长牡蛎(Crassostrea gigas)主要分布于我国长江口以北的江苏、山东、辽宁等地沿海, 常见垂直分布于低潮线附近, 是我国北方最重要的海产贝类之一。得益于四倍体技术的发明和应用, 长牡蛎三倍体实现了产业化养殖^[1]。近年来, 随着长牡蛎养殖规模不断扩大, 消费者对于优质品种的需求不断增长, 相关从业者开展了大量选育工作。长牡蛎养殖产量与体质量直接相关, 因而在选育过程中, 重量性状常作为直接育种性状, 从遗传层面看, 长牡蛎的重量性状, 全湿重和软体重均属于数量性状, 与壳型性状, 壳高、壳长和壳宽之间相互关联程度较高。相较于重量性状, 贝类壳型性状更易于测量, 探明壳型性状与重量性状之间的相关性, 明确壳型性状对重量性状的决定系数, 有助于提高长牡蛎的新品种选育效率和准确性。

利用通径分析和多元回归方法评价贝类表型性状是贝类遗传育种的基础工作之一, 其结果可用于优化海洋贝类的育种策略^[2]。Luo等^[3]对两种杂交鲍(Haliotis discus hannai /Haliotis gigantea)的表型性状进行分析, 认为壳型性状与体质量呈显著正相关; Huo等^[4]研究发现形态性状是影响菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)活体重的主要因素; Zhang等^[5]分别讨论了壳型性状对文蛤(Meretrix meretrix)和青蛤(Cyclina sinensis)全湿重的影响, 发现壳高和壳宽对全湿重有重要的影响, 并构建了多元回归模型。在牡蛎的选育研究中, 孙泽伟等^[6]研究结果表明近江牡蛎(C. ariakensis)壳长、壳高、壳宽、活体重和软体重的相关性均达到显著水平, 而形态性状对活体重和软体重具有相同的影响, 其中壳高的直接作用最大, 壳宽的作用最小; 韩自强等^[7]研究认为长牡蛎(C. gigas)壳橙品系壳高、壳宽和壳长对活体重的直接影响依次减少, 壳高是影响活体全湿重的主要因素, 但是还存在对软体部重影响较大的其他因素。虽然在牡蛎选育研究中应用较广, 但关于三倍体牡蛎及其与二倍体牡蛎的比较研究尚未见报道。作者以普通二倍体长牡蛎和三倍体长牡蛎为研究对象, 探究各自数量性状之间的相关与通径分析, 比较了二者多元回归的差异为不同倍性长牡蛎的比较研究提供了基础。

1 材料方法 1.1 实验材料

2018年11月, 在乳山市牡蛎养殖基地随机采集20月龄的健康无损伤二倍体长牡蛎(D, Diploid)和三倍体长牡蛎(T, Triploid)单体各75个, 筏式养殖水层3~5 m。

1.2 数据测量

利用牡蛎刀将长牡蛎二倍体和三倍体壳表面清理干净后吸去水分, 用游标卡尺测量样本壳高(H, Height; $x_1^{D / T}$)、壳长(L, Length; $x_2^{D / T}$)和壳宽(W, Width; $x_3^{D / T}$); 用电子天平称量个体全湿重(TWW, Total Wet Weight; $x_4^{D / T} / y_1^{D/T}$), 随后, 将牡蛎解剖称量牡蛎软体部重(STW, Soft Tissue Weight; $y_2^{D/T}$); 个体全湿重和软体重精确到0.01 g, 长度参数精确至0.01 mm。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件、R-Asreml 4.0.3 (Windows 64位版)(R包: agricolae 1.3.0-2、car 3.0-8等)进行实验设计、数据统检、方差分析等, 差异显著性设置为P < 0.05。分别以全湿重和软体重为因变量$y_k^{D/T}$(k=1, 2), 以壳型性状为自变量${x_i^{D/T}}$(i=1, 2, 3, 4), 利用通径分析确定自变量对因变量的直接作用和间接作用, 进行逐步回归建立最优多元回归方程。

