2022, Vol. 46
文章信息
- 杨兰珠, 李诗怡, 郑雯静, 李静, 包哲隈, 杨靖亚. 2022.
- YANG Lan-zhu, LI Shi-yi, ZHENG Wen-jing, LI Jing, BAO Zhe-wei, YANG Jing-ya. 2022.
- 副溶血性弧菌产耐热直接溶血毒素对黑色素瘤的抑制作用研究
- Study on the inhibitory effect of thermostable direct hemolytic toxin from Vibrio parahaemolyticus on melanoma
- 海洋科学, 46(8): 121-129
- Marina Sciences, 46(8): 121-129.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20220328006
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文章历史
- 收稿日期：2022-03-28
- 修回日期：2022-06-14
黑色素瘤是一种侵袭性生长的恶性肿瘤, 包括播散性黑色素瘤、结节状黑色素瘤、肢端黑色素瘤、黏膜黑色素瘤、眼部黑色素瘤等9种亚型, 与黑素细胞系的侵袭性生长和早期扩散有关[1-2]。流行病学调查结果显示, 世界各地的黑色素瘤发病率和死亡率差异很大, 这主要与种族遗传表型的差异以及阳光照射的差异有关[3]。临床上黑色素瘤的典型疗法是手术切除, 但对于转移性黑色素瘤患者, 单独的手术治疗不会完全治愈, 还需进一步结合药物治疗。氮烯唑胺(dacarbazine, DTIC), 又称达卡巴嗪, 是治疗转移性黑色素瘤的一线药物, 但它仍存在许多弊端, 如临床效率低、患者生存期无明显延长、大多数患者出现严重不良反应[4-5]。因此, 寻找新型、高效的药物对治疗黑色素瘤有重要的临床意义。
细菌毒素是新型抗肿瘤药物开发的重要研究热点[6], BRIGOTTI等[7]发现由致病大肠杆菌产生的Stx1毒素与表达神经酰胺三己糖苷的肿瘤细胞的细胞膜结合后, 增强了环磷酰胺对淋巴瘤细胞的细胞毒作用。KREITMAN等[8]构建了一种含有抗CD22抗体Fv段与截短的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素的融合毒素, 并进行了I期临床实验, 结果显示3个周期的治疗对白血病效果显著。耐热直接溶血毒素(Thermostabile direct hemolysin, TDH)是由革兰氏阴性菌副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)分泌的一种破坏细胞膜的海洋细菌毒素, 被认为是通过海鲜传播引起急性肠胃炎的主要病原体之一[9]。通常情况下该毒素蛋白具有由两个相同亚基组成的二聚体结构, 其分子量为42 kDa[10]。研究报道TDH可显著降低小鼠肿瘤模型的肿瘤体积[11], 抑制结直肠癌细胞系的增殖[12]。因此, 它对治疗肿瘤开辟了新的可能性。本研究主要通过皮下注射B16细胞构建小鼠(Mus musculus)黑色素瘤模型, 通过瘤周给药的方式观察TDH对小鼠黑色素瘤生长的影响。此外, 本文还通过体外细胞实验研究了TDH对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响, 并探讨其抗肿瘤活性的机理。以期为海洋生物毒素的抗肿瘤药物的开发提供理论依据, 同时为治疗黑色素瘤提供新思路。
1 材料 1.1 耐热直接溶血毒素TDH实验中使用的TDH毒素蛋白由本实验室分离纯化自致病性副溶血弧菌ATCC33846, 制备过程参照马燕等[10]的方法。
1.2 细胞小鼠黑色素瘤细胞系B16、人肝癌细胞(SMMC- 7721)来自中国科学院细胞库, 人正常结肠上皮细胞(NCM460)和人正常肝细胞(LO2)由华东理工大学刘建文教授惠赠。
1.3 小鼠从北京斯贝福生物技术有限公司购买30只7周龄的雄性C57BL/6小鼠(质量20 g±2 g), 饲养于上海海洋大学实验动物中心, 在室温条件下昼夜循环自由进食饮水。实验前适应性喂养1周。
1.4 试剂Annexin V凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位JC-1试剂盒(BD pharmingen公司), Caspase-8活性试剂盒、Caspase-3荧光检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司), 喜树碱(上海四环生物技术有限公司), 氮烯唑胺(美国APExBIO公司), BSA牛血清蛋白(上海正极生物有限公司), DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清、小牛血清(上海普飞生物有限公司), 瑞氏-姬姆萨染色液、快速吉姆萨染液(生物工程股份有限公司), MTT、胰酶、PBS、生理盐水(上海碧云天生物技术有限公司), 甲醇(国药集团化学试剂公司), 二甲基亚砜(北京索莱宝科技有限公司)等。
