2022, Vol. 46
文章信息
- 靳智欣, 徐永江, 刘新富, 梁友, 周鹤庭, 崔爱君, 刘欣. 2022.
- JIN Zhi-xin, XU Yong-jiang, LIU Xin-fu, LIANG You, ZHOU He-ting, CUI Ai-jun, LIU Xin. 2022.
- Cu对云龙石斑鱼幼鱼的生理生态毒性
- Physiological and ecological toxicity of copper on juvenile Yunlong grouper (Epinephelus moara♀ × Epinephelus lanceolatus♂)
- 海洋科学, 46(8): 39-47
- Marine Sciences, 46(8): 39-47.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20220412002
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文章历史
- 收稿日期：2022-04-12
- 修回日期：2022-06-06
2. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 青岛海洋科学与技术试点国家实验室深蓝渔业工程联合实验室, 山东 青岛 266071
2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) for Deep Blue Fishery Engineering, Qingdao 266071, China
Cu是鱼类的必需微量元素之一, 能广泛参与到鱼类生长发育的生理生化过程中。Cu还是杀灭刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的有效重金属, 常用作水产养殖寄生虫病防治的有效药物。研究表明, 水体中过量的Cu, 会通过鱼类呼吸及摄食等活动进入其体内, 造成组织损伤甚至死亡[1-2]。硫酸铜可杀灭刺激隐核虫、淀粉卵涡鞭虫(Amyloodinium ocellatum)等寄生虫, 在水产养殖中通常作为渔药使用[3-5]。在养殖生产中, 由于不注意用药环境或使用高浓度的硫酸铜治疗鱼病, 易造成硫酸铜中毒, 给水产养殖带来严重危害。因此, 适宜的使用剂量是在水产养殖过程中安全使用硫酸铜等铜制剂的关键。
云龙石斑鱼(Epinephelus moara♀×Epinephelus lanceolatus♂), 是以鞍带石斑鱼(Epinephlus lanceolatus)为父本, 以云纹石斑鱼(Epinephelus moara)为母本的具有优良杂交性状的石斑鱼新品种。鞍带石斑鱼其体型大, 但数量稀少, 在中国主要产于南海海域和海南岛海域, 具有抗病性强、生长速度快、营养价值高等优点[6]。云纹石斑鱼在中国主要产于东海海域、南海海域等, 具有耐受低温、油脂含量高、肉质细嫩、味道鲜美等特点, 但其生长速度缓慢且对养殖环境要求高, 一般养殖3~5年才能达到商品鱼规格[7]。因此培育出的云龙石斑鱼, 具有生长快、畸形率低和耐温性广的特点[8]。近年来, 云龙石斑鱼成为全国特别是北方石斑鱼养殖业者的养殖新宠。然而, 在幼鱼养殖过程中, 易感染刺激隐核虫等寄生虫而造成大量死亡。一般养殖生产过程中, 养殖业者多使用硫酸铜治疗刺激隐核虫, 但目前尚未有规范的使用剂量, 易造成无效果或用量过大的情况, 从而带来不必要的损失。因此, 本研究主要针对云龙石斑鱼幼鱼养殖过程中易发的刺激隐核虫病害, 研究了硫酸铜在刺激隐核虫防治过程中的安全使用浓度, 以及不同浓度Cu2+条件下的组织损伤、酶活力以及毒理相关功能基因的变化, 为云龙石斑鱼养殖期间利用Cu防控寄生虫疾病提供科学的参考资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用鱼来源于烟台海阳市黄海水产有限公司。选取体质健壮、反应灵敏的幼鱼, 规格为全长(5.5±0.49) cm、体质量(2.06±0.61) g。实验开始前转移到实验用方形水槽(容积为0.15 m3)暂养2 d。所有暂养的实验用鱼停食24 h后再放入各实验组, 避免消化活动对实验产生影响。实验期间不投饵, 直至实验结束。
1.2 实验条件实验用的硫酸铜(CuSO4·5H2O≥99.0%)试剂为分析纯。试剂在实验前配成质量浓度为3 000 mg/L的母液作为储备液, 再用过滤海水按比例稀释, 现用现配。养殖期间自然海水的水温为23~27 ℃、盐度29±1、pH 7.8~8.2, 溶氧 > 5 mg/L。
