2022, Vol. 46
文章信息
- 肖懿哲, 陈小灵, 孙玉龙, 张子平, 王艺磊, 朱友芳. 2022.
- XIAO Yi-zhe, CHEN Xiao-ling, SUN Yu-long, ZHANG Zi-ping, WANG Yi-lei, ZHU You-fang. 2022.
- 中华蛸章鱼胺受体OARβ2R基因克隆及表达分析
- Cloning and expression analysis of OARβ2R gene from Octopus sinensis
- 海洋科学, 46(9): 109-116
- Marina Sciences, 46(9): 109-116.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20211227003
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文章历史
- 收稿日期：2021-12-27
- 修回日期：2022-05-08
2. 集美大学 水产学院, 福建 厦门 361021;
3. 福建农林大学 动物科学学院, 福建 福州 350002
2. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China;
3. College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
中华蛸(Octopus sinensis), 原名真蛸(O.vulgaris), 近年来根据形态学和分子生物学的差异将中华蛸和真蛸分开[1-2], 主要分布在北太平洋西部的浅温带水域, 特别是在中国、韩国和日本沿海, 具有生命周期短、产卵量大、食物转化率高等优点, 被认为具人工养殖潜力的优良海水种类[3-6]。但在人工养殖条件下, 存在着幼体生长缓慢, 死亡率高等问题, 限制了养殖业的进一步发展[7-9]。章鱼胺受体(octopamine receptor, OAR)是典型的G蛋白偶联受体, 参与生物体包括生长、代谢、发育、免疫等多种至关重要的生理学过程[10]。现已证明章鱼胺不仅在昆虫的生理活动中扮演重要角色[11], 在海洋无脊椎动物中也发挥很大的作用, COON等[12, 13]发现章鱼胺能够诱导太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的附着变态; OARs已经从软体动物腹足类的椎实螺属和海兔螺属中被鉴定出来, 且发现其在生命活动中能够行使控制行为发生、参与新陈代谢以及信号转导等多种生理功能[14]; PRYCE等[15]在美洲牡蛎(C.virginica)的鳃、外套膜、心脏、血淋巴以及神经系统中检测到了章鱼胺和OARs的存在, 并证实了其在美洲牡蛎的心脏活动中行使重要功能。这些研究结果表明OAR在海洋无脊椎动物中发挥的作用与昆虫有许多类似性, 但尚未看到中华蛸OAR基因(OsOARβ2R)的研究报道。本研究克隆了OsOARβ2R, 并进行了生物信息学分析, 研究了OsOARβ2R在不同组织中的表达、刚孵岀的幼体在不同的饥饿时间及不同的胚胎发育时期表达水平的变化。这些结果可为研究中华蛸受精卵的孵化及幼体发育机制、提高人工育苗生产效率提供一些基础资料。
1 材料与方法 1.1 样品采集实验用的中华蛸组织样品2021年7月采自福建省莆田市南日海区。采集肌肉、脑、鳃、鳃心、消化腺、小肠、唾液腺、肾脏、眼、心脏等10个组织/器官, 用于OsOARβ2R在各组织中的分布研究。
饥饿时间对OsOARβ2R表达水平的影响采样时间为2019年5月, 试验水温为22.5±0.5℃, 试验水体100 L, 设置3个平行组, 每组放养刚孵出的中华蛸幼体1 000只。幼体孵出时为0 h, 不投喂饵料, 饥饿天数分别为0、1、2、3、4和5 d, 每个时相取6份样品储存于液氮中。
不同的胚胎发育时期的样品2021年3~4月采自在莆田南日海区的网箱, 母蛸在产卵巢中产卵并护卵, 自然水温孵化, 孵化水温14.7~20.8℃, 采集多细胞期(multi-cell stage)、红珠期(red-bead stage)、黑珠期(black-bead stage)和初孵幼体(newly-hatched larvae)共4个时期的胚胎, 每个时相取6份样品储存于液氮中。
1.2 中华蛸OsOARβ2R基因克隆利用课题组中华蛸转录组数据库筛选获得的OsOARβ2R cDNA序列, 采用从头到趾引物(表 1)扩增、测序验证开放阅读框(ORF)序列的准确性。本研究中所用引物均由捷瑞(上海)生物工程有限公司合成。
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 用途 |