1.5 仪器CO2细胞培养箱、酶标仪(美国Thermo公司), 冷冻离心机(德国Sigma公司), 倒置显微镜(Olympus公司), 流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)等。
2 方法 2.1 细胞培养B16细胞和SMMC-7721细胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中孵育, NCM460细胞和LO2细胞在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。所有细胞置于37℃、含有5%CO2的二氧化碳细胞培养箱中孵育。
2.2 细胞毒性实验将对数生长期的细胞以5×103个/孔的密度接种于无菌的96孔细胞培养板, 培养液体积为100 μL/孔, 每组设5个复孔, 于37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育24 h。待细胞贴壁后, 加入不同质量浓度的TDH(0、15、30、60、120、240 μg/mL)孵育24 h, 然后向每孔中加入10 μL MTT(质量浓度为5 mg/mL)继续孵育4 h。随后弃去上清液并用PBS洗涤细胞, 每孔加100 μL二甲基亚砜, 置摇床上振荡10 min, 使沉淀充分溶解。用酶标仪在波长为570 nm处测定各孔吸光度, 采用改良寇氏法计算出每株细胞的半数抑制浓度IC50。
改良寇氏法: Log IC50=Xm–I×(P–(3–Pm–Pn)/4)
式中, Xm为Log最大药物剂量, I为Log(最大药物剂量/相邻剂量), P为阳性反应率之和, Pm为最大阳性反应率, Pn为最小阳性反应率
2.3 克隆形成试验收集对数生长期的B16细胞, 吹打成均匀的细胞悬液并进行计数, 将细胞密度调整为1×105个/mL。取一块无菌的24孔细胞培养板, 每孔加入1 mL上述细胞悬液, 培养过夜。第二天, 弃去培养液, 加入含不同质量浓度TDH(0、2.5、5、10 μg/mL)的新鲜培养液, 孵育24 h后, 弃去培养液, PBS洗涤1次, 用胰蛋白酶消化并收集细胞, 显微镜下计数, 将细胞密度调整为500个/mL。取6 cm细胞培养皿, 每皿加2 mL细胞密度为500个/mL的细胞悬液, 每个浓度梯度3个重复。小心将培养皿转移至CO2细胞培养箱, 在37℃、5%CO2恒定的环境中继续培养3周。
从细胞培养箱中取出6 cm细胞培养皿, PBS小心清洗细胞2次, 尽可能除去残留的培养基和细胞碎片。每个培养皿中加2 mL甲醇溶液处理15 min, 固定细胞, 弃去固定液, 加入2 mL快速吉姆萨染液, 室温下作用20 min, 倒去染色液, 采用浸洗的方式吸取剩余的染色液, 将细胞培养皿倒置在铺有吸水纸的超净工作台内自然晾干后。光学显微镜下, 每个细胞培养皿取5个随机视野拍照并统计大于8个细胞的克隆数, 最后计算细胞克隆形成率(细胞克隆形成率=平均每皿细胞克隆数/每皿中加入的细胞数× 100%)。
2.4 体内实验将B16细胞(100 μL/只, 5×105个细胞/100 μL)接种到8周龄雄性C57BL/6小鼠的左后肢皮下, 7 d后当可触及的肿瘤形成后(50 mm3), 将小鼠随机分为5组, 每组6只。瘤周给药的方式给予不同剂量的TDH(2、4、6 mg/(kg/d))、PBS(阴性对照)、氮烯唑胺(10 mg/(kg/d), 阳性对照), 连续7 d给药, 每日1次。同时每2 d用游标卡尺测量肿瘤垂直侧的最大直径(a)和长度(b), 肿瘤体积按照(a×b2/2) cm3计算。实验结束时, 从尾部取20 μL血液置于干净的载玻片上, 再取一张干净光滑的载玻片, 以30°~ 45°的角度平滑地推开血液。干燥后, 用瑞氏-姬姆萨染色液染色。红细胞个数用ImageJ软件进行计数, 以各个视野中平均数量进行统计学分析, 白细胞计数(×109/L)=高倍镜视野中白细胞平均个数×2× 109/L[13]。
最后采用颈椎脱臼的方式处死所有小鼠, 取出肾脏、大脑、心脏、肝、脾脏和肺。所有器官用生理盐水洗涤, 然后称质量, 并计算脏器系数, 脏器系数=脏器质量/小鼠体质量×100%。