变异系数(C.V.)的计算公式^[8]:

$ C . V .=\frac{S . D .}{\text { Mean }} \times 100 \% ,$

(1)

式中, S.D.为标准偏差, Mean为平均值;

通径系数(P_i)表示自变量$y_k^{D/T}$对因变量$x_i^{D/T}$的直接作用, 计算公式为^[9]:

$ P_i=b_{x_i^{D / T}}+\frac{\sigma_{x_i^{D / T}}}{\sigma_{y_k^{D / T}}},$

(2)

式中, $b_{x_i^{D / T}}$为自变量的回归系数, $\sigma_{x_i^{D / T}}$为自变量的标准差, $\sigma_{y_k^{D / T}}$为因变量的标准差;

间接通径系数(P_ij)表示自变量$ {{x}_{i}^{D/T}} $通过自变量${{x_j^{D/T}}}$对因变量${{y_k^{D/T}}}$的间接作用, 计算公式为^[10]:

$ P_{ij }= r_{ij}P_{j}, $

(3)

式中, r_ij为两性状间的相关系数, P_j为$x_i^{D/T}$对$y_k^{D/T}$的通径系数;

多元回归分析中, 决定系数为通径系数的平方, 自变量$x_j^{D/T}$对因变量$y_k^{D/T}$的决定系数, 计算公式为^[9]:

$ C d_i=P_i^2, $

(4)

两不同性状${{x_i^{D/T}}}$和${{x_j^{D/T}}}$共同对${{y_k^{D/T}}}$的共同决定系数(Cd_iJ), 计算公式为^[9]:

$ C d_{i J}=2 P_i P_j r_{i j}, $

(5)

$y_k^{D/T}$对${{x_i^{D/T}}}$的多元线性回归方程^[11]:

$y_k^{D / T}=\mathrm{a}+\sum b_i \times x_i^{D / T},$

(6)

式中, a为常数, b_i为偏回归系数, $x_i^{D/T}$为对体质量影响显著的自变量。

2 结果与分析 2.1 表型性状参数分析

长牡蛎二倍体、三倍体样本表型性状参数见表 1, 各性状参数经Shapiro-Wilk检验, 均满足正态分布; 二倍体和三倍体的体质量变异系数均大于壳型性状的变异系数, 且软体重的变异系数均最大。因此, 对采样海域养殖的长牡蛎进行人工选择时, 应首先考虑体质量(软体重和全湿重), 其次才是长度参数(壳高、壳长、壳宽)。

2.2 各性状间的相关性分析

二倍体长牡蛎和三倍体牡蛎的各性状间相关系数都列于表 2中。在20个相关性分析中, 只有4个不显著, 其余16个均达到显著水平(P < 0.05); 体质量无论是二倍体还是三倍体, 相关系数最大的都是在全湿重与软体重间, 分别高达0.886和0.675, 这说明全湿重与软体重之间有较高的正向联系。

二倍体长牡蛎与三倍体长牡蛎通径分析结果见表 3。结果显示, 二倍体长牡蛎的3个壳型性状对全湿重的直接作用均比较高(最低的为0.380), 三者并未出现主要决定性状, 对软体重的直接作用均比较低(最高的仅为0.154), 而全湿重与软体重的直接作用最强(高达0.780)。因此, 育种工作中, 可以通过选择壳高来提高全湿重, 进而提高软体重。当然最直接的还是直接通过选择全湿重来提高软体重。在软体重的通径分析中, 全湿重与软体重的直接作用最强为0.780, 而多元回归被剔除的壳长对软体重直接作用最小为–0.072, 小于其间接作用0.482, 此外, 壳高和壳宽对软体重的直接作用同样小于其间接作用; 三倍体长牡蛎全湿重直接作用最大的为壳宽0.471, 最小的为壳长0.275, 壳型性状壳高、壳长和壳宽对全湿重的直接作用均大于间接作用; 全湿重和壳高对三倍体长牡蛎软体重的直接作用为0.348和0.367均大于其间接作用, 而壳长和壳宽对软体重的直接作用均小于其间接作用。

