2022, Vol. 46
表1(Table 1)
花鲈Claudins基因家族的鉴定、进化分析及对环境盐度的表达响应
文章信息
- 李俊杰, 于朋, 李昀, 田源, 张凯强, 王海亮, 齐鑫, 温海深. 2022.
- LI Jun-jie, YU Peng, Li Yun, TIAN Yuan, ZHANG Kai-qiang, WANG Hai-liang, QI Xin, Wen Hai-shen. 2022.
- 花鲈Claudins基因家族的鉴定、进化分析及对环境盐度的表达响应
- Identification and evolutionary analysis of Claudins gene family in spotted sea bass and its expression characteristics in gill tissue under different salinity
- 海洋科学, 46(8): 65-78
- Marine Sciences, 46(8): 65-78.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20210203001
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文章历史
- 收稿日期：2021-02-03
- 修回日期：2021-03-09
引用本文
李俊杰, 于朋, 李昀, 田源, 张凯强, 王海亮, 齐鑫, 温海深. 2022. 花鲈Claudins基因家族的鉴定、进化分析及对环境盐度的表达响应[J]. 海洋科学, 46(8): 65-78.
LI Jun-jie, YU Peng, Li Yun, TIAN Yuan, ZHANG Kai-qiang, WANG Hai-liang, QI Xin, Wen Hai-shen. 2022. Identification and evolutionary analysis of Claudins gene family in spotted sea bass and its expression characteristics in gill tissue under different salinity[J]. Marine Sciences, 46(8): 65-78.
花鲈Claudins基因家族的鉴定、进化分析及对环境盐度的表达响应
中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室, 山东 青岛 266003
摘要：Claudin (cldn)是细胞间紧密连接蛋白的重要功能和结构组件, 通过控制细胞旁通路通透性参与渗透压平衡的调节。本研究对花鲈(Lateolabrax maculatus)cldns基因家族进行了系统的鉴定分析, 结果表明: 花鲈cldns基因家族共包含55个成员, 分布于16条染色体上, 其中34个cldns基因在哺乳动物体内有对应直系同源基因, 其余21个cldns是硬骨鱼所特有。选择压力分析显示预测的花鲈cldns蛋白的跨膜区域存在14个受正选择作用的氨基酸位点, 这些正选择位点可能与家族内基因的多样性和功能分化有关。此外, 基于花鲈鳃转录组的基因表达结果表明, 至少有24个cldns基因在鳃中表达, 其中cldn8c、cldn10b、cldn10c、cldn10d、cldn27a和cldn30b在不同环境盐度处理后表达差异显著, 表明其可能是花鲈鳃组织中调节渗透压平衡的候选功能基因。本研究成果为研究花鲈及其他广盐性鱼类cldns基因家族成员的渗透调节机制奠定了理论基础。
关键词：Claudins基因家族 花鲈 盐度 进化分析
Identification and evolutionary analysis of Claudins gene family in spotted sea bass and its expression characteristics in gill tissue under different salinity
The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
Abstract: Claudin (cldn) is an important functional and structural component of the intercellular tight junction protein, which is involved in the regulation of osmotic pressure balance by controlling the permeability of cellular bypass pathways. In the present study, cldn gene family was systematically identified and characterized in spotted sea bass (Lateolabrax maculatus). The results showed that there were 55 members in cldns gene family of spotted sea bass, which were distributed on 16 chromosomes. Among them, 34 members have their direct homologous genes in mammals, and the remaining 21 cldns genes seemed to be teleosts-specific. Selection pressure analysis showed that 14 amino acid sites were positively selected in the predicted transmembrane region of cldns protein, which may be associated with the gene diversity and functional differentiation within the family. Additionally, the expression levels of at least 24 cldns genes were detected in the transcriptome of gills in spotted sea bass and cldn8c、cldn10b、cldn10c、cldn10d、cldn27a and cldn30b showed significant expression differences between different salinity environment, suggesting their key roles in regulating osmotic pressure balance in gills of spotted sea bass. This study provides a theoretical basis for studying the osmotic regulation mechanism of cldns gene family in spotted sea bass and other teleosts.