2.5 细胞凋亡实验取对数生长期的B16细胞, 以2×105个/孔接种于无菌的6孔细胞培养板中, 37 ℃过夜培养。加入终质量浓度分别为5、10、20 μg/mL TDH的培养基, 阴性对照组加入等体积的PBS, 处理24 h后用胰酶(不含EDTA)消化并收集细胞。收集的细胞样品用预冷的PBS溶液洗涤2遍, 加入凋亡试剂盒中提供的1× Binding Buffer, 将B16细胞浓度调整为1×106个/mL。取出其中100 μL细胞液(1×105个)至新的EP管中, 分别加入凋亡试剂盒中提供的5 μL Annexin V-FITC以及5 μL碘化丙啶试剂, 小心混匀, 室温下避光孵育20 min。每个样品中再分别加入400 μL 1×Binding Buffer溶液, 用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。细胞总凋亡率(%)=第二象限细胞凋亡率(晚期凋亡)+第四象限细胞凋亡率(早期凋亡)[14]。
2.6 细胞内Caspase-3和Caspase-8的活性分析B16细胞在含5%胎牛血清的RPMI1640培养基中用20 μg/mL TDH处理。在第0、3、6、9、12、15、18和24 h时分别按照Caspase-8活性试剂盒和Caspase-3荧光检测试剂盒的要求处理B16细胞, 用酶标仪检测波长在405 nm处的吸光度以评价Caspase-8的活性, 另外Caspase-3活性检测的激发波长为485 nm, 发射波长为535 nm。
2.7 线粒体膜电位B16细胞在6孔细胞板中培养, 在培养基中加入不同质量浓度的TDH(0、5、10、20 μg/mL)、PBS(阴性对照)或0.25 μg/mL喜树碱(阳性对照), 37℃下孵育24 h。然后收集细胞, 按照JC-1试剂盒的说明, 用亲脂性物质JC-1进行染色, 染色结束后用流式细胞仪分析B16细胞膜电位的变化趋势。
2.8 统计学分析用SPSS 22.0软件对数据进行分析, 数据以平均值±标准差(
所有细胞系经不同浓度的TDH处理后培养24 h, 使用MTT法测定细胞活力。从表 1可以看出, 不同细胞系的IC50值有所不同。B16细胞对TDH最为敏感, IC50值为48 μg/mL。其次是人肝癌细胞(SMMC- 7721), 而正常细胞(NCM460和LO2)对TDH不敏感。以上结果说明TDH对肿瘤细胞具有良好的选择性杀伤效应, 这对TDH用于肿瘤的治疗具有积极的意义。
| 细胞系 | B16 | SMMC-7721 | NCM460 | LO2 |
| IC50(μg/mL) | 48±1.5 | 54±6.1 | 151±9.2 | 118±7.3 |
暴露于TDH后, 观察B16细胞集落形成的情况。如图 1所示, 与对照组TDH质量浓度为0 µg/mL相比较, TDH处理可显著抑制B16细胞的集落形成能力, 且呈浓度依赖性(P < 0.001), 当TDH质量浓度为10 μg/mL, B16细胞克隆形成率降低至45.07%。并且对照组的单个细胞克隆中的B16细胞数量多于实验组。由此可见, TDH可在体外显著抑制B16细胞系的克隆形成。
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| 图 1 TDH对B16细胞克隆形成的影响 Fig. 1 Effect of thermostable direct hemolysin on clone formation of B16 cells 与对照组比较, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 Compared with control group, **. P < 0.01, ***. P < 0.001 |
TDH对通过移植B16细胞引起小鼠体内黑色素瘤生长的影响如图 2所示, 6 mg/kg TDH实验组和阳性对照组(dacarbazine, 氮烯唑胺)小鼠的肿瘤体积均显著低于阴性对照组(PBS处理)小鼠的肿瘤体积(P < 0.001), 且6 mg/kg TDH实验组小鼠的肿瘤体积要小于阳性对照组。而2 mg/kg TDH实验组和4 mg/kg TDH实验组的小鼠肿瘤体积与阴性对照组均无显著差异。此外, TDH和氮烯唑胺处理对荷瘤小鼠血细胞数量的影响如表 2所示, 与阴性对照组相比, TDH处理不影响白细胞和红细胞的数量, 而阳性对照氮烯唑胺可显著减少小鼠红细胞数量(P < 0.001)。从表 3可以看出, TDH和氮烯唑胺对荷瘤小鼠的各个脏器系数均无影响。这些结果表明, TDH在抑制黑色素瘤发展的有效剂量范围内对心、肝、脾、肺、肾、脑等器官和血液没有表现出明显的毒性, 提示TDH是阻止黑色素瘤发展的潜在抑制剂。
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| 图 2 TDH对小鼠体内黑色素瘤的影响 Fig. 2 Effect of thermostable direct hemolysin on melanoma in mice 与阴性对照组(PBS)比较, ***. P < 0.001 Compared with negative control group(PBS), ***. P < 0.001 |