1.3 实验方法参照《水生生物毒性实验方法》[9], 同时参考其他海水鱼类Cu2+毒理实验, 根据预实验结果, 在Cu2+最小100%致死浓度和不引起死亡的最大浓度之间, 设置对照组和6个实验组, Cu2+的质量浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2 mg/L。每个浓度组设置2个平行组。每个实验组随机放入30尾云龙石斑鱼, 在实验开始后的1、2、3、6、12、24、48、72和96 h, 观察记录实验鱼的行为、中毒症状和死亡情况。以多次刺激无反应视为完全死亡, 将其及时从水中捞出, 并计算成活率。采用概率单位法(GB 17378.7-2007), 计算24、48、96 h半致死质量浓度(LC50)和95%置信区间。安全质量浓度(CS)按下式计算[10]:
毒理实验96 h后, 不同浓度组各取3尾鱼中鳃、肝脏组织, 以Davidson固定液固定, 用于组织切片的制作; 各实验组分别取6尾鱼的肝脏组织并混合, 放入液氮中保存, 用于酶活力的测定; 各取3尾鱼的脑、鳃、肝脏组织放入液氮中保存, 用于基因表达分析。
1.5 光镜制样及拍照组织样品经酒精梯度脱水, 石蜡包埋(55 ℃)后切片, 以苏木精和伊红复染, 中性树脂封片, 在光学显微镜下拍照观察(NIKON ECLIPSE 80i, NIKON DS-Ri1, 日本)。
1.6 酶活力测定利用酶标仪(Bio-rad iMark, 日本)和WST-1法测试盒(A001-3, 南京建成生物工程研究所)测定肝脏超氧化物歧化酶(SOD)酶活力; 紫外可见分光光度计(TU-1810, 上海)和比色法测试盒(C010-1-1, 南京建成生物工程研究所)测定谷草转氨酶(GOT)酶活力。蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝比色法。所有操作按照试剂盒说明书严格进行。
1.7 基因定量表达分析采用Trizol试剂法(AG RNAex Pro Reagent, 湖南)提取脑、肝脏、鳃组织总RNA。以总RNA为模板, 使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒(TaKaRa, 日本)合成cDNA。
在NCBI数据库中查找鞍带石斑鱼β-actin、金属硫蛋白-2(MT-2)基因的序列, 设计定量PCR引物并进行PCR验证后使用, 参考引物序列详见表 1。使用Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪进行基因的定量扩增分析。PCR反应体系为20 μL, 其中包含10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL; 10 μL的TB Green Premix Ex Taq; 0.4 μL的ROX Reference Dye Ⅱ; 2 μL的cDNA模版; 6 μL的ddH2O。PCR反应条件: 95 ℃预变性30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s共40个循环。标准曲线采用6个稀释浓度组(每组3个平行, 且设置空白对照)进行; 制作标准曲线并根据标准曲线的相关系数r2和扩增效率E。目的基因表达量采用2–ΔΔCt法计算。
| 基因 | 上游引物序列(5′-3′) | 下游引物序列(5′-3′) | 产物长度/(bp) | 退火温度/(℃) |
| MT-2 | TGGACCCTTGCGATTGCTCC | GGTGGTGCAGGAGCAGTTAGT | 88 | 60 |
| β-actin | TCCTGCGGAATCCACGAGAC | AATGCCTGGGTACATGGTGGT | 117 | 59 |
数据以平均值±标准差(mean±SD)表示, 采用SPSS 19.0软件单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比较分析方法检验不同Cu2+浓度组条件下酶和基因表达的差异, 设定差异显著性水平P= 0.05, 当P < 0.05时认为差异显著。
2 结果 2.1 Cu暴露对云龙石斑鱼行为学的影响本研究表明, 云龙石斑鱼在0.4 mg/L以上Cu2+浓度组出现行为异常情况。高浓度组实验鱼在暴露2~4 h后开始出现行为异常, 主要表现为在水面游动, 身体失去平衡, 开始侧翻游动。6~8 h后急速游动、到处乱窜或者水面打转, 随后身体抽搐, 沉入水底, 数分钟后, 又向上急游并旋转游动, 周而复始数次后, 直至呼吸缓慢, 乏力。12~24 h出现大量死亡, 死亡的云龙石斑鱼鳃及体表分泌出大量黏液。低浓度组实验鱼出现中毒症状的时间较高浓度组晚, 但中毒的行为表现模式相似。