Key words:
Claudins gene family Lateolabrax maculates salinity evolutionary analysis
紧密连接通过平衡细胞间通路调节细胞旁运输, 在渗透调节中发挥重要作用。紧密连接复合蛋白由封闭蛋白(claudin)、闭合蛋白(oocludin)、缝隙连接蛋白(ZO-1)以及激动蛋白细胞骨架(actin cytoskeleton)构成[1]。其中, Claudin是一个多基因家族, 常简写为cldn, 是构成细胞间紧密连接必不可少的组成部分, 可调节水和离子在细胞垂直方向跨细胞紧密连接的细胞旁运动[2], 对于细胞间密封的形成和紧密连接的渗透性的控制都至关重要[3]。
Claudin是一种四跨膜蛋白, 其中, 第1个与第2个跨膜结构域高度保守, 氨基与羧基都分布在细胞内, 羧基末端富含丰富的丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基[4]。Claudin对细胞连接处选择渗透性的调节主要通过蛋白激酶途径实现, cldn上特异性的氨基酸靶点与蛋白激酶A或蛋白激酶C结合, 磷酸化后紧密连接功能下降, 表现为氯化物渗透性增强[5]。不同的cldn成员存在组织特异性的表达, 并对离子交换的选择性不同, 它们以多种组合方式参与构成紧密连接复合蛋白, 增加了紧密连接的结构和功能的多样性, 形成了不同类型的屏障功能[6]。目前, 已有大量cldns基因被鉴定出来, 不同物种间基因数存在较大差异: 无脊椎动物如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)只有4到5个cldns相关基因[7-8], 在哺乳动物中, 有24个cldns家族成员被发现[3], 而在硬骨鱼中, 由于硬骨鱼特异的全基因组复制(WGD)和串联重复事件, 先后共有63个cldns被发现[9]。最大的扩增事件发生在cldn4上: 人类cldn4与13个鱼类cldns基因显示出同源关系(cldn27a-d、cldn28a-c、cldn29a-b、cldn30a-d)[10]。
鱼类的cldn基因与渗透压调节和盐度适应存在着密切的关系。鳃是鱼类调节渗透压最重要的器官之一。透射电镜观察结果表明, 当鱼体从淡水转入海水中时, 鳃上皮离子细胞和附属细胞间紧密连接的超微结构由封闭的“栅栏”变为泄漏的“孔状”[11]。这两种细胞类型间存在着渗漏的紧密连接, 对于鳃上皮分泌多余的Na+提供了至关重要的细胞旁通路[12], 而cldns对于调节水和离子在细胞垂直方向跨细胞紧密连接的细胞旁运动至关重要。实验结果显示, 高渗环境诱导大西洋鲑鱼鳃中cldn10e的表达, 低渗环境则诱导大西洋鲑鱼鳃中cldn27a和cldn30的表达[13]。而在罗非鱼的鳃组织中, 低渗环境诱导cldn28a和cldn30的表达[14]。此外, 在两种河豚(Tetraodon nigro virids和T. biocellatus)鳃中均发现了cldn27mRNA的盐度依赖性差异表达[15-16]。Marshall等[17]探究了底鱂cldn10亚型在不同盐度下的适应变化, 结果表明环境盐度的增加提升了cldn10不同亚型的表达量。对于瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)的cldn基因家族的选择压力分析显示, cldn7为正选择基因, 表明其在促进离子转运和酸碱调节以适应高盐碱的自然环境中发挥潜在作用[18]。
花鲈(Lateolabrax maculatus)是我国重要的海产经济鱼类, 具有典型的广盐性特征, 可在盐度0~45的范围内正常存活、生长, 是研究鱼类盐度耐受性及渗透压调节机制的理想模型。本文对花鲈cldn基因进行了全基因组的鉴定和注释, 并对其基因结构及进化特征进行分析, 同时开展了它们在不同盐度下鳃组织中的表达特征分析, 以期筛选与盐度适应和渗透压调节相关的cldn基因, 为进一步研究花鲈对急性盐度胁迫的生理响应以及花鲈的耐盐机制研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验用鱼及暂养条件实验用1龄花鲈[(100.00±2.34) g]取自山东省东营市双瀛水产苗种有限责任公司, 实验开始前花鲈暂养在盐度为30的水泥池(5 m×5 m×1 m)中, 温度为(21.0±0.5) ℃, pH值为7.98~8.04, 溶解氧含量为6.90~8.54 mg/L, 亚硝酸盐 < 0.1 mg/L, 光照周期14L: 10D。
1.2 盐度处理实验本实验共设计3个盐度组, 分别为0(淡水组)、12(等渗组)、30(海水组), 每个盐度组设置3个重复。实验开始后, 将暂养的花鲈转移至不同盐度的水桶中, 实验每个重复养殖5尾花鲈, 实验进行30 d, 每日8: 30和16: 30投喂配合饲料, 每2 d换一次水, 换水量为50%。实验结束后, 每个盐度组至少随机选取3尾鱼进行鳃组织取样并迅速保存于液氮中, 随后置于−80 ℃超低温冰箱中保存备用。
1.3 花鲈cldn基因的鉴定和序列分析从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中检索获取人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、红鳍东方鲀(T. rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)4种物种的所有cldn基因的氨基酸序列, 利用TBLASTN (1e-5)对花鲈参考基因组(NCBI登录号: PRJNA408177)和转录组数据库(NCBI登录号: SRR4409341和SRR4409397)进行检索, 初步获得花鲈cldn候选基因序列。利用在线工具open reading frame (ORF) finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)筛选出完整的开放阅读框, 并预测氨基酸序列, 通过smartblast比对NCBI非冗余(nr)蛋白序列数据库进行进一步验证。利用NCBI-CDD数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对鉴定得到的花鲈cldn基因的特征结构域进行验证。使用ExPASyProt-Param工具(https://web.expasy.org/protparam/)计算每个预测的cldn蛋白的分子量(MW, kDa)和等电点(pI)。根据其他几种脊椎动物的基因组数据库对不同物种的cldns基因拷贝数进行比较。