| 组别 | RBC/(×107/L) | WBC/(1011/L) |
| A(PBS) | 842.12±102.62 | 69.33±57.71 |
| B(2 mg/kg) | 882.52±108.95 | 48.00±28.57 |
| C(4 mg/kg) | 801.64±95.20 | 56.00±35.38 |
| D(6 mg/kg) | 910.88±138.75 | 92.00±41.22 |
| E(Dacarbazine) | 706.80±74.88*** | 73.33±42.45 |
| 组别 | 脏器系数/% | |||||
| 心脏 | 肝脏 | 脾脏 | 肺 | 肾脏 | 大脑 | |
| A(PBS) | 0.45±0.06 | 5.06±0.28 | 0.86±0.26 | 0.62±0.04 | 1.10±0.16 | 1.63±0.21 |
| B(2 mg/kg) | 0.42±0.10 | 5.48±0.70 | 1.05±0.67 | 0.60±0.11 | 1.16±0.23 | 1.84±0.32 |
| C(4 mg/kg) | 0.40±0.07 | 5.33±1.07 | 0.71±0.32 | 0.63±0.12 | 1.02±0.33 | 1.61±0.30 |
| D(6 mg/kg) | 0.46±0.06 | 5.40±0.20 | 1.33±0.06 | 0.73±0.02 | 1.25±0.11 | 1.86±0.08 |
| E(Dacarbazine) | 0.39±0.09 | 5.00±1.00 | 0.58±0.29 | 0.57±0.16 | 1.12±0.27 | 1.47±0.41 |
用0、5、10、20 µg/mL TDH处理B16细胞24 h后, FITC/PI双染流式细胞术结果表明(图 3), TDH浓度为0 µg/mL时B16细胞凋亡率为3.2%, 而TDH浓度为20 µg/mL时细胞凋亡率增加到19.4%(P < 0.001)。这表明诱导细胞凋亡可能是TDH抑制黑色素瘤的重要机制之一。
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| 图 3 TDH诱导B16细胞凋亡的作用 Fig. 3 Effect of thermostable direct hemolysin (TDH) on B16 cell apoptosis 与对照组比较, ***P < 0.001 compared with control group, ***P < 0.001 |
半胱氨酸蛋白酶(Caspases)是一种蛋白水解酶, 在控制细胞死亡中起着重要作用。在TDH处理后, Caspase-8和Caspase-3分别在6和8 h被激活(图 4a和4b), 说明TDH激活Caspase-8之后, 引起了下游信号分子Caspase-3的活化, 提示TDH可诱导Caspase级联反应, 导致细胞凋亡。
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| 图 4 TDH对B16细胞中Caspase-3(a)和Caspase-8(b)激活的影响 Fig. 4 Effect of thermostable direct hemolysin on the activation of Caspase-3 (a) and Caspase-8 (b) in B16 cells |
在哺乳动物细胞中, Caspase-3依赖的凋亡由两条途径启动: 细胞表面死亡受体的外源性途径或线粒体起始的内源性途径[10, 15]。用0、5、10、20 μg/mL TDH刺激B16细胞24 h后, 检测到线粒体膜电位的变化趋势。图 5结果显示, 不同浓度TDH刺激的B16细胞与阴性对照组细胞的线粒体膜电位无明显差异, 提示TDH诱导的B16细胞凋亡与线粒体膜电位无关。结合图 4, 说明TDH是通过细胞表面的死亡受体介导的外源性途径从而诱发Caspase-3级联反应最终导致细胞凋亡。
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| 图 5 TDH对B16细胞线粒体膜电位的影响 Fig. 5 Effect of thermostable direct hemolysin on the mitochondrial membrane potential of B16 cells |