2.3 壳型性状对长牡蛎体质量的作用分析

总决定系数(R²)为直接决定系数和间接决定系数的总和, 大小近似等于拟合度相关指数值(r²)。壳型性状对体质量的决定系数分析结果见表 4, 壳高对二倍体长牡蛎全湿重的决定系数最高为0.225; 逐步回归结果显示, 模型拟合度随自变量壳高、壳长和壳宽的引入而增加, 但剩余因子数值仍较大为0.489, 说明对全湿重的多元回归模型仍待补充除壳型性状外的其他因素以提高拟合精度; 在对软体重的逐步回归中, 模型保留了二倍体牡蛎的壳高和壳宽参数进行拟合, 总决定系数为0.776, 剩余因子数值为0.473, 而二倍体长牡蛎壳高和全湿重对软体重的决定系数分别为0.024和0.608; 单性状中, 壳高对二倍体长牡蛎全湿重的决定系数最高, 而对软体重决定程度最高的是全湿重。

在对三倍体长牡蛎性状进行分析时, 壳高、壳长以及壳宽对牡蛎全湿重的总决定系数为0.494; 逐步回归结果显示, 壳型性状作为自变量引入时拟合度随之增加, 但剩余因子数值仍较大为0.711, 说明除壳型性状外仍有对三倍体总湿重影响较大的因素尚未考虑到; 单性状中, 壳宽对三倍体长牡蛎全湿重的决定系数最高为0.222; 在对三倍体长牡蛎软体重的逐步回归分析中, 模型保留了壳高、壳长和全湿重三个参数进行拟合, 总决定系数为0.504, 剩余因子数值为0.704, 其中全湿重和壳高的直接决定系数最高分别为0.135和0.121, 因此, 在对三倍体软体重性状进行选择时建议优先考虑全湿重和壳高两个参数。

2.4 多元回归方程的建立

长牡蛎形态性状偏回归系数分析结果见表 5, 壳高($x_1^{D/T}$)、壳长($x_2^{D/T}$)和壳宽($x_3^{D/T}$)参数对长牡蛎二倍体和三倍体的全湿重($y_1^{D/T}$)均有显著影响; 壳宽($x_3^{D}$)和全湿重($x_4^{D}$)参数对二倍体长牡蛎软体重($y_2^{D}$)有显著作用; 壳高($x_1^T$)、壳长($x_2^T$)和全湿重($x_4^T$)参数则对三倍体长牡蛎软体重($y_2^T$)有显著作用, 因变量与自变量之间线性关系显著, 所选壳型性状均达到显著水平及以上(P < 0.05)。因此, 利用逐步回归法分别建立以长牡蛎二倍体和三倍体软体重及全湿重为因变量的最优回归方程, 此外, 经回归预测, 估计值与实际观察值差异不显著, 说明方程可, 有效地应用于实际生产中。最优回归方程如下:

$\begin{aligned} &y_1^D=-131.406+0.908 x_1^D+1.416 x_2^D+1.889 x_3^D \\ &\left(r^2=0.757, F=73.89, P<0.01\right), \end{aligned}$

(7)

$ \begin{aligned} &y_2^D=-1.221+0.125 x_3^D+0.132 x_4^D \\ &\left(r^2=0.766, F=117.80, P<0.01\right), \end{aligned} $

(8)

$\begin{aligned} &y_1^T=-65.220+0.749 x_1^T+0.759 x_2^T+2.219 x_3^T \\ &\left(r^2=0.493, F=23.00, P<0.01\right), \end{aligned} $

(9)

$ \begin{aligned} &y_2^T=-10.937+0.118 x_1^T+0.080 x_2^T+0.065 x_4^T \\ &\left(r^2=0.583, F=33.09, P<0.01\right). \end{aligned} $