2.2 Cu2+对云龙石斑鱼的生态毒性利用概率单位法计算得知, Cu2+对云龙石斑鱼24、48和96 h的LC50值分别为0.590、0.293、0.162 mg/L, CS为0.0162 mg/L。实验鱼死亡率统计详见表 2; LC50以及CS统计详见表 3。
| 组编号 | 质量浓度/ (mg/L) | 死亡率/% | ||
| 24 h | 48 h | 96 h | ||
| 对照 | 0 | 0.067 | 0.167 | 0.167 |
| Ⅰ | 0.1 | 0.17 | 0.22 | 0.33 |
| Ⅱ | 0.2 | 0.44 | 0.56 | 0.56 |
| Ⅲ | 0.4 | 0.2 | 0.42 | 0.88 |
| Ⅳ | 0.8 | 0.56 | 0.78 | 0.83 |
| Ⅴ | 1.2 | 0.39 | 0.56 | 0.72 |
| Ⅵ | 2 | 0.93 | 1.00 | 1.00 |
| 暴露时间/h | 半致死质量浓度/(mg/L) | 95%可信限/(mg/L) | 安全质量浓度/(mg/L) |
| 24 | 0.590 | 0.390~0.892 | 0.0162 |
| 48 | 0.293 | 0.214~0.402 | |
| 96 | 0.162 | 0.26~0.64 |
本研究发现, Cu暴露造成了鳃组织的结构损伤。由图 1a可知, 对照组鳃上皮细胞单层有序排列, 次级鳃丝结构清晰。随Cu2+浓度升高, 鳃组织表面黏液增多, 鳃丝附有蓝色絮状物。低浓度处理组鳃上皮细胞水肿, 次级鳃丝黏液细胞肿胀, 出现动脉瘤并伴有上皮与毛细血管分离的现象(图 1b); 高浓度处理组次级鳃丝上皮细胞破裂脱落, 顶部棒状(图 1c)。
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| 图 1 云龙石斑鱼经96 h的Cu暴露后鳃、肝脏的显微结构(标尺100 μm) Fig. 1 Effect of 96-h Cu2+ exposure on the gills and liver of E. moara♀ × E. lanceolatus♂ (scale: 100 μm) a~c. 鳃, d~f. 肝脏. a、d. 对照组; b、e. 0.2 mg/L Cu2+处理; c、f. 1.2 mg/L Cu2+处理 a-c. gills, d-f. liver. a, d. control; b, e. 0.2 mg/L Cu2+ treatment; c, f. 1.2 mg/L Cu2+ treatment |
Cu暴露同样造成了肝脏组织的结构损伤。与对照组(图 1d)相比, 低浓度处理组胞浆内大量空泡; 高浓度处理组肝细胞出现大量脂褐素颗粒, 且肝细胞肿大, 并伴有部分肝细胞坏死, 血窦扩张, 肝索结构紊乱(图 1e、1f)。
2.4 Cu暴露对云龙石斑鱼肝脏氧化酶活性的影响本研究发现, Cu暴露显著抑制了肝脏SOD酶活力(图 2a), 但肝脏GOT酶活力随Cu2+浓度升高, 呈现先上升后下降趋势(图 2b)。统计结果显示, 0.1 mg/L组较对照组SOD酶活力显著降低(P < 0.05), 0.4 mg/L组较0.2 mg/L组SOD酶活力显著降低(P < 0.05), 1.2 mg/L组SOD酶活力显著低于所有实验组(P < 0.05), 但0.2与0.1 mg/L质量浓度组、0.8与0.4 mg/L质量浓度组SOD酶活力相比差异不显著(P > 0.05); 0.1 mg/L组GOT酶活力高于对照组(P > 0.05), 但Cu2+质量浓度高于0.2 mg/L时GOT酶活力受到显著抑制(P < 0.05)。
 |
| 图 2 Cu2+对云龙石斑鱼肝脏SOD酶(a)和GOT酶(b)活力影响 Fig. 2 Effect of Cu2+ on the (a) superoxide dismutase (SOD) and (b) glutamic-oxaloacetic transaminase (GOT) enzyme activities in the liver of E. moara♀×E. lanceolatus♂ 不同小写字母表示不同处理组之间差异显著(P < 0.05), 图 3同 Different lowercase superscripts indicate significant difference (P < 0.05) in the different treatment, the same as Fig.3 |