1.4 Cldns的系统发育分析及染色体分布对花鲈、人、小鼠、斑马鱼以及硬骨鱼红鳍东方鲀的cldns氨基酸序列进行系统发育分析。利用ClustalW进行比对(默认参数)。通过MEGA 7.0软件, 采用Neighbor-Joining (NJ)法构建系统进化树, bootstrap数值选择1 000[19]。利用在线软件Interactive Tree Of Life (http://itol.embl.de/)对进化树进行作图。通过花鲈基因组数据库获取染色体位置与基因密度信息, 通过MCScanX (默认参数)挖掘共线性信息[20]。根据每个cldn基因在基因组上的坐标定位其染色体位置, 并使用TBtools软件进行结果可视化[21]。
1.5 花鲈Cldns基因家族的进化选择压力分析使用MUSCLE方法对55条花鲈cldns的预测的氨基酸序列进行比对。使用MEGA 7.0程序的最大似然法对花鲈cldns构建系统发育树, 基于物种内部cldns序列的系统发育关系和后续分析的需要, 本文将cldns家族成员分为4组: ClassⅠ、Class Ⅱ、Class Ⅲ和Class Ⅳ。使用PAL2NAL (http://www.bork.embl.de/pal2nal/)获得准确比对的核苷酸序列, 用于获得后续选择压力分析。
基于花鲈cldns家族物种内的系统发育树, 采用PAML 4.9i的CODEML程序[22], 利用不同的模型(枝模型、位点模型、枝位点模型), 对4组主要的进化枝进行选择压力分析。计算非同义替换与同义替换的比值ω值, 即dN/dS。当ω=1时, 为中性进化(Neutral selection), 即不受选择; 当ω > 1时, 为正选择(positive selection); 当0 < ω < 1时, 为负选择(nega tive selection), 也叫净化选择或纯化选择(purifying selection)。本文利用EasyCodeML程序对3种模型的各项参数进行计算[23], 采用似然比检验(LRT)比较模型对的拟合程度, 采用贝叶斯法对正选择位点进行识别[24]。
1.6 基因表达分析利用花鲈在不同盐度条件下的鳃组织转录组数据库(NCBI登录号: PRJNA515986)进行meta分析, 对每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数(RPKM)值进行归一化处理后, 基于RPKM计算cldns在每个组之间的表达倍数变化(海水组/等渗组、淡水组/等渗组、淡水组/海水组)。满足总read数≥5、log2|(差异表达倍数)|≥1、P值≤0.05的基因被认为是显著差异表达基因。
2 结果 2.1 花鲈cldns基因家族成员的鉴定在花鲈全基因组范围内共鉴定获得55条cldns序列(表 1), CDS长度387~1 284 bp, 编码蛋白长度为128~427个氨基酸。除cldn10b和cldn28b外, 分子量均在80 kDa以下。此外, 各cldns等电点和保守结构域的位置在表 1中列出。
表 1 花鲈cldns基因家族成员的序列特征 Tab. 1 Summary of characteristics of cldns genes in spotted sea bass
| 基因 | CDS长度/bp | 分子量/kDa | 等电点 | 预测氨基酸长度 | 保守结构域位置 | NCBI登录号 |
| cldn1a | 636 | 52.41 | 5.14 | 211 | 13~546 | MW575141 |
| cldn1b | 603 | 49.31 | 5.13 | 200 | 46~369 | MW575142 |
| cldn2 | 822 | 67.51 | 5.04 | 273 | 67~546 | MW575143 |
| cldn3a | 648 | 54.21 | 5.10 | 215 | 10~513 | MW575144 |
| cldn3b | 657 | 54.08 | 5.12 | 218 | 13~543 | MW575145 |
| cldn3c | 651 | 54.75 | 5.11 | 216 | 7~540 | MW575146 |
| cldn3d | 672 | 55.60 | 5.11 | 223 | 13~468 | MW575147 |
| cldn5a | 648 | 52.89 | 5.11 | 215 | 13~543 | MW575148 |
| cldn5b | 645 | 52.84 | 5.09 | 214 | 16~504 | MW575149 |
| cldn5c | 555 | 45.39 | 5.15 | 184 | 13~543 | MW575150 |
| cldn6 | 636 | 53.09 | 5.10 | 211 | 1~534 | MW575151 |
| cldn7a | 642 | 53.62 | 5.10 | 213 | 10~546 | MW575152 |
| cldn7b | 684 | 57.03 | 5.07 | 227 | 283~606 | MW575153 |