(10)

3 讨论

牡蛎个体全湿重直接反映了养殖产量, 而软体重在某种程度上将决定牡蛎的品质。相较体质量牡蛎壳的形状更易于测量, 利用相关性分析和通径分析探明牡蛎壳长、壳高、壳宽与个体全湿重、软体重之间的关系, 以及壳型性状对体重的决定系数, 有助于通过壳型性状的选择直接提高牡蛎产量或品质。相比二倍体牡蛎, 三倍体牡蛎由于育性差, 使得其软体部更饱满, 个体生长往往更快。为了比较二倍体和三倍体壳型性状对体质量的影响, 实验选取成体长牡蛎二倍体和三倍体, 以全湿重和软体重作为产量和品质的参考, 目的在于为不同倍性长牡蛎的生产性能比较提供依据。

3.1 长牡蛎二倍体和三倍体形态差异比较

本研究长牡蛎苗种来源于同批次培育的普通二倍体和全三倍体(四倍体♂×普通二倍体♀), 因而, 对二者进行比较具有一定的参考价值。二倍体长牡蛎和三倍体长牡蛎形态差异比较发现, 20月龄二倍体长牡蛎的平均壳高、壳长、壳宽、全湿重和软体重均小于20月龄三倍体长牡蛎, 但各项参数差异不显著(P > 0.05); 二者全湿重和软体重的变异系数均高于壳型性状; 壳型性状中壳宽的变异系数最高, 二倍体的壳高变异系数与壳长相当, 而三倍体的变异系数要小于二倍体; 这说明, 在相同养殖条件下, 三倍体长牡蛎生长性能要略优于二倍体, 这一结论与此前多数学者的研究结论一致^[12]。分析认为, 三倍体牡蛎的生长优势可能不仅得益于其育性差, 也得益于其生长基因的调控。

3.2 相关性和回归分析比较

在其他种类牡蛎的研究中, 福建牡蛎^[13]壳型性状的相关系数为–0.064~0.106, 与体质量的相关系数为–0.232~0.514; 香港牡蛎^[14]壳型性状相关系数为–0.047~0.451, 与体质量的相关系数为0.202~0.820; 近江牡蛎^[6]壳型性状的相关系数为0.167~0.441, 与体质量的相关系数为0.292~0.820。本研究结果显示, 二倍体长牡蛎壳型性状的相关系数为0.185~0.235, 与体质量的相关系数为0.414~0.866, 而三倍体长牡蛎壳型性状的相关系数为0.140~0.243, 与体质量的相关系数为0.409~0.675。比较发现, 长牡蛎二倍体和三倍体壳型性状的相关系数与近江牡蛎^[6]相似, 壳型性状与体质量的相关系数明显高于福建牡蛎^[13]。分析认为, 由于遗传背景和养殖环境等的差异, 不同牡蛎壳型性状的相关程度不同, 但贝类的壳型性状之间普遍存在相关性, 而其与体质量的相关程度均达到显著水平(P < 0.05), 说明壳型性状与体质量的相关分析具有实际意义。

相关指数或总决定系数大于或等于0.85时, 可以确定影响因变量的主要性状^[15]。韦嫔媛等^[16]研究发现, 小规格香港牡蛎壳型性状与全重的相关指数大于0.85, 而中规格和大规格均小于0.85, 说明影响小规格香港牡蛎全重的多数性状已进行分析。本研究中壳型性状对二倍体和三倍体长牡蛎全湿重的相关指数分别为0.761和0.494, 说明除了壳高、壳长和壳宽外, 还有其他因子尚未被纳入自变量进行分析, 在对福建牡蛎^[13]和近江牡蛎^[6]的研究中也得到类似的结果。此外, 本研究中自变量对二倍体和三倍体长牡蛎软体重的相关指数均小于0.85, 同样说明还有其他因子尚未被纳入自变量进行分析, 需要进一步的研究和分析来确定主要性状。而二倍体相较三倍体普遍较高的相关指数可能与二倍体规格偏小且变异系数普遍较大有关。