| OARβ2R-F | TTTTGTTGGCTCCGATAGATA | ORF验证 |
| OARβ2R-R | TGTTAGCACGCATTTTACCTC | |
| qOARβ2R-F | TCGCAGACAAGAGCACGCTATTC | 定量PCR |
| qOARβ2R-R | CGTATCCGTATATCGACTTCCGTTGG | |
| qPCR-β-actin-F | TGATGGCCAAGTTATCACCA | 内参基因 |
| qPCR-β-actin-R | TGGTCTCATGGATACCAGCA |
ORF区扩增的模板为脑cDNA, 反应体系为: 2 μL的2.5 mmol/LdNTP Mix, 2.5 μL的10×EX Taq buffer, 0.1 μL的5 U/μLEX Taq DNA聚合酶, 1 μL的cDNA模板, 1 μL的10 μmol/LOsOARβ2R-F, 1 μL的10 μmol/LOsOARβ2R-R引物, 反应总体积为25 μL, 扩增产物纯化后PCR产物由捷瑞(上海)生物工程有限公司测序。
1.3 OsOARβ2R基因及其氨基酸序列分析根据测序结果分析获得OsOARβ2R的ORF, OsOARβ2R分析采用NCBI的BLAST软件, OsOARβ2R翻译采用EXPASY网站的Translate软件。蛋白质结构域分析采用NCBI的CDD软件, 通过SWISS-MODEL网站进行三维模型构建。OAR序列多重比对采用DNAman软件, 系统进化树采用MEGA-X软件的邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建。
1.4 OsOARβ2R基因的定量以β-actin作为内参基因, 引物序列见表 1。qRT-PCR采用biosharp® SYBR Green Master Mix试剂盒(兰杰柯科技, 广州), 反应体系: 模板4.5 μL, 引物(qOARβ2R-F、qOARβ2R-R, 10 μmol/L)各0.25 μL, SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL。反应过程: 95℃变性1 min, 40个循环; 95℃变性5 s; 60℃退火10 s; 72℃延伸15 s; 结束后根据熔解曲线, 分析产物的特异性。以2–ΔΔCt方法计算中华蛸不同组织、幼体不同饥饿时间和不同发育阶段OsOARβ2R基因相对表达水平, 使用SPSS 23软件进行显著性差异分析。P＜0.05表示差异显著。数据以平均值±标准误差(mean ± SE, n=6)表示。
2 结果 2.1 OsOARβ2R序列分析OsOARβ2R的ORF长度1 158 bp, 编码385个氨基酸, 预测的蛋白质的相对分子量为44.536 kDa, 等电点为8.58。利用NCBI的CDD软件预测OsOARβ2R的蛋白质(OsOARβ2R)具有7个跨膜结构域(TM1-7) (图 1)。预测的OsOARβ2R蛋白质三级结构显示, 其含有9个α-螺旋, 2个β-折叠(图 2)。
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| 图 1 OsOARβ2R的序列及推导的氨基酸序列 Fig. 1 ORF and amino acid sequences of OsOARβ2R 小写字母为核苷酸序列, 大写字母为对应编码的氨基酸序列; 起始密码子atg和终止密码taa用加粗表示; 下划线部分表示7个跨膜结构域 Lowercase letters represent the nucleotide sequence, and capital letters below the nucleotide sequence are the corresponding encoded amino acid sequence; The initiation codon (atg) and the stop codon (taa) are shown in bold; The underlined parts represent the seven transmembrane domains (TMs) |
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| 图 2 OsOARβ2R蛋白质三级结构 Fig. 2 Tertiary structure of the OsOARβ2R protein |