| cldn8b | 522 | 44.14 | 5.15 | 173 | 1~297 | MW575154 |
| cldn8c | 843 | 71.51 | 5.07 | 280 | 1~297 | MW575155 |
| cldn8d | 876 | 72.90 | 5.05 | 291 | 169~693 | MW575156 |
| cldn10a | 597 | 49.81 | 5.13 | 198 | 10~483 | MW575157 |
| cldn10b | 1 038 | 86.10 | 5.05 | 345 | 58~414 | MW575158 |
| cldn10c | 750 | 63.10 | 5.14 | 253 | 22~549 | MW575159 |
| cldn10d | 771 | 64.12 | 5.08 | 256 | 22~540 | MW575160 |
| cldn11a | 657 | 55.35 | 5.09 | 218 | 16~525 | MW575161 |
| cldn11b | 651 | 54.74 | 5.06 | 216 | 10~522 | MW575162 |
| cldn14 | 741 | 62.88 | 5.07 | 246 | 64~543 | MW575163 |
| cldn15a | 669 | 55.16 | 5.14 | 222 | 13~528 | MW575164 |
| cldn15b | 675 | 55.92 | 5.15 | 224 | 13~528 | MW575165 |
| cldn15c | 660 | 54.45 | 5.11 | 219 | 7~537 | MW575166 |
| cldn15d | 675 | 56.11 | 5.09 | 224 | 10~537 | MW575167 |
| cldn18a | 780 | 64.27 | 5.10 | 259 | 10~594 | MW575168 |
| cldn18b | 675 | 54.74 | 5.14 | 224 | 55~363 | MW575169 |
| cldn18c | 660 | 53.52 | 5.14 | 219 | 133~441 | MW575170 |
| cldn19 | 669 | 55.46 | 5.10 | 222 | 10~546 | MW575171 |
| cldn20a | 729 | 60.92 | 5.08 | 242 | 10~543 | MW575172 |
| cldn20b | 837 | 69.75 | 5.04 | 238 | 64~543 | MW575173 |
| cldn23a | 840 | 68.76 | 5.02 | 279 | 52~552 | MW575174 |
| cldn23b | 759 | 62.32 | 5.09 | 252 | 22~618 | MW575175 |
| cldn27a | 390 | 32.64 | 5.22 | 129 | 7~270 | MW575176 |
| cldn27b | 747 | 62.08 | 5.07 | 248 | 34~543 | MW575177 |
| cldn27c | 390 | 32.11 | 5.22 | 129 | 7~258 | MW575178 |
| cldn27d | 621 | 52.34 | 5.11 | 206 | 10~504 | MW575179 |
| cldn28a1 | 639 | 53.39 | 5.11 | 212 | 10~504 | MW575180 |
| cldn28a2 | 639 | 53.39 | 5.11 | 212 | 10~504 | MW575180 |
| cldn28b | 1 284 | 107.49 | 4.98 | 427 | 358~789/844~1 155 | MW575181 |
| cldn29a | 633 | 52.10 | 5.14 | 210 | 13~504 | MW575182 |
| cldn29b | 387 | 32.22 | 5.23 | 128 | 7~264 | MW575183 |
| cldn30a | 624 | 52.14 | 5.12 | 207 | 13~504 | MW575184 |
| cldn30b | 666 | 54.74 | 5.13 | 221 | 10~543 | MW575185 |
| cldn30c | 645 | 53.31 | 5.12 | 214 | 13~543 | MW575186 |
| cldn30d | 756 | 61.52 | 5.10 | 251 | 22~324 | MW575187 |
| cldn31a | 648 | 54.53 | 5.10 | 215 | 10~543 | MW575188 |
| cldn31b | 669 | 54.60 | 5.11 | 222 | 10~549 | MW575189 |
| cldn32a | 636 | 53.03 | 5.10 | 211 | 13~510 | MW575190 |
| cldn32b | 690 | 57.68 | 5.08 | 229 | 10~546 | MW575191 |
| cldn33a | 699 | 57.98 | 5.07 | 232 | 10~542 | MW575192 |
| cldn33b | 624 | 51.40 | 5.13 | 207 | 19~516 | MW575193 |
| cldn34 | 756 | 62.51 | 5.07 | 251 | 55~588 | MW575194 |