Cu胁迫下肝脏组织MT-2 mRNA表达水平显著上升(图 3a)。0.1 mg/L组较对照组、0.2 mg/L组较0.1 mg/L组、0.8 mg/L组较0.4 mg/L组MT-2 mRNA表达水平均显著升高(P < 0.05), 在1.2 mg/L组MT-2 mRNA表达量达峰值, 显著高于其他实验组(P < 0.05), 但0.2 mg/L组与0.4 mg/L组MT-2 mRNA表达水平无显著性差异(P > 0.05)。
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| 图 3 Cu2+对云龙石斑鱼MT-2 mRNA表达的影响 Fig. 3 Effect of Cu2+on MT-2 mRNA expression in E. moara♀×E. lanceolatus♂ (a). 肝脏; (b). 鳃; (c). 脑 (a). liver; (b). gills; (c). brain |
本研究表明, Cu胁迫下鳃组织MT-2 mRNA表达水平升高, 与肝脏中表达趋势相似(图 3b)。其中0.1~0.4 mg/L质量浓度下MT-2 mRNA表达水平与对照组无显著差异(P > 0.05), 但在0.8、1.2 mg/L Cu2+质量浓度下显著升高(P < 0.05)。
2.5.3 对脑MT-2的影响Cu胁迫条件下, 脑组织MT-2 mRNA表达水平呈现先上升再下降趋势。其中0.1、0.2 mg/L质量浓度下MT-2 mRNA表达水平与对照组相比无显著差异(P > 0.05), Cu2+质量浓度为0.4 mg/L时MT-2 mRNA表达水平显著升高(P < 0.05), 0.8、1.2 mg/L浓度组MT-2 mRNA表达水平显著下降, 且显著低于其他实验组(P < 0.05) (图 3c)。
3 讨论 3.1 Cu暴露对云龙石斑鱼的急性毒性效应有关Cu对鱼类毒性效应的研究已有报道。本研究发现, Cu暴露条件下云龙石斑鱼体表和鳃黏液增多、鳃丝附有蓝色絮状物。行为变化为翻转测游、水面上层打转、鳃盖张开频率加快, 最终窒息死亡。这与沙丁鱼(Sardinella brasiliensis)[11]、莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)[12]、刀鲚(Coilia nasus)幼鱼[13]中毒现象一致。
LC50通常作为衡量某种药物对特定物种毒性大小的重要参数, 以96 h LC50作为标准[14]。CHIDIEBERE[15]报道Cu2+对鲶鱼(Clarias Gariepinus)96 h的LC50为59.36 mg/L, 而王秋实等[16]研究发现Cu2+对梭鲈(Sander lucioperca)幼鱼96 h LC50为1.88 mg/L。本研究结果显示, Cu2+对云龙石斑幼鱼96 h的LC50值为0.162 mg/L, 结果与其他鱼类不同, 这是由种的差异性造成, 表明云龙石斑鱼对Cu2+较为敏感。TAVARES-DIAS[17]也曾报道一些鱼种对Cu极为敏感, 而其他鱼种则有高度耐受性。孟紫强等[18]评定LC50在0.1~1.0 mg/L为高毒, 本研究结果表明云龙石斑幼鱼96 h LC50在高毒范围区间, 提示在养殖生产过程中药用硫酸铜时应准确把控用量。此外, 有研究发现, 盐度[19]、温度[20]等理化因子的改变对重金属的毒性也可能产生影响, 本研究在实验过程中环境因子较稳定, 下一步可以通过更为精密的实验研究其他理化因子对Cu2+毒性的影响。
3.2 Cu暴露对云龙石斑鱼的组织损伤鳃主要参与鱼类的呼吸和渗透调节过程, 是重金属首先接触的靶器官。重金属离子主要通过阻塞鳃丝与水体的接触, 以此抑制鱼的呼吸[21]。本研究发现, 高浓度Cu处理组鳃上皮细胞增生, 次级鳃丝顶部棒状, 这与BASIRUN等[12]研究Cu对莫桑比克罗非鱼以及AFAGHI等[22]研究Cu对鲤鱼(Cyprinus carpio)的结果一致。GRIFFITT等[23]认为Cu刺激斑马鱼(Danio rerio)鳃组织次级鳃丝基部的增生增加了气体传送的距离, 甚至很小的增生都会影响氧气穿过鳃进入到体内的效率, 本研究中Cu暴露导致云龙石斑鱼鳃盖张开, 呈现缺氧状态, 病理切片观察发现次级鳃丝基部出现动脉瘤, 表明Cu胁迫对云龙石斑鱼鳃运输气体的功能造成影响。