选取加州双斑蛸(O. bimaculoides, 登录号: XP_014771877.1)、欧洲大扇贝(Pecten maximus, 登录号: XP_033757386.1)、福寿螺(Pomacea canaliculate, 登录号: XP_025094782.1)、加州海兔(Aplysia californica, 登录号: NP_001191606.1)、海天牛(Plakobranchus ocellatus, 登录号: GFN90552.1)、美洲牡蛎(登录号: XP_022286284.1)等12种无脊椎动物OAR与OsOARβ2R进行氨基酸序列一致性的比较(图 3), 结果显示, OsOARβ2R与加州双斑蛸OAR的一致性最高, 达81.50%, 与福寿螺、海天牛、加州海兔的OAR分别达到48.24%、47.36%和46.48%, 其中, TM3最保守。系统进化树结果显示(图 4), OsOARβ2R与软体动物门的加州双斑蛸聚为一支, 再与软体动物门的其他物种聚为一大支, 另一大支为节肢动物门(表 2)。
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| 图 3 OsOARβ2R与其他动物OAR氨基酸序列的比对 Fig. 3 Alignment of the amino acid sequence of OsOARβ2R and other invertebrate OAR |
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| 图 4 不同物种OAR系统进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of OAR from different species |
| 物种名称 | 基因登录号 |
| 加州海兔(Aplysia californica) | NP_001191606.1 |
| 黑斑海兔(Aplysia kurodai) | AAF28802.1 |
| 海天牛(Plakobranchus ocellatus) | GFN90552.1 |
| 光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata) | XP_013096128.1 |
| 福寿螺(Pomacea canaliculate) | XP_025094782.1 |
| 美洲牡蛎(Crassostrea virginica) | XP_022286284.1 |
| 欧洲大扇贝(Pecten maximus) | XP_033757386.1 |
| 虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis) | XP_021378407.1 |
| 中华蛸(Octopus sinensis) | XP_029646079.2 |
| 加州双斑蛸(Octopus bimaculoides) | XP_014771877.1 |
| 金凤蝶(Papilio machaon) | KPJ13529.1 |
| 棉铃虫(Helicoverpa armigera) | XP_021187626.1 |
| 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni) | XP_026729368.1 |
QRT-PCR结果显示: 在成体10个组织/器官中, OsOARβ2R均有表达, 在后唾液腺中的表达水平最高, 其次是脑和小肠(图 5)。饥饿对中华蛸幼体的存活、体态和游动行为有显著的影响。随着饥饿时间的增加, 饥饿第3天时, 中华蛸体色变浅, 趋光性变弱, 部分沉入桶底。至饥饿第5天, 出现体色发白, 绝大多数死亡的现象; 在幼体饥饿实验中, 随着饥饿时间的推移, OsOARβ2R的表达水平在饥饿2 d后显著降低, 紧接着在饥饿3 d时表达水平显著升高, 且表达水平达到最高, 之后表达水平开始回落(图 6)。OsOARβ2R在中华蛸整个胚胎发育周期中均可检测到, 且在多细胞期表达水平最高, 后显著下降, 黑珠期显著高于红珠期及初孵幼体(图 7)。
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| 图 5 OsOARβ2R在不同组织/器官的表达情况 Fig. 5 Expression of OsOARβ2R in different tissues/organs 不同的字母表示差异显著, 下同 Different letters indicate a significant difference at P < 0.05, the same below |
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| 图 6 OsOARβ2R在幼体饥饿过程中的表达情况 Fig. 6 Expression of OsOARβ2R during larval starvation |