对cldns各基因在花鲈、人、小鼠、鸡(Gallus gallus)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、斑马鱼及红鳍东方鲀7种脊椎动物中的拷贝数进行了总结分析。如表 2所示, 硬骨鱼cldns基因数目显著高于高等脊椎动物的cldns数目。花鲈、红鳍东方鲀和斑点叉尾鮰的cldns数目是人类的2倍以上, 表明cldns基因家族在硬骨鱼中产生了显著扩增。cldn4、cldn9、cldn16、cldn17、cldn22及cldn24为高等脊椎动物所特有, 而其直系同源物在硬骨鱼中缺失; 根据斑马鱼和红鳍东方鲀的命名规则: 硬骨鱼与哺乳动物(人)有直系同源关系的基因参照哺乳动物命名, 而与人无直系同源关系的基因从cldn25开始命名[10], 因此, cldn25之后的基因为硬骨鱼所特有。花鲈cldn1比其他硬骨鱼多了一个基因拷贝, 而cldn12在花鲈基因组中缺失, cldn18拥有3个拷贝, 多于所对比的任何一种硬骨鱼(表 2)。
表 2 cldns各基因拷贝数在几种典型脊椎动物中的比较 Tab. 2 Comparison of gene copy numbers of cldn genes among selected vertebrate genomes
| 名称 | 人 | 鼠 | 鸡 | 斑点叉尾鮰 | 斑马鱼 | 红鳍东方鲀 | 花鲈 |
| Cldn1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 |
| Cldn2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Cldn3 | 1 | 1 | 1 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Cldn4 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cldn5 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 3 | 3 |
| Cldn6 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| Cldn7 | 1 | 1 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| Cldn8 | 1 | 1 | 1 | 3 | 3 | 4 | 3 |
| Cldn9 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cldn10 | 1 | 1 | 1 | 5 | 4 | 5 | 4 |
| Cldn11 | 1 | 1 | 1 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Cldn12 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
| Cldn13 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| Cldn14 | 1 | 1 | 1 | 3 | 0 | 2 | 1 |
| Cldn15 | 1 | 1 | 0 | 2 | 3 | 2 | 3 |
| Cldn16 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cldn17 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cldn18 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 3 |
| Cldn19 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Cldn20 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 2 | 2 |
| Cldn21 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cldn22 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cldn23 | 1 | 1 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| Cldn24 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cldn25 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 |
| Cldn26 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 |
| Cldn27 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | 4 | 4 |
| Cldn28 | 0 | 0 | 0 | 2 | 3 | 3 | 3 |
| Cldn29 | 0 | 0 | 0 | 2 | 3 | 2 | 2 |
| Cldn30 | 0 | 0 | 0 | 4 | 3 | 4 | 4 |
| Cldn31 | 0 | 0 | 0 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| Cldn32 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| Cldn33 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 3 | 2 |
| Cldn34 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| Total | 24 | 26 | 14 | 52 | 43 | 56 | 55 |