黑色素瘤是一种由黑素细胞引起的恶性皮肤癌。由于黑素细胞分布相对广泛, 如皮肤、葡萄膜、黏膜、直肠等, 所以黑色素瘤可能无处不在[16-19]。对于早期患者, 黑色素瘤通过手术切除即可, 并且存活率很高, 但转移后存活率显著下降。对于转移性黑色素瘤的治疗而言, 过去10年开发的几种新药极大地改善了转移性黑色素瘤患者的预后[20]。然而, 大多数患者对这些药物治疗没有表现出持久的反应。因此, 亟待开发更有效的黑色素瘤治疗药物。
近年来, 研究发现细菌和细菌毒素具有潜在的抗癌活性。链球菌(Streptococcus)和梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)是最早被用作抗癌剂的细菌[21]。目前新式梭状芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes) OK-432等是常见的细菌抗癌剂, 主要用于子宫肌瘤、淋巴瘤等实体瘤的治疗[22-24]。细菌毒素是一种有价值的癌细胞生长抑制因子, 具有抗肿瘤活性的细菌毒素分为两类: 与肿瘤表面抗原结合的毒素和与配体结合的毒素[25]。如产气荚膜弧菌(Clostridium perfringens)产生的肠毒素与结直肠癌细胞表面大量存在的claudin-3和claudin-4结合在一起, 使细胞失去渗透平衡而导致癌细胞的溶解[26]。近年来的研究表明, 副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素(TDH) 在直接杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的过程中发挥重要作用, 最终导致实体瘤的抑制或消退[10-12]。
本研究采用MTT法检测发现, 不同细胞系经TDH处理后, 两株人的正常细胞的IC50比B16细胞高出2~3倍。由此可知, TDH对肿瘤细胞的毒性远大于正常细胞, 对肿瘤细胞具有一定的选择性。随后研究TDH对B16细胞克隆形成的影响, 结果表明TDH能显著抑制癌细胞的克隆形成。进一步的移植瘤模型体内实验结果说明: 6 mg/kg TDH处理小鼠的肿瘤体积小于PBS和氮烯唑胺对照组; 同时与对照组相比, TDH处理不影响白细胞和红细胞的数量, 对荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等器官的脏器系数没有显著影响, 表明TDH在抑制黑色素瘤发展的有效剂量范围内对小鼠的各种器官和血液没有表现出明显毒性。体外和体内实验结果提示TDH可能是治疗黑色素瘤的潜在抑制剂。
进一步的凋亡实验、Caspase-8和Caspase-3的活性分析以及线粒体膜电位检测发现, TDH能有效诱导B16细胞凋亡, 并依次激活Caspase-8和Caspase-3, 但不影响B16细胞的线粒体膜电位。由图 4、图 5结果分析可知, TDH诱导的凋亡可能属于细胞表面死亡受体起始的外源性途径。目前, 已知的死亡受体有8种: TNFR-1(又称CD120a或p55)、FAS(CD95或Apo-1)、死亡受体3(DR3)、死亡受体4(DR4, TRAIL-R1)和死亡受体5(DR5, TRAIL-R2)、死亡受体6(DR6)、EDA-R(ectodermal dysplasia receptor)和NGF-R[27-28]。研究报道: DR3主要分布于淋巴组织, 如脾脏、胸腺以及外周血淋巴细胞, 包括淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞等[29]; FAS和NGF-R在正常组织细胞中高表达, 在癌细胞中低表达[30-31]; DR6在正常组织细胞和癌细胞中均高表达[32-33]。本研究发现TDH对正常细胞和小鼠黑色素瘤B16细胞的毒性相差约2~3倍, 这一现象说明与正常组织比较, TDH结合的受体在B16细胞膜表面是高表达的, 可能是TNFR-1、EDA-R、DR4和DR5中的某一个或者一个目前尚未报道的新的受体。由此可推测TDH可能通过与肿瘤细胞膜表面高表达的死亡受体相互作用, 诱发了死亡受体起始的外源性途径, 进而激活了Caspase-8, 并顺次激活Caspase-3, 最终导致肿瘤细胞的凋亡(图 6)。
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| 图 6 TDH诱导肿瘤细胞凋亡的可能信号通路 Fig. 6 Signal pathway of TDH induced tumor cell apoptosis |
综上所述, 本实验研究了TDH对黑色素瘤的抗肿瘤作用, 发现TDH显著抑制了小鼠体内肿瘤的生长和体外B16细胞的增殖, 并促进B16细胞的凋亡。其作用机制可能是通过与肿瘤细胞膜表面高表达的死亡受体相互作用, 诱导细胞发生凋亡, 从而达到治疗黑色素瘤的目的, 但其具体的作用机制还有待进一步研究。
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