。在雄性鲨鱼的生殖系统中有虹吸囊(siphon sac)结构, 该器官为一个肌性器官, 负责将精子推出雄性生殖道^{[4, 35]}。然而, 雄性鳐鱼、鱼等鱼类却没有虹吸囊。其中, 碱腺作为雄性鳐鱼、鱼等鱼类所特有的结构, 逐渐引到了学者们的关注, 由于该结构紧靠肾脏, 同时其内部含有大量碱性液体^[36-37], 之前部分学者认为该器官为软骨鱼类的膀胱^[38], 但是GRABOWSKI^[39]发现这些碱性液体可以激活雄鱼的精子。同时随着大量研究对液体成分进行了分析和鉴定, 学者们发现碱腺液体中除了含有尿素、钠离子、氯离子等成分外^[36-37], 还含有一种类似于哺乳动物松弛素的激素并命名为Raylaxin(松弛素)^[40]。因此, 碱腺是软骨鱼类生殖系统附属器官的观点也逐渐被接收。在本实验中, 孔鳐的储精囊旁也分布有碱腺, 碱腺中液体的pH值约为8.7, 这与其他鳐类、类碱腺pH值(8.1~9.4)相近^{[36-37, 41]}。虽然, 目前针对软骨鱼类碱腺功能还存在诸多未知, 但是相关解剖学和生理学研究结果暗示该结构可能与射精以及交配有关。

4 结论

孔鳐的生殖系统主要由精巢、附睾、输精管、储精囊、间质腺、鳍脚腺、碱腺和鳍脚组成。其中孔鳐的精巢属于软骨鱼类中的混合型, 每个精小叶中的精小囊, 按照成熟度依次由中心向小叶外周辐射状排列, 其精子发生过程根据精巢支持细胞(sertoli cell)的位置、精小囊的大小和精小囊中的生精细胞所处的状态可划分为7个时期: 精巢支持细胞未迁移期、精巢支持细胞迁移期、精巢支持细胞定植早期、精巢支持细胞定植晚期、精子变形期、精子迁移期、精子聚拢期(图 6)。最终每59~64根精子组成精子束进入附睾。精子束在附睾中经历“游离-聚拢-游离”3个过程后, 最终储存在储精囊中。并通过鳍脚排出体外。