花鲈的55个cldns基因分布于16条染色体上, 染色体5和染色体12分布着多个cldns串联重复基因(图 1)。如图 2所示, 两基因簇分别与人类的cldn3和cldn4具有较高的同源性。此外, 3号、8号、16号、18号和20号染色体分别包含1个cldn基因, 15号、17号和23号染色体分别包含2个cldn基因, 10、11、19号染色体各含有3个cldn基因, 而2号染色体包含4个cldn基因。花鲈的cldn18c定位于scaffold524上, 未挂载到染色体上(图 1)。
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| 图 1 花鲈cldns基因的染色体分布情况 Fig. 1 Chromosomal locations of cldn genes of spotted sea bass 注: 黑色线条代表每个cldn基因在染色体上的位置, 基因组所有基因的共线性关系由灰色线条表示。橙色外环代表每个染色体上的基因密度 |
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| 图 2 人cldn3、cldn4及红鳍东方鲀和花鲈cldn3-like、cldn4-like基因簇在染色体上的定位和位置关系 Fig. 2 The order of duplication of the claudin 3- and 4-like genes in fugu and spotted sea bass 注: 红色虚线表示染色体内的基因复制, 黑色虚线表示染色体片段间的基因复制 |
选取人、鼠、红鳍东方鲀、斑马鱼以及花鲈共202条cldns氨基酸序列构建系统进化树。如图 3所示, 这些基因共聚为7组进化枝。总的来说, 大多数花鲈cldns基因与已知其他物种的同类基因聚在一起。共有34个花鲈cldns基因与哺乳动物cldns基因同源, 其余21个cldns是硬骨鱼所特有[10]。其中, 花鲈cldn1具有两个拷贝(cldn1a和cldn1b), 由图 3可知, 二者的系统发育关系较远。因此, 为进一步证实花鲈cldn1基因注释的准确性, 我们进行了共线性分析(图 4), 结果显示花鲈cldn1a与红鳍东方鲀的cldn1具有高度保守的相邻基因, 而由于cldn1在红鳍东方鲀为单拷贝, 我们选取双色雀鲷(Eupomacentrus partitus)与花鲈的cldn1b进行共线性分析, 结果证明花鲈cldn1b与其cldn1-like具有相似的邻近基因, 证实了花鲈cldn1基因的命名的准确性。
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| 图 3 cldns基因家族各成员系统进化树 Fig. 3 Phylogenetic tree of members of cldn genes family 注: 红点表示鉴定出的花鲈cldns基因, 不同颜色表示不同的进化枝 |
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| 图 4 cldn1基因共线性分析 Fig. 4 Syntenic analysis of cldn1 |
将花鲈55条cldns氨基酸序列构建物种内的进化树, 依据聚类关系将55条cldns共分为4个大组: Class Ⅰ包含cldn3-like和cldn4-like等多个旁系同源基因, 多为硬骨鱼较高等脊椎动物所特有的基因; Class Ⅱ包括cldn1、cldn7、cldn10、cldn15和cldn19; Class Ⅲ包括cldn1、cldn2、cldn14、cldn20; Class Ⅳ包括cldn11、cldn18、cldn23、cldn33、cldn34(图 5)。
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| 图 5 花鲈cldns系统进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of members of cldns in spotted sea bass |
采用枝位点模型检测不同分支上不同位点受到的选择压力。结果如表 3所示: 将Class Ⅰ、Class Ⅱ、Class Ⅲ和Class Ⅳ四大枝分别作为前景枝, 每次计算时将其他分支标记为背景枝, 结果表明, 除Class Ⅱ以外均检测到受正选择作用的氨基酸位点, 在Class Ⅰ分枝中, 有6.38%的位点受到正选择压力, 139Y为正选择位点(P > 0.95); 在Class Ⅳ的分支上, 115D在P > 0.95这个置信水平上被认为是受正选择的氨基酸位点; 在Class Ⅲ的分支上, 在P > 0.95的置信水平上在蛋白的跨膜区域有14个位点被检测出来: 92A、93S、100G、102K、105K、115D、117I、135A、136V、137S、139Y、140A、143V、174A。但就整体而言, 四大枝的ω值仍远小于1, 处于负选择。
表 3 支位点模型的参数估计与似然比检验 Tab. 3 Parameter estimation and likelihood ratio test of Branch-site model
| 进化枝 | 模型比较 | 参数估计 | 似然比检验 | 正选择位点 |
| Class Ⅰ | Model A (np=111) vs Model A null (np=110) |
P0=0.748 80 P1=0.187 40 (P2a+P2b=0.063 8) ω0=0.207 89 (ω1=1.000 00) ω2=1.000 00 |
0.000 157 094 | 139Y (P > 0.95) |
| Class Ⅱ | Model A (np=111) vs Model A null (np=110) |