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| 图 7 OsOARβ2R在不同发育时期的表达情况 Fig. 7 Expression of OsOARβ2R at different stages of development |
本研究克隆了OsOARβ2R, 该序列编码385个氨基酸, 包含7个跨膜结构域。已知G蛋白偶联受体7个跨膜结构分别扮演不同的功能, TM1参与受体的构象活化过程及与配基的结合; TM2影响G蛋白的偶联和信号的产生; TM3在受体的活化、磷酸化、结构的完整性、表达等方面发挥重要的作用; TM4参与配基结合和信号传递; TM5对受体组装、表达和信号产生有一定影响; TM6参与受体的表达及其与配基的结合; TM7对配基的传递和信号传导产生一定的影响[10]。中华蛸OsOARβ2R跨膜结构TM3、TM5、TM6、TM7相对保守, 推测具有识别配体, 激活G蛋白的功能。跨膜结构域TM4最不保守, 其可能与识别不同的G蛋白如Gi与Gq蛋白有关。多重序列比对结果显示, OsOARβ2R与加州双斑蛸的OAR的一致性达81.50%; 系统进化树结果显示, OsOARβ2R与软体动物门的加州双斑蛸聚为一支, 再与软体动物门的其他物种聚为一大支, 系统进化关系与传统进化关系一致, 这些结果充分表明本研究所得到的基因序列为OsOARβ2R。
蔡英亚等[16]认为八腕目的唾液腺有分泌蛋白酶和淀粉酶等各种消化酶及蛋白毒素的功能; 长蛸(O. variabilis)的唾液腺能够分泌具有黏合食物、润滑消化道的黏多糖, 同时能够分泌消化酶及毒素[17]。中华蛸雌蛸的护卵行为是卵孵化率较高的前提保证, 其护卵行为使受精卵免受病、敌害的侵害, 在无雌蛸的看护下, 密集的卵群易遭受病、敌害如水霉菌、原生动物和桡足类等的侵袭[18]。章鱼胺与OAR控制着昆虫的许多生理行为, 过高的章鱼胺浓度影响着昆虫的正常生理行为, 达到驱杀的目的[11]; 章鱼胺与OAR也参与厚壳贻贝(Mytilus coruscus)的免疫反应[14]。荧光定量PCR结果显示, OsOARβ2R在10个组织/器官中均有表达, 在后唾液腺中的表达水平显著高于其他组织, 据此推测中华蛸唾液蛋白毒素中章鱼胺含量较高, 护卵雌蛸分泌唾液保护受精卵免遭病、敌害的侵袭。
本实验中, 饥饿对中华蛸幼体的存活有显著的影响。饥饿第3天, 中华蛸体色变浅, 趋光性变弱, 部分沉入桶底, 至饥饿第5天, 出现体色发白, 绝大多数死亡的现象, 因此, 幼体不可逆点为饥饿后第3天, OsOARβ2R的表达水平可作为幼体代谢是否正常的一个指标。
在中华蛸幼体饥饿实验中, 随着饥饿时间的推移, OsOARβ2R的表达水平在饥饿2 d后显著降低, 紧接着在饥饿3 d时表达水平显著升高, 且表达水平达到最高, 之后表达水平开始回落。这一趋势与课题组先前关于饥饿后中华蛸幼体中的糖酵解基因PK、GPI和脂肪代谢基因GOT2、MTTP、PLPP1[19]及FAXDC2[20]的相关表达结果一致。OAR作为典型的G蛋白偶联受体, 参与机体的众多生命代谢活动, 推测OAR参与了饥饿条件下幼体的糖酵解及脂质代谢过程, 在维持机体生命活动的过程中起重要作用。
本次试验是在有母蛸护卵的情况下进行的。不同的胚胎发育时期OsOARβ2R表达水平测定结果表明: OsOARβ2R在中华蛸整个发育周期均可检测到, 且在多细胞期表达水平最高, 后显著下降, 黑珠期显著高于红珠期及初孵幼体。詹萍萍等[21]研究长蛸胚胎发育可溶性蛋白中发现, 可溶性蛋白含量随着长蛸胚胎的发育逐渐减少。在多细胞期时, 需要大量的活性蛋白以满足机体细胞分裂与分化, OsOARβ2R在加工与修饰蛋白维持机体发挥很大的作用, 因此, 表达水平最高; 伴随机体发育, 从红珠期开始, 胚胎已发育出的各种组织与器官[22-24], 能满足基本的物质循环与能量流动, 表达水平显著下降。在黑珠期胚胎发生一次反转[22], 需要消耗较多的能量, 黑珠期OsOARβ2R表达水平显著高于红珠期及初孵幼体。
生产中作者发现, 在中华蛸受精卵孵化过程中, 在红珠期前, 没有雌蛸护卵的受精卵会腐烂死亡, 有护卵的则能正常发育, 而从红珠期后母蛸有没有护卵, 受精卵均能正常孵出。推测在红珠期前, 需由母蛸唾液中的章鱼胺来维持幼体OsOARβ2R表达在正常的水平范围内, 母蛸唾液中的章鱼胺使受精卵不但可以抵御病原生物的侵袭, 同时也维持胚胎的正常代谢及发育, 从红珠期开始, 胚胎发育已形成幼体雏形, 胚胎自身可产生的足够量的章鱼胺以抵御病原生物的侵袭, 有无雌蛸护卵均可正常发育。不同发育时期OsOARβ2R表达水平的变化, 将为今后无雌蛸护卵的受精卵孵化技术的研究提供一个基础数据。
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