本研究中, 二倍体和三倍体表现出不同的体型特征, 说明影响其各自体质量的主要形态性状有所不同。在牡蛎的有关研究中, 影响体质量的主要因子多为壳高性状^{[7, 13]}, 与本文对二倍体长牡蛎全湿重的分析结果一致, 即壳高对全湿重的直接作用最高为0.474, 而壳长和壳宽的直接作用略小但二者相当, 而三倍体长牡蛎的壳宽对全湿重的直接作用最高, 结果与相关系数大小关系相一致, 我们推测可能是由于本研究中的二倍体牡蛎壳形狭长, 而三倍体牡蛎壳宽相对较大有关。本文通径分析认为壳高是影响二倍体长牡蛎全湿重的最主要性状, 但是多元回归分析中对全湿重的偏回归系数影响最大的是壳宽, 二者之间有一定差异。偏回归系数的本质是自变量对因变量影响程度, 但是没有经过处理的回归系数会因为自变量的变异程度和均数造成差异, 无法直接通过偏回归系数比较自变量对因变量的直接影响程度。因而, 一般通过直接作用来判断单一性状的重要性。本研究中体质量数据显示, 三倍体牡蛎总湿重和软体重变异系数均低于二倍体, 说明三倍体牡蛎生长的一致性好于二倍体, 但二倍体牡蛎软体重占总湿重的比值更高, 这可能与牡蛎性腺发育的程度相关, 这可能是造成通径分析中二倍体牡蛎总湿重对软体重的直接作用较高(0.780), 而三倍体则相对较低(0.367)的原因。但是整体上来看, 直接作用分析结果基本与相关关系的大小一致, 不论二倍体还是三倍体总湿重对软体重的决定系数均高于壳形参数。

3.3 多元回归方程的建立和比较

某一个变量可以用另一个变量的线性表达式来表示, 说明两个变量间存在共线性^[17], 通径分析是多重共线性的一种分析方法^[18], 通过保留通径系数显著的自变量, 进行逐步回归, 最终建立最优回归方程。本研究中, 长牡蛎二倍体和三倍体的壳长、壳宽、壳高之间的相关性均显著(P < 0.05), 多元回归关系和偏回归系数均达到显著水平(P < 0.05), 说明可以通过测量壳高、壳长和壳宽性状对长牡蛎二倍体和三倍体的全湿重性状进行预测, 而对长牡蛎二倍体软体重进行预测需要测定全湿重和壳宽, 对三倍体长牡蛎软体重进行预测则需要测定全湿重、壳长和壳宽性状。这种对软体重预测差别, 说明通过壳形性状对二倍体长牡蛎和三倍体长牡蛎在体质量上的差异进行预测有一定可行性。

4 结语

本文利用相关分析、通径分析和多元回归等方法对长牡蛎二倍体和三倍体群体的壳型性状和体质量进行了研究, 结果表明, 二倍体长牡蛎和三倍体长牡蛎软体重变异系数均最高, 性状间相关性均达到显著水平(P < 0.05), 全湿重和软体重的相关性较高分别为0.866和0.675; 多元回归分析结果显示, 壳长、壳高和壳宽对二倍体长牡蛎全湿重的影响相当, 其中壳高最大, 直接作用系数为0.474, 对软体重影响最大的是全湿重, 直接作用系数高达0.780; 壳宽对三倍体长牡蛎全湿重的影响最大, 直接作用系数为0.471, 壳高和湿重对软体重的直接作用系数高达分别为0.348和0.367。建立了关于长牡蛎二倍体和三倍体壳型性状与重量参数的多元回归方程, 为不同倍性长牡蛎壳形的比较研究提供了一种分析方法, 同时为长牡蛎壳形选育提供理论依据。