P0=0.799 87 P1=0.200 13 (P2a+P2b=0.000 00) ω0=0.204 97 (ω1=1.000 00) ω2=1.000 00 |
0.379 410 220 | None |
| Class Ⅲ | Model A (np=111) vs Model A null (np=110) |
P0=0.385 44 P1=0.096 42 (P2a+P2b=0.518 14) ω0=0.209 02 (ω1=1.000 00) ω2=1.000 00 |
0.161 845 675 | 92A 93S 100G 102K 105K 115D 117I 135A 136V 137S 139Y 140A 143V 174A (P > 0.95) |
| Class Ⅳ | Model A (np=111) vs Model A null (np=110) |
P0=0.658 92 P1=0.164 92 (P2a+P2b=0.176 15) ω0=0.206 93 (ω1=1.000 00) ω2=1.000 00 |
0.003 374 406 | 115D (P > 0.95) |
对不同盐度条件下的花鲈鳃组织的转录组数据进行Meta分析, 结果如表 4所示, cldns基因家族中至少有24个成员在鳃组织中表达, 共有6个cldns基因在不同的盐度实验组中呈现出显著差异表达: cldn8c、cldn10b、cldn10c、cldn10d、cldn27a和cldn30b。其中, cldn8c和cldn27a在淡水中的表达量显著高于等渗水、海水中的表达量; cldn10b和cldn30d的表达量关系为: 海水 > 等渗水 > 淡水; cldn10c、cldn10d与cldn10b在淡水中的表达量显著高于海水, 其在淡水和等渗水中也存在显著差异。研究结果表明: 这6个cldns基因在不同的盐度环境下差异表达, 可能参与花鲈鳃组织渗透调节, 具备离子屏障等功能。
表 4 花鲈鳃中cldns基因在不同盐度下的差异表达 Tab. 4 Differentially expression levels of cldn genes in spotted sea bass following experimentally challenged with different salinities
| 基因 | 盐度 | ||
| 淡水组/等渗组 | 海水组/等渗组 | 淡水组/海水组 | |
| cldn1a | 0.361 | –0.185 | 0.546 |
| cldn1b | 0.036 | –0.378 | 0.414 |
| cldn2 | — | — | — |
| cldn3a | — | — | — |
| cldn3b | — | — | — |
| cldn3c | — | — | — |
| cldn3d | — | — | — |
| cldn5a | 0.315 | –0.339 | 0.654 |
| cldn5b | 0.326 | –0.399 | 0.725 |
| cldn5c | — | — | — |
| cldn6 | — | — | — |
| cldn7a | — | — | — |
| cldn7b | 0.311 | 0.139 | 0.172 |
| cldn8b | –0.512 | 0.158 | –0.670 |
| cldn8c | 1.372* | 0.626 | 0.746 |
| cldn8d | 0.149 | 0.048 | 0.101 |
| cldn10a | — | — | — |
| cldn10b | 0.847 | –0.578 | 1.425* |
| cldn10c | 1.061* | –0.036 | 1.097* |
| cldn10d | 1.330* | 0.228 | 1.103* |
| cldn11a | 0.007 | –0.297 | 0.304 |
| cldn11b | — | — | — |
| cldn14 | — | — | — |
| cldn15a | — | — | — |
| cldn15b | — | — | — |
| cldn15c | — | — | — |
| cldn15d | — | — | — |
| cldn18a | — | — | — |
| cldn18b | — | — | — |
| cldn18c | — | — | — |
| cldn19 | –0.190 | –0.393 | 0.204 |
| cldn20a | — | — | — |
| cldn20b | — | — | — |
| cldn23a | 0.021 | 0.304 | –0.283 |
| cldn23b | — | — | — |
| cldn27a | 1.318* | 0.577 | 0.741 |
| cldn27b | –0.003 | –0.110 | 0.107 |
| cldn27c | — | — | — |
| cldn27d | — | — | — |
| cldn28a1 | — | — | — |
| cldn28a2 | 0.415 | –0.505 | 0.920 |
| cldn28b | — | — | — |
| cldn29a | — | — | — |
| cldn29b | — | — | — |
| cldn30a | 0.417 | –0.150 | 0.567 |
| cldn30b | 0.789 | –0.452 | 1.241* |
| cldn30c | 0.264 | –0.118 | 0.382 |
| cldn30d | –0.682 | –0.187 | –0.495 |
| cldn31a | 0.017 | –0.117 | 0.134 |