肝脏是鱼类分解毒物的重要器官, 有研究表明, 血窦扩张是Cu诱导肝脏损伤的重要指示信号[24], 并且脂褐素颗粒的大量产生是一种在致病因素影响下动物对自身肝脏的适应与修复机制[25]。本研究结果显示, 急性Cu暴露96 h后, 肝脏显示出不同程度的损伤, 主要表现为肝细胞肿大、血窦扩张、血细胞沉积以及脂褐素颗粒产生, 这与徐永江等[2]对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、王海涛等[26]对细鳞鲑幼鱼(Brachymystax lenok)以及ALKOBABY等[27]对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏组织损伤的报道结果类似, 说明Cu诱导不同品种鱼类肝脏损伤的症状大体一致。
3.3 Cu暴露对云龙石斑鱼肝脏抗氧化酶活性的影响SOD、GOT是脊椎动物体内抗氧化酶的重要组分, 先前研究表明其可作反映鱼类肝脏受损伤程度的指示指标[28-29]。本研究中, 云龙石斑鱼SOD和GOT酶活性对Cu的刺激均较敏感, 但Cu暴露对两种酶活性的影响呈现不同趋势。低浓度Cu处理组较对照组GOT酶活性升高, 这与RAMASWAMY等[30]对莫桑比克罗非鱼肝脏组织的研究结果类似。STEBBING[31]认为, 毒物在低浓度下出现这种现象, 是其在无毒情况下的应激反应, 他把这一现象称为“毒物兴奋效应”。但后续随着Cu2+浓度升高, GOT酶活力降低。作者认为低浓度Cu胁迫下, 云龙石斑鱼肝脏GOT酶活力上升是用于补偿环境胁迫带来的影响, 但高浓度处理组胁迫下, 可能已经超出了其本身抗氧化系统的防御能力, 从而造成较为严重的损伤。殷健等[32]报道斑马鱼鳃组织在暴露于重金属Cu后, SOD活性和MDA含量明显升高, 而且Cu/Zn-SOD基因表达上调。SANCHEZ等[33]也报道Cu能够诱导三棘鱼(Gasterosteus aculeatus)中肝脏组织的SOD和CAT活性提高。但本研究发现, 随Cu2+浓度的升高, 肝脏组织SOD显著降低, 这与WANG[34]对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏中SOD酶活力应答Cu胁迫的研究结果一致。表明云龙石斑鱼肝脏SOD活力对Cu胁迫较为敏感, SOD系统受到Cu的严重胁迫抑制, 提示应用Cu制剂处理云龙石斑鱼时应注意使用剂量, 同时也提示其可作为水环境Cu2+安全监测生理指示指标的可能性。
3.4 Cu暴露对云龙石斑鱼组织MT-2的影响MT-2是金属硫蛋白家族成员之一, 与Zn、Cu、Fe、Cd等二价离子可逆性结合以维持机体内金属离子平衡, 对重金属解毒有重要作用[35]。GONZALEZ等[36]报道MT-2基因在肝脏中比在脑、鳃和肌肉中表达量高。WANG等[34]研究表明, 斜带石斑鱼肝脏是积蓄Cu的主要靶器官, 刘瑜等[37]报道Cu主要沉积在黄鳝(Monopterus albus)的肝脏和肠道部位, 高浓度Cu会导致肝脏Cu超标, 说明肝是Cu积累的最主要靶器官。GAO等[38]表明鳜鱼(Siniperca chuatsi) MT-2 mRNA在所有组织都表达, 且在鳃、肝脏、心脏、体肾和肠道中高表达, 在脑和头肾中低表达。本研究中, 随Cu2+浓度升高, MT-2 mRNA在肝脏, 鳃组织表达水平显著升高, 与GONZALEZ[36]描述一致。但在脑组织中MT-2 mRNA表达水平呈现先上升后下降的趋势, 且在低浓度时上升趋势不显著, 这与左鹏举[39]对鲤鱼MT mRNA表达水平研究结果相似, 说明高浓度Cu处理组脑组织MT-2诱导表达已与重金属饱和结合, 机体产生了不可逆的毒性。CRAIG等[40]研究表明, 斑马鱼在Cu暴露组(8 μg/L)中MT-2 mRNA表达水平比MT-1上调更快, 表明MT-2基因作为Cu2+对鱼类生理毒性的评价参数的重要性, 也可作为鱼类对Cu2+敏感应答的指示参数。
4 结论在本实验中, 硫酸铜对云龙石斑鱼幼鱼的96 h LC50在高毒范围区间, Cu暴露不仅造成云龙石斑鱼幼鱼的肝脏、鳃组织损伤, 同时使其体内抗氧化酶活性及MT-2基因表达产生不同的变化。表明云龙石斑鱼对硫酸铜制剂的处理较为敏感。本研究结果显示, Cu2+对云龙石斑鱼的安全质量浓度为0.016 2 mg/L (换算成硫酸铜质量浓度为0.040 5 mg/L), 因此在养殖过程中, 建议使用0.040 5 mg/L及以下质量浓度的硫酸铜进行药浴或寄生虫病害防控。
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