| cldn31b | — | — | — |
| cldn32a | 0.342 | 0.102 | 0.240 |
| cldn32b | — | — | — |
| cldn33a | — | — | — |
| cldn33b | 0.388 | –0.141 | 0.530 |
| cldn34 | — | — | — |
| 注: 数值代表log2(差异表达倍数); *: 显著差异表达基因 | |||
Cldns是细胞间紧密连接蛋白的重要功能和结构组件, 在调节细胞旁通路通透性方面起着至关重要的作用[8]。本研究在花鲈全基因组范围内共鉴定出55个cldns基因, 并对其进行了系统发育分析、基因拷贝数分析、染色体定位、进化分析以及鳃组织cldns在不同盐度环境下的表达特征分析。与多数硬骨鱼的研究相似[10, 13, 14, 25-27], 相较于高等脊椎动物, 本研究中cldns家族在花鲈中也出现显著扩增, 为理解硬骨鱼的基因进化和全基因组复制提供了一个理想模型。cldns在硬骨鱼中的注释较为复杂, 如在斑马鱼中, 与人类有直系同源关系的基因以数字后缀命名(cldn-1、cldn-5等), 而斑马鱼相比于高等脊椎动物所特有的基因则以字母后缀命名(cldn-d、cldn-e等)[25]。在红鳍东方鲀的相关研究中, 所有的cldns基因均以数字后缀命名[9]。Baltzegar等人在2013年对斑马鱼cldns基因的注释根据系统发育关系进行了修订[2]。本文通过与斑马鱼和红鳍东方鲀的同源关系对花鲈的cldns进行注释, 并通过系统发育关系进行验证。对于产生扩增且系统发育关系聚类不好的基因拷贝(如cldn1)通过共线性分析对基因的注释进行进一步验证。此外, 位于5号染色体上的cldn28a通过串联重复产生了一个旁系同源物, 二者所编码的蛋白及理化性质完全一致, 我们参考斑马鱼的注释原则, 在本文中将其注释为cldn28a1和cldn28a2。
在高等哺乳动物的基因组中, 共发现27种cldns[28], 而在硬骨鱼中, 已经有63个cldns在16种硬骨鱼中被发现。在本次研究中, 共获得55个花鲈的cldns。值得注意的是, 仅在硬骨鱼中发现了cldns直系同源基因的多拷贝现象, 表明硬骨鱼cldns基因相较于高等脊椎动物的显著扩增与硬骨鱼的全基因组复制(WGD)有密切的关系。据报道, 这次硬骨鱼特异的全基因组复制事件是导致硬骨鱼物种多样化的重要原因[29]。而全基因组复制事件后部分基因丢失而硬骨鱼的cldns基因数量却是高等脊椎动物的两倍还多, 这表明单是WGD不足以解释硬骨鱼中cldns基因的扩增, 例如本研究中5号和12号染色体上出现的多个cldns基因形成的基因簇解释了该现象。在基因复制事件后, 产生的新基因存在3种情况: 1) 丢失(例如成为假基因或沉默基因); 2) 关键通路的效能需增加一倍; 3) 有足够的环境选择压力来推动新功能的发展, 新基因保存下来并获得新的功能[30-31]。为此, 我们对花鲈的cldns基因进行了选择压力分析, 枝模型和位点模型的计算结果表明, cldns基因家族整体主要受负选择。枝位点模型的计算结果表明, 在不同的主要分枝上, cldns蛋白的某些氨基酸位点受正选择作用。所筛选到的正选择位点主要分布在cldns蛋白跨膜区域, 这些位点上的正选择压力可能是不同cldns基因的组织表达特异性和功能多样性的重要原因。
由于鳃组织与周围水环境直接接触, 因此其对维持硬骨鱼体内的稳态至关重要。几十年来, 人们普遍认为鳃上皮的不同的旁细胞特性对鳃组织的功能至关重要[12], 但是鳃组织紧密连接复合蛋白的分子生理学直到近几年才成为人们关注的焦点[1]。cldns基因在鳃组织中的重要性已经在多个硬骨鱼中进行探讨[10, 32], 并在多中硬骨鱼的鳃组织中找到至少44个cldns[1]。一些研究表明, 当青斑河豚和双斑鲀由海水转入淡水的低渗环境后, cldn3和cldn8亚型的mRNA表达量上调, 表明该cldns的功能可能是形成细胞间屏障以限制体内离子的流失[16, 33]。本研究中, 我们同样发现花鲈cldn8c在淡水中的表达量显著高于等渗水中, 且高于其在海水中的表达量; 此外, cldn30d在淡水中的表达量显著高于其在海水中的表达量, 且表达量在海水、等渗水和淡水中逐级上调, 表明cldn30d在低渗环境下同样起到细胞间“屏障”功能, Engelund等人对大西洋鲑cldn30的研究结果与上述结果一致, 其将大西洋鲑的cldn30转染至哺乳动物的肾脏细胞系后降低了上皮细胞的电导率和一价阳离子的细胞旁通路渗透性[34]。对斑马鱼和大西洋鲑的研究表明, 在高渗环境下, cldn10的mRNA水平上调, 作为离子细胞(MRCs)和附属细胞(AC)间的“泄漏孔洞”使体内多余的Na+排出体外[13-14, 25], 而在本研究中却相反, cldn10b、cldn10c和cldn10d在高渗环境中的表达较低, 在淡水中的表达显著高于海水中的表达, 且未在鳃组织中发现在高渗环境显著上调的cldns基因。推测由于各物种应对环境盐度变化的响应机制具有物种特异性, 以及实验处理的条件不同、实验用鱼的规格不同所导致。关于花鲈的cldns基因在应对环境盐度变化的具体功能, 还需进一步深入研究。
4 结论本研究在花鲈全基因组范围内共鉴定获得55个cldns基因, 通过系统发育和共线性分析确保了基因注释的准确性; 基因拷贝数和染色体定位分析证实硬骨鱼cldns基因家族扩增为全基因组复制和串联重复事件共同作用的结果; 选择压力分析表明花鲈cldns基因家族整体处于负选择, 但在蛋白的跨膜区域存在14个受环境正选择作用的氨基酸位点, 这些位点上的正选择压力可能是cldns基因多样性和功能分化的重要依据; 此外, 在不同的盐度环境下, 鳃组织中共有6个cldns基因呈现显著的差异表达, 表明它们在应对盐度环境变化时发挥潜在作用。
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